朱晓娟，赵磊，徐瑞涛，王道安，陈烁，金佳玉，张健*
（天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室，天津300457）
多重PCR法同时检测黄酒酒曲中多种生物胺产生菌
该研究建立了检测多种生物胺产生菌的多重聚合酶链反应（PCR）方法，首先检测了已报道的针对酪胺、腐胺产生菌和革兰氏阴性组胺产生菌的多对引物的特异性，针对革兰氏阴性菌的组氨酸脱羧酶基因的引物特异性差，重新设计了该引物，在此基础上，建立了可同时检测酪胺、腐胺和组胺产生菌的多重PCR方法，并优化了多重PCR反应条件为退火温度50℃，Mg2+浓度1.0mmol/L，引物浓度配比为Tdc-F/R0.2μmol/L，Hdc1/20.4μmol/L和Odc3/40.4μmol/L。该方法特异性强，对酪胺、腐胺和组胺产生菌的灵敏度分别为1.2ng/μL、1.5ng/μL和1.5ng/μL，可用于黄酒酒曲中生物胺产生菌的快速检测。
多重聚合酶链反应；检测；黄酒酒曲；生物胺产生菌
1.1材料与试剂
1.1.1菌株
12株生物胺产生菌株，3株不产生物胺的菌株：筛选自黄酒酒曲，为天津科技大学生化过程与技术实验室保存菌株，其编号、革兰氏染色结果和产生物胺种类详见表1。
表1实验所用菌株名称及性质Table1Nameandnatureofexperimentalstrains
1.1.2主要试剂
100bpladderMarker、DL5kbpMarker、rTaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、10×PCRbuffer（Mg2+free）、10×PCRbuffer（Mg2+plus）、细菌DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒：大连宝生物有限公司。
1.1.3培养基
胰蛋白胨大豆肉汤（trypticsoybroth，TSB）培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，葡萄糖2.5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，调节pH为7.3～7.5，121℃高压灭菌15min。
1.2仪器与设备
5334PCR扩增仪、微量移液器、5418R离心机：德国Eppendorf公司；DU640核酸蛋白分析仪：美国Backman公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一生物科技公司；ChampGel5000凝胶成像仪：北京赛智创业科技有限公司；UV-1800PC分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1模板DNA的制备及质量测定
将-80℃冻存的菌株接于TSB液体培养基上，37℃活化12h，于相应固体平板上进行划线分离，37℃培养24h后，挑取单菌落于TSB液体培养基中37℃培养10h左右。分别测量菌体的OD600nm值（革兰氏阳性细菌的OD600nm＜1.0，革兰氏阴性细菌的OD600nm＞1.0时，符合基因组试剂盒的要求），按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明制备模板DNA。并利用核酸蛋白分析仪测量DNA的浓度。将制备好的模板DNA进行分装，-20℃冻存。
1.3.2引物设计
组氨酸脱羧酶可使组氨酸脱羧形成组胺，酪氨酸脱羧酶可使酪氨酸脱羧形成酪胺，而鸟氨酸脱羧酶催化鸟氨酸脱羧形成腐胺。组氨酸脱羧酶包括两种类型：源于革兰氏阳性菌的丙酮酰依赖型和源于革兰氏阴性菌的磷酸吡哆醛依赖型。酪氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶通常不按革兰氏染色分类[19]。本研究选取已报道的针对磷酸吡哆醛依赖型组氨酸脱羧酶基因的引物Hdc-2F/Hdc-2R、KPF2/KPR4、Hdc-f/Hdc-r、106/107、HIS2-F/HIS2-R，针对酪氨酸脱羧酶基因的引物（Tdc-F/R）和针对鸟氨酸脱羧酶的引物（Odc3/4）来验证引物的特异性。根据美国国家生物技术信息中心（nationalcenterofbiotechnologyinformation，NCBI）最新收录的源于菌株Enterobactersp.的组氨酸脱羧酶序列及与之高度相似（99%）并且同属磷酸吡哆醛依赖型天冬氨酸转氨酶超家族的源于Enterobactercloacae，Enterobacterasburiae的2,4-二氨基丁酸脱羧酶序列进行比对，利用PrimerPremier5.0软件进行引物设计，合成新的引物组氨酸脱羧酶的引物Hdc1/Hdc2（GGYTNAARCARCCNGARATG/GCRTCNACRTGNACCCADAT）。所有引物均由北京华大基因有限公司合成，序列详细信息见表2。
表2多重PCR引物设计Table2DesignforpremiersofmultiplexPCR
1.3.3单一PCR扩增条件
采用已报道的引物，扩增时的反应体系和条件均参见表2。采用Hdc1/Hdc2引物PCR扩增时的反应体系（25μL）：10×Buffer：2.5μL，rTaq聚合酶0.25μL（5U/μL），dNTPs：2.0μL（各2.5mmol/L），DNA模板1.0μL（10ng/μL），引物1.0μL（初始浓度10μmol/L），其余用双蒸水补足。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取4μLPCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。取50μL扩增体系的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行切胶回收，采用大连宝生物的纯化回收试剂盒回收片段，交给北京华大基因有限公司进行测序。
1.3.4多重PCR条件优化
按照L16（45）正交设计，优化多重PCR的退火温度、Mg2+浓度以及各引物的浓度，其他反应条件和反应体系同1.3.3。因为没有菌株同时产酪胺、腐胺和组胺，所以分别选取菌株Mc4（产组胺和腐胺）和菌株La8（产酪胺）为目标菌，进行正交试验。综合考虑菌株Mc4扩增时组氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶基因片段扩增后的条带的明亮程度，以及菌株La8扩增时酪氨酸脱羧酶基因片段扩增后的条带的明亮程度选择最优的因素水平组合，确定多重PCR的最佳反应体系和条件。
1.3.5多重PCR特异性实验
选取菌株Mc4、La8的DNA进行混合，根据其DNA含量1.0∶0.5（10ng∶5ng）组合，阴性菌株Ma7、Qa1及Qa2做模板。按照1.3.4优化的条件进行扩增，检测3对引物Hdc1/Hdc2、Tdc-F/Tdc-R、Odc3/Odc4的特异性。
1.3.6多重PCR的灵敏度测试
分别将菌株Mc4和La8的DNA按照测定浓度进行10倍比梯度稀释，使两株菌株的DNA质量浓度分别为150ng/μL、15ng/μL、1.5ng/μL、0.15ng/μL和120ng/μL、12ng/μL、1.2ng/μL、0.12ng/μL。分别按照1.3.4优化的条件进行扩增，分析多重PCR对检测酪胺、腐胺和革兰氏阴性组胺产生菌的灵敏度。
1.3.7多重PCR方法对黄酒酒曲筛选菌株的检测应用
按照1.3.4优化好的多重PCR方法对黄酒酒曲中筛选出来的菌株进行多重PCR扩增，验证该方法对黄酒酒曲中生物胺产生菌检测的有效性。
2.1单重PCR检测结果
图1单重PCR扩增产物凝胶电泳图Fig.1GelelectrophoresisofmonoplexPCRamplificationproducts
2.2多重PCR条件优化
由于单重PCR在进行操作时需要逐一加入单对引物和模板，为使操作更加简便，本实验建立了多重PCR的方法。单一PCR分别检测酪胺，腐胺和革兰氏阴性组胺产生菌时，所用的引物具有不同Tm值，则进行PCR时退火温度会有明显不同，各引物与模板结合的偏好性不同，则各引物的终浓度会不同。因此要建立同时检测酪胺，腐胺和革兰氏阴性组胺产生菌的多重PCR方法，必需要对反应体系和退火温度进行优化。本研究采用L16（45）正交设计对3对引物的浓度，退火温度和Mg2+浓度进行优化，结果见表3。由表3可知，6号试验效果较好，即退火温度为50℃，Mg2+浓度为1.0mmol/L，引物浓度配比为：Tdc-F/R0.2μmol/L，Hdc1/20.4μmol/L和Odc3/40.4μmol/L。在最佳的结果下，多重PCR的凝胶电泳图见图2所示，三对引物均能得到较亮的扩增条带，说明该组正交试验结果较好。
表3多重PCR条件优化正交试验设计Table3DesignoforthogonalexperimentsforPCRconditionsoptimization
图2多重PCR扩增产物凝胶电泳图Fig.2GelelectrophoresisofmultiplexPCRamplificationproducts
2.3多重PCR特异性检验
为了进一步对多重PCR的引物进行特异性检验，验证不同引物和模板之间是否会形成错配，将菌株Mc4和La8的DNA模板按照DNA含量1.0∶0.5（10ng∶5ng）比例进行预混作为模板，扩增条件按照2.2优化的结果。多重PCR特异性检验结果见图3。由图3可知，多重PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果表明这三种引物能够很好的扩增生物胺产生菌的氨基酸脱羧酶序列，特异性条带较亮，任意一株阴性对照组都没有出现扩增，没有出现非特异性条带，可得到这三对引物特异性良好。表明建立的多重PCR方法对检测腐胺和酪胺产生菌以及革兰氏阴性组胺产生菌，具有较好的特异性。
图3多重PCR特异性扩增产物凝胶电泳图Fig.3GelelectrophoresisofmultiplexPCRspecificityamplificationproducts
2.4多重PCR灵敏度检验
菌株Mc4和La8的DNA质量浓度分别是150.200ng/μL、120.850ng/μL，将其进行十倍梯度稀释，以该DNA稀释液做模板进行PCR反应，从而确定DNA最低检测限，结果见图4。由图4可知，当模板质量浓度为1.5ng/μL为检测到组胺条带最低浓度，1.5ng/μL为检测到腐胺条带的最低浓度，1.2ng/μL为检测酪胺条带的最低浓度。琼脂糖凝胶电泳表明三种引物，Hdc1/2、Odc3/4、Tdc-F/R引物所对应的各自DNA模板检出限分别为1.5ng/μL、1.5ng/μL及1.2ng/μL。
图4多重PCR灵敏度扩增产物凝胶电泳图Fig.4GelelectrophoresisofmultiplexPCRsensitivityamplificationproducts
2.5多重PCR方法对黄酒酒曲生物胺产生菌株的检测应用
通过筛选出的两株菌建立了酪胺，腐胺和革兰氏阴性组胺产生菌的多重PCR方法，为了进一步验证及应用该方法，按照多重PCR的优化条件，对酒曲中筛选出的在不同培养基富集的全部菌株进行应用，结果见图5。由图5可知，三对引物都能够在对应的位置得到相应的PCR扩增产物，结果表明，建立的多重PCR方法在检测黄酒酒曲中生物胺产生菌时，与这12株菌的HPLC的结果具有一致性。其中菌株Mc4在735bp处和1056bp处有条带，说明该菌株能够产生组胺和腐胺，由图6可知，菌株Mc4发酵液（培养4d）高效液相色谱检测结果中出现组胺和腐胺色谱峰，表明该多重PCR的方法可以用于酒曲中生物胺产生菌的快速检测。
图5多重PCR检测黄酒酒曲生物胺产生菌扩增产物凝胶电泳图Fig.5GelelectrophoresisofmultiplexPCRamplificationproductsofbiogenicamines-producingbacteriainChinesericewineJiuqu
图6生物胺标准品及菌株Mc4产生物胺的高效液相色谱图Fig.6HPLCchromatogramofbiologicalaminestandardandbiogenicamines-producedbystrainMc4
本研究建立了一种可同时检测三种生物胺产生菌的多重PCR的方法。在进行PCR的过程中，选取了文献中报道的两对特异性引物[20-22]。另外根据某些生物胺产生菌的种属，进行了全新的引物设计，得到了一对能够扩增革兰氏阴性组胺产生菌的引物。对多重PCR的过程进行了优化，最后的优化结果为退火温度50℃，Mg2+浓度1.0mmol/L，引物Tdc-F/R浓度0.2μmol/L，Odc3/4浓度0.4μmol/L，Hdc1/2浓度0.4μmol/L，该方法特异性强，对酪胺、腐胺和组胺产生菌的灵敏度分别为1.2ng/μL、1.5ng/μL和1.5ng/μL，该方法可有效应用于黄酒酒曲中生物胺产生菌的检测，对黄酒的安全生产有重要意义。
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Multiplexpolymerasechainreactionforsimultaneousdetectionofbiogenicamines-producingbacteriainChinesericewineJiuqu
ZHUXiaojuan,ZHAOLei,XURuitao,WANGDaoan,CHENShuo,JINJiayu,ZHANGJian*(KeyLaboratoryofIndustrialFermentationMicrobiology,MinistryofEducation,CollegeofBiotechnology,TianjinUniversityofScience＆Technology,Tianjin300457,China)
Amultiplexpolymerasechainreaction(mPCR)methodforthedetectionofbiogenicamines-producingbacteriaestablishedinthisresearch.Firstly,thespecificityofsomereportedprimersagainsttyramine,putrescineandgram-negativehistamine-producingbacteriawasdetected,andthepoorprimer-specificityagainstgram-negativehistamine-producingbacteriawasobserved.Tosolvethisproblem,theprimersforgram-negativehistamineproducingbacteriawereredesigned.AmPCRmethodforsimultaneousdetectionoftyramine,putrescineandhistamine-producingbacteriawasestablished.Afterthat,theannealingtemperaturewas50℃,theconcentrationofMg2+was1.0mmol/LandtheconcentrationratiooftheTdc-F/R,Hdc1/2,Odc3/4primerswere0.2μmol/L,0.4μmol/L,and0.4μmol/L,respectively.Thismethodwasspecificforamplificationofthebiogenicamine-producingbacteria.Thedetectsensitivityoftyramine,putrescineandhistaminewere1.2ng/μl,1.5ng/μl,and1.5ng/μl,respectively.Themethodcanbeappliedintherapiddetectionbiogenicamines-producingbacteriainChinesericewineJiuqu.
multiplexpolymerasechainreaction;detection;ChinesericewineJiuqu;biogenicamines-producingbacteria
TS207.3
0254-5071（2017）10-0036-06
10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.009
2017-07-16
国家自然科学基金资助项目（31471725）；天津科技大学大学生实验室创新基金（1604A103）
朱晓娟（1992-），女，硕士研究生，研究方向为轻工技术与工程。
*通讯作者：张健（1978-），男，副研究员，博士，研究方向为发酵食品安全。