本研究首先利用富集培养、稀释涂布和琼脂平板扩散实验从传统发酵食品中筛选乳酸菌，采用生理生化实验、16SrDNA基因序列同源性分析对菌株进行鉴定。其次，通过排酸实验、过氧化氢排除实验、蛋白酶水解实验明确该乳酸菌所产的主要抑菌物质。最后，通过醇沉水提、SephadexLH-20层析获得细菌素粗提物，并将其应用于大黄鱼整鱼保鲜。每3d取样进行感官评价、pH测定、菌落总数测定、总挥发性盐基氮测定和质构分析，评价其保鲜效果。结果表明，所筛选获得的菌株为植物乳杆菌，命名为MMB-11。植物乳杆菌MMB-11所产细菌素对蛋白酶敏感，具有良好的酸耐受性和热稳定性。将该细菌素应用于大黄鱼保鲜发现，在保藏12d时，MMB-11细菌素处理组、对照组和Nisin处理组菌落总数分别为3.50×104、1.10×105和4.50×104CFU/g，挥发性盐基氮分别为20.91±0.66、31.37±0.21和21.44±0.45mg/100g。因此，相较于Nisin处理组和对照组，MMB-11细菌素粗提液对大黄鱼具有更好的保鲜效果。本研究可为大黄鱼安全无害的生物保鲜剂的开发奠定理论基础。
江苏海洋大学杨杰副教授等针对从传统发酵食品中筛选出产细菌素的植物乳杆菌MMB-11，并将其细菌素粗提液应用于大黄鱼整鱼的保鲜，以期为安全高效的大黄鱼微生物源的生物保鲜剂开发奠定理论基础。
1产抑菌物质乳酸菌的初筛与复筛
在初筛的235株菌中，根据抑菌圈直径的大小，选取编号菌株X8、X9、X14、X15、A16、L73、S49、MMB-11作为复筛的研究对象，结果如表2所示，MMB-11对金黄色葡萄球菌和希瓦氏腐败菌的抑菌圈直径分别为11.70±0.05mm和11.40±0.05mm，与其他菌株相比，其综合抑菌活性最高，因此选择MMB-11作为后续研究菌株。
2植物乳杆菌MMB-11的鉴定2.1乳酸菌的形态特征结果
MMB-11菌落形态如图1所示，MMB-11菌落呈不透明的乳白色，边缘整齐且表面光滑，是典型的乳酸菌的生长特征；菌体经革兰氏染色后显微镜镜检观察，其颜色呈紫色，为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状或弯杆状，有时呈链状，无芽孢和鞭毛。
2.2乳酸菌的生理生化鉴定结果
根据表3的生理生化鉴定结果表明菌株MMB-11发酵葡萄糖不产生气体，明胶液化结果呈阴性，不能水解精氨酸产氨气，可发酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等多种糖，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》，表明该菌株为植物乳杆菌。
2.3菌株MMB-1116SrDNA鉴定结果及系统发育树
使用细菌基因组提取试剂盒提取菌株MMB-11的DNA后，以其为模板进行PCR扩增，回收扩增产物并进行测序，经过同源性比较，发现其与植物乳杆菌的相似度达95%，因此在综合其形态特征观察结果、生理生化试验结果和16SrDNA序列分析的结果基础上，鉴定其为植物乳杆菌（图2），命名为植物乳杆菌MMB-11。
利用MEGA7.0软件构建MMB-11系统发育树，在系统发育树中，菌株MMN-11与植物乳杆菌在同一分支。
3菌株MMB-11产抑菌物质的鉴定
3.1酸的排除
酸排除实验结果如图3，在发酵上清液的pH由4.0到5.5的过程中，其对金黄色葡萄球菌、希瓦氏腐败菌和嗜水气单胞菌的抑菌活性在逐渐变弱，pH为5.5时仍有一定的抑菌活性，而对照组MRS液体培养基在pH5.0时就已经完全没有抑菌活性。说明在发酵上清液中，排除酸的抑菌作用后，存在其他具有抑菌作用的物质。
3.2过氧化氢的排除
使用过氧化氢酶酶解上清液，若上清液中的抑菌物质为H2O2，经过氧化氢酶处理后的上清液抑菌活性将显著降低。实验结果如图4所示，经过氧化氢酶处理后，发酵上清液对于金黄色葡萄球菌、希瓦氏腐败菌、嗜水气单胞菌的抑菌活性并没有显著性变化，说明过氧化氢不是发酵上清液中起抑菌作用的主要物质。
3.3蛋白酶水解实验
细菌素都是蛋白质或者多肽，所以经蛋白酶水解处理发酵上清液后，上清液抑菌活性将显著下降。马国涵等通过蛋白酶水解实验确定了大菱鲆肠道中筛选出的乳酸菌可产细菌素，并分离纯化了植物乳杆菌LP1-4。如图5所示，经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K水解后，与原发酵液相比，其抑菌活性呈现出不同程度地下降，且与对照组相比差异显著（P<0.05），说明MMB-11中的抑菌物质对酶敏感。因此，确定菌株MMB-11的发酵上清液中主要抑菌活性物质为细菌素。
4植物乳杆菌MMB-11细菌素分离纯化及其性质研究
4.1醇沉水提分离细菌素
醇沉水提组分抑菌实验结果如图6所示，处理后上清仍具有显著的抑菌活性，而其沉淀没有抑菌活性，表明醇沉水提法处理可以有效富集抑菌活性物质，去除植物乳杆菌MMB-11发酵液中大量的蛋白、无机盐、多糖等杂质。
4.2SephadexLH-20层析分离纯化细菌素
SephadexLH-20层析后的抑菌结果如表4所示，MMB-11抑菌物质分布在第59管到第81管之间，并且抑菌活性随着洗脱体积的增加呈现先增强后下降的趋势，第71管收集的组分对金黄色葡萄球菌抑菌活性最大，抑菌圈直径为17.75±0.07mm，第69管对希瓦氏腐败菌和嗜水气单胞菌抑菌活性最大，抑菌圈直径分别为18.25±0.05mm和25.80±0.10mm。将有抑菌活性的组分收集合并然后经旋转蒸发仪浓缩，置于4℃冰箱保存备用。
4.3植物乳杆菌MMB-11细菌素粗提液热稳定性研究
从图7可以看出，经过40、60、80、100℃保温处理20min以及121℃处理15min之后，MMB-11的细菌素粗提液对于金黄色葡萄球菌、希瓦氏腐败菌和嗜水气单胞菌的抑菌圈与原来相比略有变化，40、60、80、100、121℃处理之后其抑菌活性变化不显著（P>0.05），表明植物乳杆菌MMB-11的细菌素粗提液具有良好的热稳定性。
4.4植物乳杆菌MMB-11细菌素粗提液pH稳定性研究
从图8可以看出，植物乳杆菌MMB-11的细菌素粗提液的pH调整至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0后，其对于金黄色葡萄球菌的抑菌活性呈现下降趋势，但是仍然具有较强的抑菌活性，实验结果表明，植物乳杆菌MMB-11的细菌素粗提液具有良好的pH稳定性。
5MMB-11细菌素粗提液应用于大黄鱼保鲜
5.1不同处理方式对大黄鱼感官评价的影响
5.2不同处理方式对大黄鱼pH的影响
由于微生物的作用以及鱼本身所含有的水解酶，大黄鱼在贮藏的过程中，其pH先下降后上升，可能由于保藏前期，大黄鱼中的糖原酵解产生乳酸，而到了保藏中期和后期，大黄鱼体内的内源组织蛋白酶释放出来了，加上微生物的作用导致抑菌物质中的蛋白质分解产生氨气和胺类等碱性挥发性物质，使得大黄鱼的pH在后期上升。图10反映了4℃贮藏期间大黄鱼在3种处理方式下pH的变化趋势，与唐智鹏等以及许萍等的研究结果是一致的，表明MMB-11处理组能够很好地延缓鱼肉pH的变化。
5.3不同处理方式大黄鱼菌落总数（TVC）的变化
5.4不同处理方式大黄鱼挥发性盐基氮（TVB-N）的变化
挥发性盐基氮（TVB-N）指动物性食品在腐败过程中，由于酶和细菌的作用，蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，特别是蛋氨酸和酪氨酸，因此营养价值受到很大影响。挥发性盐基氮（TVB-N）指动物性食品在腐败过程中，由于酶和细菌的作用，蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，特别是蛋氨酸和酪氨酸，因此营养价值受到很大影响。
三种不同方式处理的大黄鱼在冷藏期内挥发性盐基氮的变化曲线如图12所示，结果表明三组大黄鱼的挥发性盐基氮总体都呈现上升趋势，这与史国萃等的研究结果一致。空白组的挥发性盐基氮的值始终高于其他两组，且在12d的时候达到了31.37±0.21mg/100g，超出了大黄鱼二级鲜度的标准30mg/100g。在3~9dMMB-11处理组的挥发性盐基氮一直显著低于Nisin处理组（P<0.05），到12d时两者的数值没有显著差异。总的来说，在挥发性盐基氮这一指标上，Nisin处理组和MMB-11处理组的保鲜效果明显优于空白组（P<0.05），且MMB-11组效果在3~9d时可以更好地抑制挥发性盐基氮的增长，这可能是与MMB-11处理组可以更好地延缓大黄鱼pH上升有关。