王洪善1，张晓娟2，李恒1，史劲松1，许正宏2,3
1(江南大学药学院，江苏无锡,214122)2(江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡,214122)3(江南大学生物工程学院，江苏无锡,214122)
摘要该文研究了甘露寡糖(mannan-oligosaccharide,MOS)对高脂饮食(high-fatdiet,HFD)小鼠的益生作用。设置正常饮食(normalchow,NC)、正常饮食灌胃MOS(NC+MOS)、高脂饮食(HFD)及高脂饮食灌胃MOS(HFD+MOS)共4个实验组，MOS灌胃量为每天6g/kg小鼠体重。经过11周实验处死小鼠，通过16s高通量测序技术检测最后1周小鼠粪便中肠道微生物的组成变化，利用LEfSe找出标志微生物，利用PICRUSt对肠道微生物功能组成进行预测，并运用气相色谱检测小鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量。结果显示，MOS能够有效减缓高脂饮食造成的小鼠体重增长；同时改变了高脂及正常饮食小鼠的肠道菌群结构，选择性地调节了一些微生物，增加了Akkermansia,Lactobacillus和Bifidobacterium等益生菌的相对丰度；PICRUSt分析结果显示，MOS能够提高小鼠肠道菌群脂代谢的能力；MOS还提高了正常及高脂饮食小鼠盲肠中乙酸、丙酸、丁酸的含量，同时降低了戊酸的含量。MOS能够促进高脂饮食小鼠减轻体重，调节肠道菌群结构，促进益生菌的增殖，增强肠道菌群脂代谢能力，并增加一些短链脂肪酸含量，对高脂饮食造成的肥胖小鼠具有良好的益生作用。
关键词甘露寡糖；肥胖小鼠；肠道微生物；短链脂肪酸；益生作用
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017193
第一作者：硕士研究生(许正宏教授为通讯作者，E-mail：zhenghxu@jiangnan.edu.cn)。
收稿日期：2018-03-07，改回日期：2018-03-16
引用格式：王洪善，张晓娟，李恒,等.甘露寡糖对高脂饮食小鼠的益生作用[J].食品与发酵工业,2018,44(11):63-58.
WANGHong-shan,ZHANGXiao-juan,LIHeng,etal.Prebioticeffectsofmannan-oligosaccharideonhighfatdietmice[J].FoodandFermentationIndustries,2018,44(11):63-58.
研究表明，肠道微生物与肥胖有着密切的关系，肥胖人群体内有着更高丰度的厚壁菌门微生物及更低丰度的拟杆菌门丰度微生物[4]。肠道菌群已经被证明能够帮助减轻体重，改善胰岛素抵抗等症状。一项研究显示，从瘦体供体到代谢综合征肥胖患者进行的粪便微生物群移植可提高肥胖患者胰岛素敏感性[5]。有关肠道微生物与肥胖关系的认识还在不断发展中，通过调节肠道菌群来干预肥胖已逐渐被人们所接受。
魔芋甘露寡糖(mannan-oligosaccharide,MOS)是通过化学或生物法降解魔芋葡甘需聚糖获得，魔芋葡甘露聚糖是一种从魔芋块茎中提取的多糖。它由D-甘露糖和D-葡萄糖以1.6∶1的摩尔比且大部分通过β-1,4键连接而成[6]。研究表明，MOS具有多种生理活性，能够改善肠道结构和功能的完整性，调节肠道微生物群落，并提高免疫活性[7-9]。因此，作为一种天然的健康食品，MOS被广泛用作饲料和食品添加剂。此外，MOS具有降低血脂浓度，抑制人体内脂质的吸收功能[10]，MOS还具有潜在的减肥功效。已有关于MOS对宿主肠道微生物影响的研究多局限于MOS作为饲料添加剂的功效，对肥胖宿主肠道微生物的研究较少，且研究方法较为原始，并不能很好地揭示肠道微生物的变化。
该文研究了MOS对高脂饮食小鼠体重及肠道中产酸的影响，并利用16s高通量测序技术，研究了不同饮食小鼠肠道微生物的变化，初步探讨了MOS对高脂饮食小鼠的益生效果。
甘露寡糖：成都永安缘和生物科技有限公司；24只雄性SPF级C57BL/6J小鼠：南京大学-南京生物医药研究院[许可证号：SCXK(苏)2015-0001]；60%高脂饲料及10%低脂对照饲料：南通特洛菲饲料科技有限公司；小鼠粪便DNA提取试剂盒：德国QIAGEN公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸分析标准品：上海麦克林生化科技有限公司。
NanoDrop2000超微量分光光度计，美国ThermoFisherScientific公司；MiSeq高通量测序系统，美国Illumina公司；气相色谱仪，日本岛津公司。
1.3.1动物实验
1.3.2盲肠内容物短链脂肪酸检测
盲肠内容物称重后溶于1mL去离子水中，充分振荡混匀，12000r/min离心5min，取上清，经0.22μm水相滤膜过滤，用于气相色谱检测。配制不同浓度梯度相应短链脂肪酸标品用于标准曲线的制作。
气相色谱分析利用岛津(Shimadzu)GC-2010气相色谱仪进行。色谱柱为DB-WAX毛细管柱(30mol/L，ID0.32mm×0.5μm)，进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；程序升温：初始温度50℃，保持3min,随后以6℃/min的速率升温到120℃，以10℃/min的速率升温到220℃，保持5min；载气(N2)流量：3mL/min；燃气(H2)流量：47mL/min；助燃气(Air)流量：400mL/min；分流比：1∶3；进样量：10μL。
1.3.3小鼠粪便DNA提取
最后1周小鼠粪便微生物DNA利用QIAampDNAStoolMiniKit提取，操作按照试剂盒说明书进行。DNA提取后利用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA浓度及质量。
1.3.4小鼠肠道微生物16s高通量测序
利用IlluminaMiSeq高通量测序平台对提取的最后1周小鼠粪便微生物DNA进行16s高通量测序(共23个样本，1个样本被污染)。测序区域为V3～V4区，测序引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)-806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，不同样本在引物5′端加入6bp条码序列用于区分样品。高通量测序实验由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.3.5高通量测序数据分析处理
本文中数据表示为平均值±标准误(means±sem)，超过2组数据的组间显著性差异由单因素方差分析(One-wayANOVA)，并进行Turkey事后检验得出，p<0.05时认为具有显著性差异。显著性差异分析由GraphpadPrism软件(版本7.0)进行。
高脂饮食导致小鼠增加了更多的体重。第11周时，HFD组小鼠体重增长率相比NC组小鼠出现极显著升高(p<0.001)，而高脂饮食灌胃MOS后体重增长率出现显著降低(p<0.05)；NC+MOS组小鼠体重增长率相比于NC组有下降，但没有显著性差异(表1)。
表1不同饮食组小鼠体重及增长率Table1Bodyweightsandweightgainsofdifferentdietgroups
组别0周体重/g11周体重/g增长率/%NC22.00±1.9126.67±2.6521.31±8.36NC+MOS22.45±1.3725.87±1.8715.22±4.13###HFD22.38±1.1835.72±3.2259.34±8.15***HFD+MOS22.77±0.8432.67±2.2743.35±5.67**#
注：**：p<0.01，***：p<0.001，和NC组相比；#：p<0.05，###：p<0.001，和HFD组相比。
这表明甘露寡糖能够减缓高脂饮食造成的体重增长，对正常饮食小鼠控制体重增长也有效果。因此，甘露寡糖可用于食品添加以控制体重的增长。
在确定MOS对高脂饮食小鼠控制体重增长具有明显改善作用后，进一步研究了MOS对高脂饮食小鼠的肠道菌群的调节作用。对实验最后1周时的小鼠粪便微生物进行了16s高通量测序，以研究不同组之间肠道菌群的变化。测序得到质检合格Reads共1552609条，各样本中测序得到最小Reads数为50266条，各样本统一到此Reads数，按照97%相似度进行OTU分类，得到3843个OTU。在此测序深度上，各组样本稀释性曲线趋向于平稳(图1)，而香农曲线则平坦稳定(图2)，由此可知，虽然在进一步测序时仍会出现罕见的新型基因型，但大多数物种已经被检测到。
图1小鼠肠道微生物测序稀释性曲线Fig.1Rarefactioncurvesofgutmicrobiotainmice
图2小鼠肠道微生物测序香农曲线Fig.2Shannondiversitycurvesofgutmicrobiotainmice
对不同饮食组小鼠肠道微生物测序得到的OTU进行主成分分析(PCA)。由PCA分析可以看出，不同饮食组的小鼠肠道菌群样本被明显分开(图3)。PC1(占总方差的44.3%)可将高脂饮食组与正常饮食组样本分开，PC2(占总方差的23.9%)又可以将添加MOS样本与未添加MOS样本分开。PCA分析显示，不同饮食小鼠肠道微生物的整体结构发生了显著的变化，添加MOS后可显著调节小鼠肠道菌群结构，且对高脂饮食小鼠的肠道菌群调节尤为明显。
图3基于OTU丰度矩阵的PCA分析Fig.3PCAscoresplotcalculatedwiththeOTUabundancematrix
图4不同饮食小鼠肠道中差异微生物分析Fig.4Biomarkersofgutmicrobiomeindifferentdietsmice
为了探究MOS对小鼠肠道微生物自身功能的影响，运用PICRUSt对肠道菌群的代谢功能进行了预测(图5)。首先在本研究中，小鼠肠道菌群代谢功能中氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、辅因子及维生素代谢、核酸代谢有较多基因被预测，其次是多糖生物合成及代谢和脂代谢等。同正常饮食小鼠相比，高脂饮食小鼠肠道菌群各种代谢预测基因占总代谢预测基因百分比相差不大，仅有氨基酸代谢、酶家族、脂代谢外源性化合物生物降解及代谢预测基因丰度略有升高，多糖生物合成及代谢预测基因丰度略有降低。灌胃MOS后，其他次级代谢物生物合成、多糖生物合成、代谢及脂代谢等预测基因占比升高。
图5不同饮食小鼠肠道菌群代谢分类功能预测Fig.5Functionalpredictionofmetabolismofgutmicrobiotaindifferentdietsmice
图6不同饮食小鼠肠道菌群脂代谢途径功能预测Fig.6Functionalpredictionoflipidmetabolismofgutmicrobiotaindifferentdietsmice
图7小鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量Fig.7ConcentrationsofSCFAsincecalcontent注：*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001
参考文献
[1]GIBSONGR,HUTKINSR,SANDERSME,etal.Expertconsensusdocument:Theinternationalscientificassociationforprobioticsandprebiotics(ISAPP)consensusstatementonthedefinitionandscopeofprebiotics[J].NatRevGastroenterolHepatol,2017,14(8):491-502.
[2]ROBERFROIDM,GIBSONGR,HOYLESL,etal.Prebioticeffects:metabolicandhealthbenefits[J].BritishJournalofNutrition,2010,104(S2):S1-S63.
[3]SEGANFREDOFB,BLUMECA,MOEHLECKEM,etal.Weight‐lossinterventionsandgutmicrobiotachangesinoverweightandobesepatients:asystematicreview[J].ObesityReviews,2017,18(8):832-851.
[4]LEYRE,TUMBAUGHPJ,KLEINS,etal.Microbialecology:humangutmicrobesassociatedwithobesity[J].Nature,2006,444(7122):1022-1023.
[5]KOOTTERS,LEVINE,SALOJRVAJ,etal.Improvementofinsulinsensitivityafterleandonorfecesinmetabolicsyndromeisdrivenbybaselineintestinalmicrobiotacomposition[J].CellMetabolism,2017,26(4):611-619.
[6]YUIT,OGAWAK,SARKOA.MolecularandcrystalstructureofkonjacglucomannaninthemannanⅡpolymorphicform[J].CarbohydrateResearch,1992,229(1):41-55.
[7]IJIPA,SAKIAA,TIVEYDR.Intestinalstructureandfunctionofbroilerchickensondietssupplementedwithamannanoligosaccharide[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2001,81(12):1186-1192.
[8]BAURHOOB,PHILLIPL,RUIZ-FERIACA.Effectsofpurifiedligninandmannanoligosaccharidesonintestinalintegrityandmicrobialpopulationsinthececaandlitterofbroilerchickens[J].PoultryScience,2007,86(6):1070-1078.
[9]葛淑芝,刘印华,安玉萍,等.甘露寡糖对小鼠免疫功能的影响[J].中国医药,2014,9(3):430-432.
[10]KUMAOT,FUJIIS,OZAKIK,etal.Effectofdietswithmannooligosaccharidesfromcoffeemannanonfatinbloodseruminhealthyvolunteers[J].JournalofFoodEngineeringJapan,2005,6(4):301-304.
[11]SEGATAN,IZARDJ,WALDRONL,etal.Metagenomicbiomarkerdiscoveryandexplanation[J].GenomeBiology,2011,12(6):R60-R78.
[12]LANGILLEMGI,ZANEVELDJ,CAPORASOJG,etal.Predictivefunctionalprofilingofmicrobialcommunitiesusing16SrRNAmarkergenesequences[J].NatureBiotechnology,2013,31(9):814-821.
[13]DELZENNENM,NEYRINCKAM,BCKHEDF,etal.Targetinggutmicrobiotainobesity:effectsofprebioticsandprobiotics[J].NatureReviewsEndocrinology,2011,7(11):639-646.
[14]DAHIYADK,PUNIYAM,SHANDILYAUK,etal.Gutmicrobiotamodulationanditsrelationshipwithobesityusingprebioticfibersandprobiotics:areview[J].FrontiersinMicrobiology,2017,8:563-580.
[15]DAOMC,EVERARDA,ARONWISNEWSKYJ,etal.Akkermansiamuciniphilaandimprovedmetabolichealthduringadietaryinterventioninobesity:relationshipwithgutmicrobiomerichnessandecology[J].Gut,2016,65(3):426-436.
[16]WONGJMW,DESOUZAR,KENDALLCWC,etal.Colonichealth:fermentationandshortchainfattyacids[J].JournalofClinicalGastroenterology,2006,40(3):235-243.
[17]CANFORAEE,JOCKENJW,BLAAKEE.Short-chainfattyacidsincontrolofbodyweightandinsulinsensitivity[J].NatureReviewsEndocrinology,2015,11(10):577-624.
[18]DENBESTENG,BLEEKERA,GERDINGA,etal.Short-chainfattyacidsprotectagainsthigh-fatdiet-inducedobesityviaaPPARγ-dependentswitchfromlipogenesistofatoxidation[J].Diabetes,2015,64(7):2398-2408.
WANGHong-shan1,ZHANGXiao-juan2,LIHeng1,SHIJin-song1,XUZheng-hong2,3*
1(SchoolofPharmaceuticalScience,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)2(NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)3(SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Keywordsmannan-oligosaccharide；high-fatdietmice；gutmicrobiota；short-chainfattyacids；prebioticeffects