王洋，王竞儒，罗云龙，白东清*，季延滨，余政豪，淡清华，于波
(天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384)
摘要:为探讨乳酸链球菌素(nisin)与乳酸(lacticacid)同时存在是否会对维氏气单胞菌Aeromonasveronii产生抑制和损伤作用，试验设对照组(蒸馏水)、4mmol/LL-乳酸、0.05g/Lnisin、4mmol/LL-乳酸+nisin(0.005、0.01、0.05g/L)4个处理组,将活化好的维氏气单胞菌接种于LB液体培养基，配制成活菌数为1×107CFU/mL，经过各组处理后，通过比浊法和生长曲线参数分析，以及活菌计数、膜电动势变化检测和扫描电镜观察等，分析了乳酸链球菌素与乳酸对维氏气单胞菌的抑制与致死作用，运动性及生物被膜形成能力的影响，以及细胞结构和膜功能的损伤。结果表明：4mmol/LL-乳酸和0.01、0.05g/Lnisin对维氏气单胞菌有协同抑制，可显著延长其生长延滞期并降低最大比生长速率；4mmol/LL-乳酸和0.05g/Lnisin对维氏气单胞菌有显著协同致死作用；nisin和乳酸联用能够有效限制维氏气单胞菌的运动性，抑制其生物被膜的形成；在乳酸造成细胞膜破损的基础上，nisin能在6min内快速降低其跨膜电动势；nisin与乳酸协同处理后，细胞发生严重形变，细胞质膜破损，外膜小泡数量增加。研究表明，nisin和乳酸或二者产生菌的联合使用显著增强了对维氏气单胞菌的抑制作用。
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关键词:维氏气单胞菌；乳酸链球菌素；乳酸；协同抑制；机制
维氏气单胞菌分离自患肠炎病的锦鲤Cyprinuscarpio。
试剂：L-乳酸(以下简称乳酸，记为la)，纯度>90%(西陇化工股份有限公司)；食品级nisin(天津艾玛斯特生物科技有限公司)，推荐使用量为0.03～0.20g/kg；LB培养基(北京陆桥技术股份有限公司)。
仪器：全波长扫描式多功能读数仪VarioskanFlash(ThermoFisherScientific，美国)；全自动生长曲线分析仪BioscreenC(BioscreenCompany，芬兰)；环境扫描电子显微镜Quanta200FEG(FEICompany，荷兰)。
1.2.1nisin与乳酸对指示菌的生长抑制
1)比浊法测定生长抑制效果。将活化好的维氏气单胞菌接种于LB液体培养基，配制成活菌数为1×107CFU/mL。在菌液中分别加入蒸馏水、乳酸或nisin溶液，试验设置对照组、4mmol/L乳酸处理组、0.05g/Lnisin处理组、4mmol/L乳酸+nisin(0.01、0.05g/L)处理组。每组样品取100μL，加入96孔板中，于30℃下培养12h，以酶标仪测定OD600nm值。
2)生长曲线及生长参数。将活化好的维氏气单胞菌接种于LB液体培养基，配制成活菌数为1×107CFU/mL。在菌液中分别加入蒸馏水、乳酸或nisin溶液，分别制成对照组、4mmol/L乳酸处理组、0.05g/Lnisin处理组、4mmol/L乳酸+nisin(0.01、0.05g/L)处理组。每组样品取200μL，加入生长曲线仪专用培养板中，采用全自动生长曲线分析仪，于30℃下连续培养至48h，期间每间隔30min测定一次OD600nm值，绘制生长曲线，以修正的Gomptz模型拟合[19]，计算生长延滞期(lagtime)、比生长速率(μmax)、平台期最大活菌数(OD600nmmax)等生长参数。
1.2.2nisin与乳酸对指示菌的致死作用将活化好的维氏气单胞菌重悬于生理盐水溶液中，配制成活菌数为1×105CFU/mL，在菌液中分别加入蒸馏水、乳酸或nisin溶液，制成对照组、4mmol/L乳酸处理组、0.05g/Lnisin处理组、4mmol/L乳酸+0.05g/Lnisin处理组。定时取样以平板计数法测定活菌数。
1.2.3菌株运动能力测定运动性检测培养基为0.5%NaCl、1%胰蛋白胨、0.25%琼脂，于121℃下灭菌15min后制备平板。平板上分别加入1μL经未处理、4mmol/L乳酸处理、0.05g/Lnisin处理、4mmol/L乳酸+0.05g/Lnisin处理8h的维氏气单胞菌，30℃下培养24h，观察菌落直径[20]。
1.2.4生物被膜检测用无菌生理盐水洗涤对数末期的维氏气单胞菌3次,用LB重悬至1×108CFU/mL。试验设置4组，分别为对照组(蒸馏水)、4mmol/L乳酸处理组、0.05g/Lnisin处理组、4mmol/L乳酸+nisin(0.005g/L、0.01g/L、0.05g/L)处理组。于30℃下培养36h后，孔内加满结晶紫试剂[21]染色30min后，结晶紫附着于生物被膜，弃去多余的结晶紫后，用等体积无水乙醇将附着于生物被膜的结晶紫洗脱，测定OD595nm值(结晶紫的吸光值，吸光值大小反映体系中结晶紫的浓度高低，结晶紫浓度的高低反映生物被膜量的多寡)。
在加入爬片的24孔聚苯乙烯孔板中，分别设置对照组(400μL菌液+100μL生理盐水)、400μL菌液+50μL4mmol/L乳酸+50μL生理盐水、400μL菌液+50μL0.05g/Lnisin+50μL生理盐水、400μL菌液+50μL0.05g/Lnisin+50μL4mmol/L乳酸共4组，于30℃下培养72h后，以无菌HEPES缓冲液清洗去除悬浮菌体。结晶紫染色1.0～1.5min后，置于显微镜下观察并拍照。
1.2.5质子动势和膜电动势维氏气单胞菌(106～107CFU/mL)悬于HEPES缓冲液，以葡萄糖能量化[22]。
1)nisin对膜电动势(ΔΨ)消散作用的测定。加入1μmol/L尼日利亚菌素来处理菌体以消除跨膜pH梯度差(ΔpH)，之后加入电动势荧光探针DisC3(5)孵育，分别设置空白对照组(蒸馏水)、4mmol/L乳酸处理组、0.05g/Lnisin处理组、4mmol/L乳酸+0.05g/Lnisin处理组，并以多功能酶标仪连续测定荧光强度的变化[23]。
2)nisin对ΔpH影响的测定。向能量化菌悬液中加入1μmol/L缬氨霉素以彻底消除ΔΨ，并加入荧光染料BCECF-AM(终浓度为3μmol/L)孵育。4个组别设置同上，使用多功能酶标仪连续记录荧光强度[24]。
1.2.6扫描电镜收集对数末期维氏气单胞菌，以生理盐水溶液重悬，4个组别设置同“1.2.5节”，处理12h后取样，固定处理样品[25]，利用环境扫描电子显微镜来采集细胞表面结构的图像。
试验数据采用SPSS13.0软件进行方差分析，用Duncan法进行多重比较，显著性水平设为0.05。利用Excel软件计算各组数据的标准偏差。
从图1A可见：对照组维氏气单胞菌的OD600nm值为1.37，nisin单独处理组为1.31，与对照组相比，单独添加nisin未影响OD600nm值(P>0.05);乳酸处理组OD600nm(0.90)显著降低(P<0.05)；在加入乳酸的基础上添加0.01g/Lnisin，维氏气单胞菌的OD600nm值显著下降至0.38，且随着nisin质量浓度的升高，下降幅度更大，当nisin质量浓度达到0.05g/L时，OD600nm显著低于所有处理组(P<0.05)。
从图1B可见：在培养的48h内，对照组菌体快速增长，OD600nm值迅速升高，很快进入对数期和平台期，nisin单独处理组的生长趋势与对照组类似；乳酸的存在明显干扰了菌体的生长，且在乳酸基础上进一步添加nisin对维氏气单胞菌的生长均表现出显著地抑制，并且抑制程度随着细菌素nisin质量浓度的增加而提高。
标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。Themeanswithdifferentlettersaresignificantdifferencesindifferentgroupsatthe0.05probabilitylevel,andthemeanswiththesameletterarenotsignificantdifferences,etsequentia.图1nisin与乳酸对维氏气单胞菌的协同抑制Fig.1SynergisticinhibitionofnisinandlacticacidagainstAeromonasveronii
从表1可见：在乳酸和细菌素协同处理下，维氏气单胞菌的延滞期延长，μmax值和OD600nmmax值有所下降，且随着细菌素质量浓度升高，各参数也显著变化(P<0.05)，证明nisin和乳酸对革兰氏阴性病原菌有联用抑制效果；在4mmol/L乳酸处理下，0.05g/Lnisin的添加可将菌株延滞期从5.12h延长至23.51h，OD600nmmax值由1.39降低至1.20，μmax值从对照的0.36降低至0.11。
从图2可见：与对照组相比，在处理的36h内，nisin单独处理组对维氏气单胞菌并无致死作用，4mmol/L乳酸处理组可造成菌体死亡；4mmol/L乳酸和0.05g/Lnisin协同处理组，与同浓度乳酸或nisin单独处理组相比，活菌数量大大降低，致死效果最为明显，菌体在36h后已被全部杀死，表明二者协同作用发挥的抑菌效果比单独作用更显著。
表1nisin及乳酸协同对维氏气单胞菌生长主要参数的影响(乳酸浓度4mmol/L)
Tab.1EffectsofnisinandlacticacidsynergyonmainparametersofgrowthinAeromonasveronii(4mmol/Lla)
nisin质量浓度/(g·L-1)concentrationofnisin生长参数growthparameter延滞期/hlagtime比生长率μmax平台期最高活菌数OD600nmmax05.12a0.36a1.39a0.0112.40a0.23a1.20a0.0523.51b0.11b1.09b
注：同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。
Note:Themeanswithdifferentletterswithinthesamecolumnaresignificantlydifferentinthegroupsatthe0.05probabilitylevel,andthemeanswiththesameletterwithinthesamecolumnarenotsignificantdifferences.
图2乳酸与nisin对维氏气单胞菌的致死作用Fig.2LethaleffectsoflacticacidandnisinonAeromonasveronii
从图3可见：仅nisin组菌落扩散直径与对照组相比，无显著性差异(分别为18.24、17.63mmol/L)(P>0.05)；加入4mmol/L乳酸后的维氏气单胞菌的扩散直径显著减小至14.49mmol/L(P<0.05)，为对照组的79.44%，而nisin+乳酸处理组菌落的扩散直径为对照组的61.79%，这表明乳酸与nisin协同处理能够显著减弱维氏气单胞菌的运动性，其中，病原微生物扩散的直径大，表现了菌体的运动性强，反之即运动性弱。
不同浓度nisin和乳酸协同处理108CFU/mL的维氏气单胞菌，在培养第36h时取样测定，其结果如图4所示。从图4A可见：nisin处理组和乳酸单独处理组的OD595nm值与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，这表明单独的nisin或者乳酸处理无法减少维氏气单胞菌生物被膜的生成；而乳酸+nisin的联用处理组与对照组相比，其生物被膜的生成量明显降低，且降低幅度随nisin含量的增加而提高，其中,4mmol/L乳酸+0.05g/Lnisin处理组被膜生成量仅为对照组的27.43%。图4B直接显示了乳酸和nisin对维氏气单胞菌生物被膜结构的影响，乳酸和nisin协同处理显著降低了爬片上维氏气单胞菌的数量，说明协同处理抑制了菌体黏附。
膜电动势的大小由荧光探针DiSC3(5)的荧光强度反映。DiSC3(5)能够聚集在超极化的细胞膜表面，而进入胞内后荧光消失。荧光值减小即细胞膜ΔΨ上升，反之则消散。从图5A可见,乳酸处理组菌体反映ΔΨ的初始荧光值(4h内)较对照组高，这一现象表明，经乳酸处理后的病原体细胞膜电动势降低，而且革兰氏阴性菌的荧光值此后持续降低也证明了病原微生物在反应过程中ΔΨ不断升高。与对照组及乳酸处理组相比，乳酸+0.05g/Lnisin处理时，维氏气单胞菌的最初荧光值较高，证明细胞膜在一刹那产生极化，荧光值此后持续增加，这表明细胞膜电动势在不断消散。由此推测，细菌素能够对经过乳酸处理的革兰氏阴性菌产生抑制作用，nisin会导致菌体ΔΨ消散；而nisin质量浓度越高，形成的孔洞也越多，其离子泄漏速率也越快，即膜电动势的消散速度越快。
从图5B可见：未经乳酸处理的维氏气单胞菌反映ΔpH的荧光值不断增加，说明菌体的膜质子动势在这一过程中不断上升；而经单独乳酸处理及在乳酸基础上加入0.05g/Lnisin后，菌体的初始荧光值均与对照组较低，这一现象表明细胞膜在一瞬间产生了极化。此后，不断降低的荧光值表明膜ΔpH持续消散，这一现象证明细菌素能够损伤经乳酸处理的维氏气单胞菌，并使膜质子动势消散；且la+nisin处理组荧光值下降幅度明显，这表明nisin对维氏气单胞菌的抑制可能与其对敏感革兰氏阳性菌的抑制机理类似，在有乳酸的情况下，细菌素能够侵入细胞膜，进而导致离子泄漏，造成质子动势消散。
图3nisin与乳酸处理对维氏气单胞菌运动能力的影响Fig.3EffectsofnisinandlacticacidtreatmentonthemotilityofAeromonasveronii
A为不同处理组96孔板中生物被膜的量；B为不同处理组维氏气单胞菌在细胞爬片上形成的生物被膜形态。A,concentrationofbiofilmformationin96-wellplatewhenAeromonasveroniicellsaretreatedwithL-lacticwithorwithoutnisin;B,biofilmformationinroundcoverslipwhenA.veroniicellsaretreatedwithL-lacticacidwithorwithoutnisin.图4乳酸和nisin协同处理后维氏气单胞菌生物被膜的形成Fig.4BiofilmformationofAeromonasveroniiexposedtolacticacidandnisin
图5nisin与乳酸对维氏气单胞菌膜电动势的影响Fig.5EffectsofnisinandlacticacidonelectrodynamicpotentialofAeromonasveroniimembrane
图6为环境扫描电子显微镜拍摄的维氏气单胞菌表面形态特征，维氏气单胞菌在LB培养基中呈现两端钝圆的杆状，菌体表面光滑饱满。乳酸处理组和协同处理组的菌体表面有明显缺失。其中，4mmol/L乳酸环境培养的维氏气单胞菌表面破损，发生严重形变，菌体的大小不均一(白色实线箭头)，这一现象验证了乳酸通过破坏细胞壁，增进细菌素效力的假设；乳酸与nisin协同处理的维氏气单胞菌与对照组相比发生明显改变，菌体出现严重变形(黑色虚线箭头)，菌体表面可见较多孔洞(黑色实线箭头)和裂解菌体碎片(白色虚线箭头)。试验结果表明，乳酸与nisin可以改变维氏气单胞菌的菌体形态。
白色箭头为菌体形变；黑色箭头为菌体表面孔洞；白色虚线箭头为菌体裂解碎片；黑色虚线箭头为菌体严重形变。Whitenarrow,deformationofcells;blacknarrow,holeofcells;whitedashedline,fragmentofcells;blackdashedlinearrows,severedeformationofcells.图6nisin和乳酸对维氏气单胞菌细胞表面结构影响的扫描电镜图Fig.6Scanningelectronmicroscopy(SEM)showingtheeffectsofnisinandlacticacidoncellsurfacestructureofAeromonasveronii
1)本研究中证明了乳酸和细菌素nisin对革兰氏阴性病原菌有协同抑制和致死作用。
2)nisin和乳酸联用能够有效限制维氏气单胞菌的运动性，抑制其生物被膜产生。
3)对于被乳酸破坏外膜的维氏气单胞菌，nisin能够显著增加其膜通透性，并降低其膜电动势和pH梯度差，这与nisin作用于敏感革兰氏阳性菌的机制类似。
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WANGYang,WANGJingru,LUOYunlong,BAIDongqing*,JIYanbin,YUZhenghao,DANQinghua,YUBo
(CollegeofFisheries,TianjinKeyLaboratoryofAqua-ecologyandAquaculture,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)
Keywords：Aeromonasveronii;nisin;lacticacid;synergisticinhibition；mechanism
收稿日期：2019-11-18
基金项目：国家自然科学基金(31702360)；国家级大学生创新创业训练计划项目(201910061016)；天津市水产产业技术体系创新团队尾水处理岗位专家项目(ITTFRS2018048)、淡水鱼营养岗位专家项目(ITTFRS2017003)、加工岗位专家项目(ITTFRS2017020)、海水鱼岗位专家项目(ITTFRS2017004)
作者简介：王洋(1986—)，女，博士，讲师。E-mail:474221161@qq.com
通信作者：白东清(1970—)，女，博士，教授。E-mail：baidongqing@tjau.edu.cn