本发明涉及食品或保健品领域，更具体地，本发明涉及一种利用益生菌发酵制备果蔬或谷物或药食同源酵素保健食品的方法。
背景技术：
酵素类保健食品是基于新鲜水果和蔬菜等天然食用原料，利用微生物的发酵作用，大量产生和积累所需的代谢产物，最终获得具有特殊营养和保健功能的食用产品。
酵素在国外已十分风靡。在日本和我国台湾地区，酵素类食品作为一种功能食品十分受欢迎。据不完全统计，仅在日本，现有品牌就有几百种，每年有超过2000万人食用，市场反应非常好。台湾酵素类保健食品有40多年生产历史，有百余种产品上市销售。在亚洲其他地区如韩国、马来西亚、印度尼西亚等地也非常畅销。近期，在欧洲与美国、加拿大等地，酵素类保健食品也逐渐风靡。目前国内市场销售的酵素类食品多数为国外进口。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种果蔬或谷物或药食同源酵素保健食品及其制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种制备果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液的方法，所述方法包括：以果蔬或谷物或药食同源类食材提取物为发酵底物，以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌作为发酵菌种进行发酵，获得果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液。
在一个优选例中，所述的果蔬包括(但不限于)：木瓜、菠萝、苹果、梨、橙、葡萄、西瓜、龙眼、火龙果、樱桃、猕猴桃、草莓、柠檬、柚子、水蜜桃、橘子、蓝莓、香蕉、荔枝、石榴、无花果、金桔、芦柑、香瓜、哈密瓜、杏、桑椹、枇杷、梅子、杨梅、芒果、椰子汁、山竹、橄榄、胡萝卜、黄瓜、甘蓝、西红柿、蘑菇、海带、木耳、冬瓜、山药、秋葵、芦笋等；或
所述的谷物包括(但不限于)：燕麦、青稞、小麦、大麦、黑米、紫米、绿豆、红豆、大豆、薏米、玉米等；或
所述的药食同源食材包括(但不限于)：红枣、枸杞、桂圆、百合、莲子、蜂蜜、山楂、沙棘、茯苓、芡实、金银花、紫苏、人参、玫瑰花等。
在另一优选例中，所述的果蔬或谷物或药食同源类食材提取物是果蔬或谷物或药食同源类食材(所述的果蔬包括果蔬干或鲜果蔬肉)与水混合匀浆，用纤维素酶和果胶酶酶解后的产物；匀浆后经过或不经过酶水解；或所述的果蔬提取物是果蔬榨汁获得的液态产物或果蔬破碎后与水混合匀浆的产物。
在另一优选例中，所述的酶是分解纤维素或分解果胶质的酶；较佳地为纤维素酶和/或果胶酶；或所述的酶是促进淀粉水解的酶；较佳地为液化酶和/或糖化酶。
在另一优选例中，所述的纤维素酶和果胶酶的比例为1:2～2:1(酶活性比)。
在另一优选例中，所述的谷物与水混合匀浆时，料水比(质量比)为1:5～15；较佳地为1:8～12。
在另一优选例中，在酶解后，还包括过滤的过程；较佳地，以200目筛网进行过滤，获取滤液。
在另一优选例中，所述的果蔬或谷物或药食同源类食材提取物在经过杀菌后用作发酵底物。
在另一优选例中，所述的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌(按照接种量)以(1～5)∶(1～5)∶(1～5)∶(1～5)；较佳地以(1～3)∶(1～3)∶(1～3)∶(1～3)的比例进行混合，用于发酵；较佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)、(2±0.2)∶(2±0.2)∶(1±0.1)∶(1±0.1)或(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.3)的比例进行混合，用于发酵；较佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)进行混合。
在另一优选例中，发酵菌种的接种量为4-12％；较佳地为8-10％。
在另一优选例中，发酵底物中可溶性固形物含量8-15％；较佳地8-11％。
在另一优选例中，发酵后，进行离心(较佳地为低温离心)和膜过滤除菌。
在本发明的另一方面，提供一种果蔬或谷物或药食同源类食材酵素发酵原液，所述的果蔬或谷物或药食同源类食材酵素发酵原液由所述的方法制备获得。
在本发明的另一方面，提供所述的果蔬或谷物或药食同源类食材酵素发酵原液的用途，用于制备果蔬或谷物或药食同源酵素。
在本发明的另一方面，提供一种制备果蔬或谷物或药食同源酵素的方法，所述方法包括利用所述的果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液制备果蔬或谷物或药食同源酵素。
在一个优选例中，所述方法还包括：还添加益生元、维生素和矿物质。
在另一优选例中，所述的益生元包括：低聚异麦芽糖和/或低聚木糖等。
在另一优选例中，所述的维生素包括：维生素B6、维生素B12、叶酸、肌醇。
在另一优选例中，所述的矿物质包括：L-抗坏血酸钾、乳酸钙。
在本发明的另一方面，提供一种果蔬或谷物或药食同源类酵素或其加工制剂，其中包含所述的果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液；较佳地，所述的果蔬或谷物或药食同源酵素是由所述的方法制备获得的；较佳地，所述的酵素中还包括：益生元、维生素和矿物质。
在一个优选例中，所述的益生元、维生素和矿物质包括如下：
在另一优选例中，所述的果蔬或谷物或药食同源酵素的加工制剂包括(但不限于)：冻干粉剂，浓缩液，颗粒剂，胶囊剂，口服液，片剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、桂圆酵素发酵原液的制备流程示意图。
图2、桂圆酵素成品的加工流程示意图。
图3、葡萄糖标准曲线。
图4、DNS葡萄糖标准曲线。
图5、甘露醇标准曲线。
图6、接种量对残糖量的影响。
图7、接种量对胞外多糖的影响。
图8、接种量对甘露醇的影响。
图9、接种量对SOD影响。
图10、底物浓度对残糖量的影响。
图11、底物浓度对胞外多糖的影响。
图12、底物浓度对甘露醇的影响。
图17、桂圆酵素DPPH自由基清除能力。
图18、桂圆酵素羟基自由基清除能力。
图19、桂圆酵素超氧阴离子自由基清除能力。
图20、红枣酵素原液制备工艺流程图。
图21、红枣酵素保健食品制备工艺流程图。
图22、木瓜酵素原液制备工艺流程图。
图23、木瓜酵素保健食品的制备工艺流程图。
图24、混合果蔬酵素制备工艺流程图。
图25、混合果蔬酵素粉保健食品制备工艺流程图。
图26、燕麦酵素原液制备工艺流程图。
图27、燕麦酵素制备工艺流程图。
图28、青稞酵素制备工艺流程图。
图29、青稞酵素保健食品制备工艺流程图。
图30、保加利亚乳杆菌生长曲线。
图31、嗜热链球菌生长曲线。
图32、嗜酸乳杆菌生长曲线。
图33、青春双歧杆菌生长曲线。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，筛选到合适的发酵菌种，以果蔬或谷物或药食同源类食材为发酵原材料，优化了发酵工艺，获得了果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液，经后续加工获得果蔬或谷物或药食同源酵素产品。该果蔬或谷物或药食同源酵素富含发酵过程中累积的功效成分胞外多糖、甘露醇和SOD，是一种理想的保健食品。
术语
如本文所用，所述的“果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液”是指以果蔬或谷物或药食同源类食材提取物为发酵底物，利用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌四种菌株的混合菌株进行发酵，获得的发酵产物。其也被简称为“发酵产物”。
如本文所用，所述的“果蔬或谷物或药食同源酵素”是指将果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液进行调配、除菌等处理后获得的成品，其可作为保健品或食品。
如本文所用，所述的“药食同源类食材”是指具有有益健康的功效且也常被作为食品的一类食材。
生产工艺
作为本发明的优选方式，所述的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌以(1～5)∶(1～5)∶(1～5)∶(1～5)；较佳地以(1～3)∶(1～3)∶(1～3)∶(1～3)的比例进行混合，用于发酵；较佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)、(2±0.2)∶(2±0.2)∶(1±0.1)∶(1±0.1)或(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.3)的比例进行混合，用于发酵；较佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)进行混合。在上述配比下混合用于发酵，可在发酵产物中获得较多的胞外多糖、甘露醇和SOD等有益健康的营养物质。
关于混合菌株的初始接种量，本发明研究后发现，采用较大的接种量能快速合成产物，但如果接种量过大，也可能使菌种生长过快、营养物质大量消耗，而出现菌体早衰，发酵液黏度增加，发酵后劲不足，从而影响乳酸产量及功效成分的得率。如果接种量过少，菌体增长缓慢，会延长发酵周期，不利于菌株适应酶解液高产。因此，作为本发明的优选方式，所述的发酵菌种的接种量为4-12％；较佳地为8-10％。
根据原材料的不同，需进行适当的处理来获得发酵底物，例如对于水份含量充分且营养成分能被保留在榨汁后的液体中的果蔬，可以采用压榨的方法获得发酵底物；对于淀粉含量丰富的谷物类，则需要加以液化或淀粉酶解。作为本发明的优选方式，发酵底物中可溶性固形物含量(即发酵底物浓度)8-11％。在该范围内，残糖量与固形物含量比值较低，说明乳酸菌发酵快，对碳源利用率高，胞外多糖和甘露醇得率相对较高。
本发明优化的工艺可保证产品的加工稳定性，同时大大缩短了发酵周期，显著提高有效成分提取率。
在获得了果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液后，可将之进行调配、除菌，来制备可食用的果蔬或谷物或药食同源酵素。
作为本发明的优选方式，在发酵后，通过离心、较佳地为低温离心去除固形物后，再通过膜过滤的方法进行除菌。采用该工艺可有效地实现除菌，并且更完全地保留有效成分的活性。本发明首次将膜过滤除菌技术应用于酵素产品加工工艺中，替代传统加热杀菌方法，有效降低因高温对产品营养成分产生的破坏作用，提高产品营养价值和有效成分利用率。
作为本发明的优选方式，在制备果蔬或谷物或药食同源酵素时，除了果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液以外，根据需要，还可在其中添加益生元(包括：低聚异麦芽糖和/或低聚木糖等)和维生素，从而使得所述果蔬或谷物或药食同源酵素具备均衡有效的营养物质，有益于身体健康。添加的益生元、维生素等有益物质的种类可以根据需要而定，这在本领域技术人员了解的范围内。
果蔬或谷物或药食同源酵素产品
本发明还提供了应用所述的制备果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液的方法制备获得的果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液，以及由该果蔬或谷物或药食同源酵素发酵原液经加工获得的可食用(或服用)的果蔬或谷物或药食同源酵素。所述的果蔬或谷物或药食同源酵素的加工制剂包括但不限于冻干粉剂，浓缩液，颗粒剂，胶囊剂，口服液，片剂。
本发明的果蔬或谷物或药食同源酵素可被制备成食品、保健品或药品。
本发明的果蔬或谷物或药食同源酵素当用于服用时，一般每天服用量50-200ml/人是较为适宜的。当然，根据个人体质或根据保健医生的推荐，还可以对服用量进行适当的调整。
本发明的果蔬或谷物或药食同源酵素是现代生物工程技术与中医药理论相结合的产物。其不但保持了果蔬或谷物或药食同源类食材中原有的植物粗多糖、黄酮等功效成分，还含有有机酸、益生元、维生素等营养物质，具有增强机体免疫力的作用，同时，可以改善肠道菌群平衡，造成不利于病原菌生存的环境，使肠道内有害菌群减少，刺激机体的免疫系统提高其免疫力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
一、试验材料
1、主要原材料
桂圆(桂圆干或鲜桂圆)。
低聚异麦芽糖(益生元)。
2、实验菌种
保加利亚乳杆菌6098、嗜热链球菌6219、嗜酸乳杆菌6085、青春双歧杆菌6176，均由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供，培养温度均为37℃。
3、主要培养基
MRS培养基(CICC指导)：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2.0g，吐温801.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.8。培养基灭菌条件：121℃，15min。
4、主要试剂
葡萄糖，苯酚、浓硫酸，浓盐酸，高碘酸钠，L-鼠李糖，醋酸铵，冰乙酸，乙酰丙酮，3,5-二硝基水杨酸，氢氧化钠，酒石酸钾钠，重蒸酚；亚硫酸钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，邻苯三酚，试剂均为分析纯，国药化学试剂有限公司。
5、主要仪器设备
高速冷冻离心机Thermo；酶标仪Thermo；-80℃超低温冰箱Thermo；HH-6数显恒温水浴锅上海博讯实业有限公司；pH计梅特勒-托利多仪器公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器上海博讯实业有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器、电子分析天平、RE-52A旋转蒸发仪、阿贝折光仪。
二、分析方法
1、可溶性固形物含量Brix测定
阿贝折光仪(手持式)。
2、发酵液pH值测定
精密pH计。
3、还原糖浓度测定
发酵液中残糖浓度的测定采用DNS法：
(1)DNS试剂：6.3g3,5-二硝基水杨酸溶于262ml2mol/L的氢氧化钠溶液中。将此溶液与500ml含有182g酒石酸钾钠的热水混合。向该溶液中再加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，充分搅拌使之溶解，待溶液冷却后，用水稀释到1000ml。储存于棕色瓶中(需在冰箱中放置一周后方可使用)。
(2)还原糖含量的测定采用DNS法
称取大于1g的葡萄糖置于热风干燥箱98℃干燥至恒重，准确称取1.000g葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。分别按表3-1进行配置操作，充分混匀后于沸水浴中加热煮沸5min。流水冲冷却后再分别向各试管中加入蒸馏水4ml，混匀。以管1为空白对照，540nm波长下测各管的吸光度。绘制吸光度-葡萄糖含量曲线。
4、多糖(LP)含量测定
采用苯酚-硫酸法。
(1)标准曲线制作
配制100μg/mL葡萄糖标准液。分别吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL溶液于试管中，用蒸馏水补至2.0mL，顺序加入1mL6％的苯酚和5mL浓硫酸，加入1.0mL的6％苯酚溶液，混合均匀后再加入5.0mL浓硫酸进行反应。反应混合液静置10min后在25～30℃水浴中放置25min。待溶液颜色稳定后，以试剂空白为对照，于490nm下测定吸光值。以吸光值A为纵横坐标，葡萄糖浓度为横坐标，做出苯酚-硫酸法标准曲线。
(2)胞外多糖的测定
桂圆发酵液经200目筛网过滤后，4800rpm离心20min，取上清液5毫升，加入4倍体积的无水乙醇充分振荡后过夜以沉淀多糖。4800r/min转速下离心20min获得淡黄色沉淀。沉淀加入20mL无水乙醇，充分搅拌后再于4800r/min下离心20min。获得的沉淀重复以上操作4-5次，以清除粗多糖沉淀中的单糖杂质，直至离心后所得上清液，采用硫酸-苯酚法测定不显色，以证实无糖类物质的存在。
多糖沉淀用水进行溶解定容至100mL，若浓度大再取出1mL定容至50mL(即稀释50×100倍)，并用硫酸-苯酚法检测多糖含量。按标准曲线制作的实验步骤测定吸光值，再由上述标准曲线方程计算多糖含量。
5、甘露醇的测定
采用比色法。
甘露醇标准曲线的绘制：取25mL比色管分别准确加入50μg·ml-1的甘露醇标准溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0m1，再用蒸馏水分别补充至1ml，然后在每支比色管中加入1ml高碘酸钠溶液，混匀，放10min，后加入2ml0.1％L-鼠李糖溶液，充分混匀后加入Nash试剂4ml，53℃水浴保温15min，取出用水冷却，用10mm光径的比色皿，在412nm波长下测定吸光度，以吸光度对甘露醇浓度作图，即得标准曲线。
样品测定：将终止反应后的发酵液过滤、离心后，取上清液适当稀释后，准确吸取1.0ml，使其中甘露醇的含量在10～50μg·ml-1范围内，然后按测定甘露醇标准曲线的操作测定吸光度。
6、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
按照GB/T5009.171-2003的方法。
7、菌落总数检测：GB4789.2-2010。
8、大肠菌群计数：GB4789.3-2010。
9、金黄色葡萄球菌检测：GB4789.10-2010。
10、益生菌生长曲线测定方法
11、益生菌种子发酵液浓度测定
将益生菌种子发酵液分别作10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10稀释。取10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀释倍数的菌液涂布平板，37℃静置培养24hrs，测量菌落数，计算菌液浓度。
三、实验方法
1、菌种的保藏
采用MRS培养基进行培养，传代三次后，接入MRS固体斜面培养基，采用低温定期移植法放入4℃冰箱中保藏。
2、益生菌种子发酵液的制备
自菌种保藏斜面刮取一环生长良好的菌体，接入装有50ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，37℃静置培养15-24hrs。以10％的接种量，将已活化好的种子培养液接入装有100ml生产培养基的250ml三角瓶中，37℃静置培养15-24hrs后备用。
实施例1、发酵底物的制备及菌株
桂圆酵素发酵原液的制备流程如图1所示。
1、桂圆水溶性提取物的制备
2、杀菌
桂圆水溶性提取物经95℃杀菌15min，作为发酵底物。
3、发酵菌株
以前面制备的发酵底物作为底物，针对大量候选菌株经过大规模筛选，最终确定将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌四种菌株组合用于进行发酵。
发酵规模为：2L摇瓶；发酵温度为37℃，兼性厌氧培养，无需通气。
以胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶、残糖量等作为评价指标，确定最佳发酵工艺条件。胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶这些有益成分越高，则表明获得的发酵产物功效成分含量越高。菌种利用发酵底物中的糖类物质进行发酵，残糖量越低，通常说明糖被利用的越充分，发酵进行的程度越高，发酵产物也越多。
实施例2、标准曲线
1、胞外多糖测定标准曲线
采用苯酚-硫酸法进行多糖含量测定。如前方法制作标准曲线，制作数据如表1。
表1、葡萄糖标准曲线制作数据
2、残糖量标准曲线测定
制作DNS标准曲线，制作数据如表2。
表2、葡萄糖标准液配制
测定不同浓度的葡萄糖标准溶液的吸光度值，以葡萄糖含量X为横坐标，以吸光值Y为纵坐标，作出的葡萄糖溶液标准曲线如图4所示。
3、甘露醇标准曲线
采用比色法进行甘露醇标准曲线的绘制。制作数据如表3。
表3、甘露醇标准曲线制作
实施例3、菌种生长曲线
1、保加利亚乳杆菌生长曲线
从图30的生长曲线可以看出，保加利亚乳杆菌OD值从10h至22hrs呈对数快速增长，这一阶段为对数生长期。24h至38h菌种生长代谢稳定，菌体OD值一直保持在2.8左右，这一阶段为菌种生长的稳定期。40h后菌体OD值开始逐渐下降，为菌体生长的衰亡期。
2、嗜热链球菌生长曲线
从图31的生长曲线可以看出，嗜热链球菌菌体OD值在0h至8h增长缓慢，为菌种生长的延迟期。菌种在10h至22h开始大量繁殖，菌体OD值也呈对数快速增长，这一阶段为对数生长期。22h至38h菌种生长代谢稳定，菌体OD值一直保持在1.0左右，稳定期相对较长。38h后菌体OD值开始出现了波动。
3、嗜酸乳杆菌生长曲线
从图32的生长曲线可以看出，嗜酸乳杆菌菌体OD值在0h至8h增长缓慢，为菌种生长的延迟期。菌种在10h至20h开始大量繁殖，菌体OD值也呈对数快速增长，这一阶段为对数生长期。28h至38h菌种生长代谢稳定，菌体OD值一直保持在2.0左右，这一阶段为菌种生长的稳定期。40h后菌体OD值开始逐渐下降，为菌体生长的衰亡期。
4、青春双歧杆菌生长曲线
如图33所示，青春双歧杆菌生长曲线与其它三种乳酸菌菌种的生长曲线不同，菌种的四个生长周期比较显著。菌体OD值在0h至5h增长缓慢，此时菌种不断适应新环境，因此这一阶段为菌种生长的延迟期。菌种在5h至15h大量繁殖，菌体OD值迅猛增长，为对数生长期。在15h至22h菌种生长代谢稳定，这一阶段为菌种生长的稳定期。22h后菌体OD值开始逐渐下降，为菌体生长的衰亡期。
5、菌种种子液浓度
实施例4、桂圆酵素发酵工艺
1、菌株接种量及接种比例的确定
设置菌种比例(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌＝1:1:1:1)，发酵底物浓度可溶性固形物含量(Brix)＝10％，将益生菌按照接种量2％、4％、6％、8％、10％、12％(均为v/v)接种到发酵底物中，37℃条件下静置发酵，发酵7天后测定发酵液中的胞外多糖、甘露醇、SOD，确定最佳接种量。
结果发现，采用较大的接种量能快速合成产物，但如果接种量过大，也可能使菌种生长过快、营养物质大量消耗，而出现菌体早衰，发酵液黏度增加，发酵后劲不足，从而影响乳酸产量及功效成分的得率。如果接种量过少，菌体增长缓慢，会延长发酵周期，不利于菌株适应酶解液高产。
乳酸菌利用发酵底物中的碳源进行发酵将会使发酵液中的还原糖含量减少。由图6接种量对残糖量的影响可以看出，接种量从6％增加到10％时，残糖量随着接种量增加而减少，接种量为10％时，残糖量最低，接种量增加到12％时，残糖量反而增加。
由图7、图8接种量对胞外多糖和SOD的影响实验结果表明，接种量从4％增加到10％，胞外多糖和SOD随着接种量的增加而增加，接种量在10％时，胞外多糖和SOD均达到最大值，接种量继续增加到12％时，胞外多糖和SOD反而减少。
图9接种量对甘露醇的影响实验结果表明，接种量为8％时，甘露醇达到最大值4.42mg/ml，接种量增加甘露醇含量则减少。以上原因，可能是接种量过大时，使得菌体在前期生长过快、造成发酵液黏度增加，菌体早衰，出现发酵后劲不足，影响了功效成分得率。
因此，发酵试验的较佳接种量为4-12％；并且，确定8-10％的接种量作为益生菌发酵桂圆水溶物质的最适宜接种量。
2、发酵液底物浓度
制备不同浓度的发酵底物(4％、6％、8％、10％、12％(Brix))，将混合菌株(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌＝1:1:1:1)按照10％(v/v)接种量接种到发酵底物中，37℃条件下静置发酵，发酵7天后测定发酵液中的胞外多糖、甘露醇、SOD，确定最佳底物浓度。
如图10，底物浓度对残糖量的影响结果表明，底物浓度在8％至10％之间时，残糖量与固形物含量比值较低，说明乳酸菌发酵快，对碳源利用率高。
由图11和图12可以看出，底物浓度对胞外多糖和甘露醇含量的影响趋势相近，底物浓度为8％时，胞外多糖和甘露醇得率最高。
综合底物浓度对残糖量及胞外多糖和甘露醇的影响，确定可溶性固形物含量8-10％作为适宜的底物浓度；最优选8％。
3、菌种比例
调整发酵底物浓度为10％(Brix)，接种量10％(v/v)，将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌按照不同菌种比例接种到发酵底物中。37℃条件下静置发酵，发酵7天后测定发酵液中的胞外多糖、甘露醇、SOD，确定最佳菌种比例。
结果如表4。
表4、菌种比例对益生菌发酵
由菌种比例对益生菌发酵桂圆水溶提取物实验结果可以看出，当菌种比例(保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌∶嗜酸乳杆菌∶青春双歧杆菌)在1∶1∶1∶2、2∶2∶1∶1、1∶1∶1∶3时，功效成分指标胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶相对较高。其中，以1∶1∶1∶2效果最为理想。
5、桂圆水溶提取物最佳发酵条件的验证实验
通过正交试验对乳酸菌发酵桂圆水溶提取物条件优化后，确定了最佳发酵工艺条件，以确定的最优组合实验条件进行验证实验，考察胞外多糖、甘露醇和SOD，试验组合对照，从而确定最佳发酵工艺条件。
表5、L9(34)正交试验表
表6、益生菌发酵桂圆正交试验结果
6、发酵液过滤、纯化
发酵结束，发酵液经85℃杀菌10min，200目筛网初滤，4800rpm/min离心20min，再经30～50微米过滤，即得桂圆酵素发酵原液。
实施例5、桂圆酵素产品的制备
桂圆酵素产品的制备流程如图2。
1、调配
在酵素原液中添加适当比例的益生元(低聚异麦芽糖或低聚木糖等)、维生素等营养强化剂。添加量如表7所示。
表7
2、均质
将调配后的桂圆酵素产品在65℃，25Mpa条件下进行均质。
3、灌装、杀菌
经65℃杀菌30min后，热灌装即得桂圆酵素成品。
4、桂圆酵素产品标准
感官指标如表8。
表8
功效成分：
多糖含量≥800mg/L；
益生元(低聚异麦芽糖)≥2.8g/100mL。
理化指标：
总固形物含量：≥10％；
pH值：3.6～4.2。
微生物指标：
菌落总数cfu/mL＜100
大肠菌群，MPN/100mL＜3
致病菌未检出。
实施例6、桂圆酵素抗氧化性能研究
1、DPPH自由基清除能力
40μL桂圆酵素原液样品加入到4mL0.1mmol/LDPPH-甲醇溶液中，再加入450L50mmol/LTris-HCl缓冲液(7.4)，25℃下恒温水浴30min。以去离子水为参比溶液。在517nm下测定吸光度。
DPPH自由基清除能力(％)＝[(A0-(A1-A2)/A0]×100％式(1)
式(1)中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度。
桂圆酵素中含有胞外多糖、甘露醇、活性酶类及多酚、维生素等成分，因此具有抗氧化能力。如图17，桂圆酵素DPPH自由基清除能力随着桂圆酵素浓度的增加而增强，当桂圆酵素浓度从可溶性固形物含量Brix2％增加到Brix16％时，DPPH自由基清除能力增加迅速，桂圆酵素浓度达到16％以后，DPPH自由基清除能力增加趋于稳定。原因可能是当桂圆酵素浓度增加到一定程度，桂圆酵素中清除自由基的成分与自由基反应速度减慢。
2、羟基自由基清除能力
135μL桂圆酵素原液样品加入到1.4mL6mmol/LH2O2，然后加入0.6mL20mmol/L水杨酸钠和2mL1.5mmol/L硫酸亚铁，37℃下恒温水浴1h。以去离子水为参比溶液。在562nm下测定吸光度。羟基自由基清除能力计算按照式(1)。
桂圆酵素羟基自由基清除能力如图18所示，当桂圆酵素Brix量从2％增加到14％时，羟基自由基清除能力增加迅速，浓度达到14％以后，羟自由基清除能力增加缓慢，趋于稳定。
3、超氧阴离子自由基清除能力测定
取0.05mol/LpH8.2的Tris·HCI缓冲液4.5ml，置于25℃水浴中预热20min，分别加入1ml不同浓度的桂圆酵素原液和0.4ml25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8mol/LHCl1.0ml终止反应，以Tris-HCI缓冲液作参比，在299nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以1ml试样溶剂代替样品.每个处理均做三个重复。清除率的计算公式：超氧阴离子自由基清除率(％)＝100％(A1-A2)/A1，其中A1为空白的平均吸光度，A2为试样的平均吸光度。
邻苯三酚自氧化法测桂圆酵素超氧阴离子自由基清除能力，实验结果表明，当桂圆酵素浓度在10％至20％范围内，Brix为16％时，超氧阴离子自由基清除能力最强(图19)。
实验结果表明，桂圆酵素原液具有DPPH自由基、羟自由基清除能力，超氧阴离子自由基清除能力，因此具有高的抗氧化性能。
实施例7、红枣酵素及相应保健食品的制备
1、红枣酵素制备工艺
实验原料：红枣、纯净水。
酶制剂：纤维素酶、果胶酶，诺维信生物(中国)投资有限公司提供。
实验菌种：保加利亚乳杆菌6098、嗜热链球菌6219、嗜酸乳杆菌6085、青春双歧杆菌6176，均由中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供，培养温度均为37℃。
主要培养基：同桂圆酵素中所用。
主要试剂：同桂圆酵素中所用。
主要仪器设备：膜过滤时，采用0.4μm滤膜，MasterflexL/SEasy-Load螺动泵(美国Millipore公司)；其它同桂圆酵素中所用。
鉴定分析方法：同桂圆酵素中所用。
红枣酵素原液制备工艺流程图如图20。主要流程如下：
(1)红枣水提液的制备
(2)杀菌
红枣水提液经85℃杀菌15min，作为发酵底物。
(3)益生菌发酵红枣水提液
分析红枣酵素胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶SOD等功效成分含量。
(4)发酵液过滤、纯化
发酵结束，发酵液经4800rpm/min离心20min，取上清液在0.20Mpa压力下经0.4μm膜除菌过滤，即得红枣酵素原液。
2、红枣酵素原液评价结果
(1)功效成分分析
功效成分分析结果如表9。
表9
(2)感官评价
红枣酵素原液呈深红色，无悬浮物；具有红枣的香气；口感浓郁，酸甜爽口，具有红枣发酵液特有的滋味。
3、应用红枣酵素原液制备保健食品
应用红枣酵素制备保健食品的工艺流程如图21所示。包括如下：
(1)调配
将红枣酵素原液适当浓缩后，添加适当比例的益生元(低聚异麦芽糖或低聚木糖)及维生素、矿物质等营养强化剂制备红枣酵素保健食品，配方如表10所示。
表10、红枣酵素保健食品配方
(2)均质
将调配后的红枣酵素产品在55℃，25Mpa条件下进行均质。
(3)除菌、灌装
均质后在0.20Mpa压力下经0.4μm膜除菌过滤，无菌灌装即得红枣酵素保健食品。
获得的红枣酵素保健食品：呈深红色液体，无悬浮物；具有红枣特有香气，无异味；酸甜爽口，口感浓郁，具有红枣酵素特有的滋味。其多糖含量≥100mg/100mL；益生元(低聚异麦芽糖)≥2.8g/100mL；超氧化物歧化酶≥500U/100mL；总可溶性固形物含量：≥10％；pH值：3.6～4.2；微生物菌落总数cfu/mL＜100；大肠菌群MPN/100mL＜3；无致病菌检出。
实施例8、木瓜酵素及相应保健食品的制备
1、木瓜酵素制备工艺
实验原料：木瓜、纯净水。
实验菌种：同桂圆酵素中所用。
主要仪器设备：膜过滤采用0.4μm滤膜，MasterflexL/SEasy-Load螺动泵(美国Millipore公司)；其它同桂圆酵素中所用。
木瓜酵素原液制备工艺流程如图22。主要流程如下：
(1)木瓜汁的制备
将木瓜洗净，去皮去瓤后切块、称重，榨汁后100目筛网过滤即得木瓜汁。
木瓜汁经85℃杀菌15min，作为发酵底物。
(3)益生菌发酵木瓜汁
发酵结束，发酵液经4800rpm/min离心20min，取上清液在0.20Mpa压力下经0.4μm膜除菌过滤，即得木瓜酵素原液。
2、木瓜酵素原液功效成分
功效成分分析结果如表11。
表11
木瓜酵素原液呈橘红色，具有木瓜特有的香气，口感酸甜爽口，具有木瓜酵素发酵液特有的滋味。
3、应用木瓜酵素制备保健食品
应用木瓜酵素制备保健食品的工艺流程如图23所示。包括如下：
将木瓜酵素原液适当浓缩后，添加适当比例的益生元(低聚异麦芽糖或低聚木糖)及维生素、矿物质等营养强化剂制备木瓜酵素保健食品，配方如表12所示。
表12、木瓜酵素保健食品配方
将调配后的木瓜酵素产品在55℃，25Mpa条件下进行均质。
0.20Mpa压力下经0.4μm膜除菌过滤，无菌灌装即得木瓜酵素保健食品。
获得的木瓜酵素保健食品：呈橘红色液体，无悬浮物；具有木瓜特有香气，无异味；酸甜爽口，口感浓郁，具有木瓜酵素特有的滋味。其多糖含量≥100mg/100mL；益生元(低聚异麦芽糖)≥2.8g/100mL；超氧化物歧化酶≥2000U/100mL；总固形物含量：≥10％；pH值：3.6～4.2。微生物菌落总数cfu/mL＜100，大肠菌群MPN/100mL＜3；无致病菌检出。
实施例9、混合果蔬酵素
1、混合果蔬酵素制备工艺
实验原料：苹果、梨、甜橙、葡萄、柚子、西瓜、鲜桂圆、荔枝、火龙果、樱桃、猕猴桃、草莓、木瓜、柠檬、胡萝卜、黄瓜、番茄。
主要仪器设备：膜过滤采用0.4μm滤膜，MasterflexL/SEasy-Load螺动泵(美国Millipore公司)，10NDFREEZEDRYER，2XZ-2型悬片式真空泵，S22-2恒温磁力搅拌器；其它同桂圆酵素中所用。
混合果蔬酵素原液制备工艺流程如图24。主要流程如下：
(1)混合果蔬汁的制备
将苹果、梨、甜橙、葡萄、柚子、西瓜、鲜桂圆、荔枝、火龙果、樱桃、猕猴桃、草莓、木瓜、柠檬、胡萝卜、黄瓜、番茄等果蔬原料，洗净、去核或去皮、切块，等重量称取，榨汁后100目筛网过滤后取得混合果蔬汁。
混合果蔬汁经85℃杀菌15min，作为发酵底物。
(3)益生菌接种发酵
采用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌对混合果蔬汁进行接种发酵，发酵底物浓度9％(Brix)，保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌:嗜酸乳杆菌:青春双歧杆菌为1∶1∶1∶2(v/v)，接种量9％(v/v)，发酵8天即得混合果蔬酵素原液。
2、混合果蔬酵素原液功效成分
功效成分分析结果如表13。
表13
混合果蔬酵素原液呈淡红色，具有混合果蔬特有的香气，口感酸甜爽口，具有果蔬酵素发酵液特有的滋味。
3、混合果蔬酵素应用实例
应用混合果蔬酵素制备保健食品的工艺流程如图25所示。包括如下：
将益生元(低聚异麦芽糖或低聚木糖)、维生素、矿物质等营养强化剂及麦芽糊精、β-环状糊精、蔗糖酯等辅料经辐照杀菌后，在无菌条件下添加到混合果蔬酵素原液中，配方如表14所示。所有原料混合后密封，经磁力搅拌装置搅拌30min至料液均匀。
表14、混合果蔬酵素保健食品配方
(2)冷冻干燥
将调配后的混合果蔬酵素在-40℃条件下冷冻干燥48hrs，得混合果蔬酵素粉。
(3)包装
在温度20-26℃，湿度＜70％的无菌环境下，将混合果蔬酵素粉进行无菌分装，即得果蔬酵素粉保健食品。
获得的果蔬酵素粉保健食品(含益生菌)：呈淡红色粉末；具有混合果蔬特有香气，无异味；温水冲饮酸甜爽口，具有果蔬酵素特有的滋味。其多糖含量≥50mg/100mg；益生元(低聚异麦芽糖)≥2.8g/100mg；超氧化物歧化酶≥500U/100mg；益生菌总数cfu/g＞106；大肠菌群MPN/100mg＜3；无致病菌检出。
实施例10、燕麦酵素
1、燕麦酵素原液制备工艺
实验原料：燕麦、纯净水。
主要仪器设备：同桂圆酵素中所用。
燕麦酵素原液制备工艺流程如图26。主要流程如下：
(1)燕麦浆的制备
取燕麦500g，加入5L纯净水溶解得燕麦浆。
(2)蒸煮
燕麦浆经121℃蒸煮15min后冷却，作为发酵底物。
(3)益生菌发酵
发酵结束，发酵液经85℃杀菌10min，4800rpm/min离心20min后经200目筛网过滤即得燕麦酵素发酵原液。
2、燕麦酵素原液功效成分分析
功效成分分析结果如表15。
表15
燕麦酵素原液呈乳白色，具有谷物特有的香气，口感酸甜爽口，具有谷物发酵液特有的滋味。
3、燕麦酵素应用实例
应用燕麦酵素制备保健食品的工艺流程如图27所示。
将燕麦酵素原液适当浓缩后，添加适当比例的益生元(低聚异麦芽糖或低聚木糖)及维生素、矿物质等营养强化剂制备燕麦酵素保健食品，配方如表16所示。
表16、燕麦酵素保健食品配方
将调配后的燕麦酵素产品在65℃，25Mpa条件下进行均质。
经65℃杀菌30min后，热灌装即得
燕麦酵素保健食品。
获得的燕麦酵素保健食品：呈乳白色液体；具有谷物发酵特有香气，无异味；酸甜爽口，口感浓郁，具有谷物酵素特有滋味。其多糖含量≥30mg/100mL；益生元(低聚异麦芽糖)≥2.8g/100mL；总固形物含量≥10％；pH值：3.6～4.2；微生物菌落总数cfu/mL＜100；大肠菌群MPN/100mL＜3；致病菌无检出。
实施例11、青稞酵素
1、青稞酵素原液制备工艺
实验原料：青稞、蜂蜜、纯净水。
青稞酵素原液制备工艺流程如图28。主要流程如下：
(1)青稞发酵底物的制备
在青稞酶解液中添加5％(v/v)的蜂蜜，经85℃杀菌15min，作为发酵底物。
(3)接种益生菌发酵
发酵结束，发酵液经85℃杀菌10min，4800rpm/min离心20min后经200目筛网过滤即得青稞酵素原液。
2、青稞酵素原液功效成分分析
功效成分分析结果如表17。
表17
青稞酵素原液呈淡黄色，具有谷物特有的香气，口感酸甜，具有谷物发酵液特有的滋味。
3、应用青稞酵素制备保健食品
应用青稞酵素原液制备保健食品的工艺流程如图29所示。
将青稞酵素原液适当浓缩后，添加适当比例的益生元(低聚异麦芽糖或低聚木糖)及维生素、矿物质等营养强化剂制备青稞酵素保健食品，配方如表18所示。
表18、青稞酵素保健食品配方
将调配后的青稞酵素产品在65℃，25Mpa条件下进行均质。
经65℃杀菌30min后，热灌装即得青稞酵素保健食品。
获得的青稞酵素保健食品：呈淡黄色液体；具有谷物发酵特有香气，无异味；酸甜爽口，口感浓郁，具有谷物酵素特有滋味。其多糖含量≥100mg/100mL；益生元(低聚异麦芽糖)≥3.0g/100mL；总固形物含量≥10％；pH值：3.6～4.2；微生物菌落总数cfu/mL＜100；大肠菌群MPN/100mL＜3；致病菌未检出。
实施例12、酵素保质期实验(以桂圆酵素为例)
表19、桂圆酵素保健饮料保质期实验结果
桂圆酵素保质期实验结果表明，在加速试验期内，产品卫生微生物指标符合食品卫生要求，功效成分几乎没有损失，产品感官评价结果良好，根据加速试验结果，保质期为2年。
实施例13、酵素安全性毒理学检测实验结果
依据《保健食品安全性毒理学评价程序与检验方法规范》(卫生部2003年版)开展酵素产品的第一阶段及第二阶段的安全性毒理学检测，桂圆酵素的安全性毒理学检测结果。如表20所示，急性毒性实验结果无毒；骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形试验和30天喂养试验均为阴性。毒理学检测结果为酵素产品食用安全性提供依据。
表20、桂圆酵素安全性毒理学检测结果
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。