蛭类动物（Hirudinea）在动物分类系统中与寡毛类动物（Oligochaeta）作为两个纲划归环节动物门（Annelida）的有环带亚门（Clitellata）。它们都具有环带，又都是雌雄同体动物并通过分泌容纳受精卵的卵茧（cocoon）繁殖后代，胚胎发生也相同，都缺少外骨骼和功能性的叶足。在蛭纲中较高等的类群都有恒定的体节数而且又都具有用作运动器官的尾吸盘，其中真蛭亚纲（Euhirudinea）是主要的类群。它们都有32个口后节，尾吸盘又都由7节组成，根据有无可伸缩的吻可以分成为吻蛭目（Rhynchobdellida）和无吻蛭目（Arhynchobdella）。在无吻蛭目中医蛭形亚目（Hirudiniformes）较低等，多数有发达的颚，每个完全体节通常5环或更少。笔者在本书中讨论的我国医学蛭类就属于医蛭形亚目医蛭科（Hirudinidae）中的医蛭属（Hirudo）和牛蛭属（Poecilobdella）以及山蛭科（Haemadipsidae）中的山蛭属（Haemadipsa）。根据笔者统计，目前我国已发现医蛭属2种、牛蛭属6种、山蛭属10种，它们在医药上都具有广阔应用情景，现将这3属医学蛭类主要种类的形态特征及其生态分布列述如下。
(一)医蛭属HirudoLinnaeus,1758
体中型至大型，长度30-150毫米。背面通常有纵行的条纹。头部背面有5对眼，甚明显。体表感觉乳突通常背面8列，腹面6列。节IX至XXIII或XXIV为完全体节，每节5环相等。环带占据15环，位于X至XIII。体内嗉囊在节X至XIX之间，每节各有一对大的初生侧盲囊和一对小的次生侧盲囊，末对最大并向后伸至节XXV。水生种类，已知全世界有17种，我国仅有2种，其区分见以下检索表。
医蛭属分种检索表
1（2）背面黄白色纵纹宽阔，灰绿色的纵纹狭窄，腹侧各有一条很细的灰绿色的纵纹，
阴道囊狭长┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅日本医蛭Hirudonipponia
2(1)背面冬青绿色纵带宽阔，淡绿色的纵纹狭窄，腹侧没有细长的纵纹，阴道囊卵
圆形┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅丽医蛭Hirudopulchra
日本医蛭HirudonipponiaWhitman,1886（图9-1）
图9-1日本医蛭HirudonipponiaWhitman,1886背面观全形图
an.肛门；cs.尾吸盘；eyes眼；ggs.灰绿色的纵纹；
sen.体表感觉乳突；yws.黄白色纵纹.(笔者图，1996)
（二）牛蛭属PoecilobdellaBlanchard,1893
身体中等大小至大型，长度40-210毫米，体形粗壮。皮肤粗糙，前后端成网状或有许多疣状突起。体色艳丽，有线形色斑或条纹，具有绿色、褐色或淡红颜色。头部背面5对眼，排列如医蛭属。共有15个完全体节，各有5环，在节IX至XXIII之间。体节感觉器大而明显，是区分体节的标记。两生殖孔被5-9环隔开，分别位于节IX–XIII上。具齿的颚两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突。雌性生殖器官很特殊，有一个很大的盲囊，阴道长短不一。总输卵管与阴道一起开口向外，或开口到远离盲囊的阴道管端，或直接开口到盲囊上。水生种类，已知全世界有8种，我国已发现6种，主要分布在广东、广西、云南、海南以及福建等地，其区分见以下检索表。
牛蛭属分种检索表
1（5）阴道短，总输卵管与其一起开口向外┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅2
2（3）两生殖孔被7环隔开，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上，尾吸盘直径等于体宽
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅棒纹`牛蛭Poecilobdellajavanica
3（4）两生殖孔被5环隔开，雌生殖孔在节XII的b5/b6上，尾吸盘直径小于体宽
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅菲牛蛭Poecilobdellamanillensis
4（3）两生殖孔被9环隔开，雌生殖孔在节XIII的b2/a2上，尾吸盘直径接近体宽
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅远孔牛蛭Poecilobdellasimilis
5（1）阴道有长柄，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管端，或直接开口到盲囊上┅6
6（7）阴道柄几乎与盲囊及阴道管的长度相等，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管端
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅颗粒牛蛭Poecilobdellagranulosa
7（8）阴道盲囊呈卵圆形，总输卵管直接开口到靠近阴道管的盲囊部位┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅湖北牛蛭Poecilobdellahubeiensis
8（7）阴道盲囊呈棒槌形，总输卵管直接开口到远离阴道管的盲囊部位┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅南京牛蛭Poecilobdellananjingensis
菲牛蛭Poecilobdellamanillensis(Lesson,1842)(图9-2)
图9-2菲牛蛭Poecilobdellamanillensis(Lesson,1842)
a.背面观全形图χ2；b.雌性和雄性生殖系统ⅹ6
an.肛门；cod.总输卵管；cs.尾吸盘；de.射精管；eb.射精球；ep.贮精囊；
eyes眼；ga.蛋白腺；o.卵巢；od.输卵管；pr.前列腺；sp.侧中斑点；
sen.体节感觉器；ss.上缘斑点；vad.阴道管；vc.阴道盲囊；vd.输精管。
（笔者图，1996）
棒纹牛蛭Poecilobdellajavanica(Wahlberg，1855)（图9-3）
图9-3棒纹牛蛭Poecilobdellajavanica(Wahlberg，1855)
a.背面观全形图χ1.5；b.雌性和雄性生殖系统ⅹ4.5
an.肛门；at.精管膨腔；bas.棒纹；cod.总输卵管；cs.尾吸盘；
de.射精管；ep.贮精囊；eyes眼；ga.蛋白腺；o.卵巢；od.
输卵管；ps.阴茎囊；sp.侧中斑点；qs.方形侧缘黑斑；sen.体节
感觉器；te.精巢；vad.阴道管；vc.阴道盲囊；vd.输精管。
（a.笔者图；b.自宋大祥等，1978）
个体很大，体长60–170毫米或更长，个别的可达225毫米；最大体宽为10–19毫米；尾吸盘直径10–19毫米，常常等于最大体宽。身体狭长且扁平。活着时体表颜色极为艳丽，背面橄榄绿或草绿色，偶尔橄榄棕色。背中自眼间区至肛门前，有一断裂为22根棒的黑褐色纵纹。两生殖孔通常被7环隔开，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上。皮肤感觉器非常地大而明显，伸长并与体轴倾斜或成直角。皮肤成网状，特别是在身体的两端。尾吸盘很大，直径常常等于最大体宽的宽度。颚很大，两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突，通常颚脊上约有100-140个锐利的齿。精管膨腔很短，具有比较宽的阴茎囊。阴道也短，没有柄，总输卵管与其一起开口向外。本种在我国云南西南部地区，如西双版纳等地广泛分布，栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中，数量众多。这些孽生地杂草丛生，水流缓慢或停滞。平时它们潜伏在草丛中，当人、畜下水产生水波时立即漂游而来并爬到人、畜身上吸血，直至饱食后离去。雨季本种牛蛭最为繁盛，而在干旱季节里则极少见到，通常潜伏在泥草里越冬。
（三）山蛭属HaemadipsaTennent,1859
身体小而细长，呈亚圆柱形，从尾吸盘至头部渐渐变细，大小与形状又随取食程度而改变，通常8–50毫米长。棋盘格形的皮肤，特别是在头部及尾吸盘上最明显。头部背面有5对大眼，分别位于第2、3、4、5、8环上或2、3、4、6、9环上，第4、5对眼被2环隔开。身体背面通常有纵纹及斑点。完全体节有5环。两生殖孔通常被5环（节XIb5/b6和节XIIb5/b6）隔开，但少数种可能被更多的环隔开。尾吸盘巨大，在其背侧与体部交界处有2或3对叶状的耳状突，腹面有许多明显的辐射肋。口内有3个非常高而明显的颚，但其上没有唾液腺乳突，具有锐利并弯曲排列的细齿。射精球不发达，呈梨形的精管膨腔小，其表面覆盖有疏松的腺体。阴道分成为狭窄的管部和大而呈圆柱形的盲囊。已知全世界有12种和8亚种，我国已发现9种和2亚种，主要分布在华南和西南一些潮湿的山林地区，其区分见以下检索表。
山蛭属分种检索表
1（2）在第3和第4眼之间几乎总被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射肋74–76
条┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅3
2（1）在第3和第4眼之间可以或不被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射肋71–
73条┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅4
3（6）背部有3条黑色或暗褐色条纹，中央一条狭细，有时断裂或完全消失┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅森林山蛭Haemadipsasylvestris
4（5）身体通常红褐色或橙色，具有黑色斑，背中有一条黄色或黄绿色条纹┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里兰卡山蛭，模式亚种Haemadipsazeylanicazeylanica
5（8）身体颜色通常易变，但褐色斑点图案不变，背中较暗的区域有一条黑色或褐色条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里兰卡山蛭，敏捷亚种Haemadipsazeylanicaagilis
6（7）背部有3条深褐色条纹，中央一条完整，贯穿前后┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅日本山蛭Haemadipsajaponica
7（8）背中及两侧缘上方有3条黑褐色条纹，中央一条粗大┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅珠峰山蛭Haemadipsaqomolangma
8（9）背中黄褐色带状区的边缘有由17对弧形线联结成的两条黑褐色条纹，中央尚有一
根细条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅盐源山蛭Haemadipsayanyuanensis
9（10）背中宽阔的淡黄色带状区的边缘有的地方突向外侧区内，中央及其两侧有3条
较细的棕色条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅海南山蛭Haemadipsahainana
10（11）背中较宽的浅色带状区两侧共有6条粗而直的黑色条纹，无中央条纹┅┅
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅天目山蛭Haemadipsatianmushana
11（12）背中宽阔的乳白色带状区共有5个条纹并在各节上有凸向外的斑块，中央一条
狭细┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅广川山蛭Haemadipsaguangchuanensis
12（11）背中乳白色带状区无中央条纹，内背侧一对纵纹粗而直，外背侧一对纵纹细
┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅盐边山蛭Haemadipsayanbianensis
身体中等大小，呈圆锥形，背面隆起，腹面平坦。体长11–36毫米；最大体宽2.5–6毫米；尾吸盘直径2–6毫米。活体时背面棕色或灰褐色，有许多不规则的灰黑色或黑色斑点。背中有一条较宽的浅色的带状区，其两侧共有6条3对粗而直的黑色纵纹。背侧区色深，多黑褐色斑点。腹面有咖啡色的斑点或由斑点聚集成的斑块，腹侧有两对平行的棕色纵纹，腹中为一条狭窄的银白色区带。贮精囊在远离射精球的地方螺旋盘绕。阴道囊粗而短，前部有一狭窄的颈部。本种仅见于我国，广泛分布在华东、华中、华南以及西南一些潮湿的山地丛林里。先后在浙江天目山、湖北神农架、河南太行山和大别山的南麓、四川峨眉山和盐边县、广东高州县以及海南岛发现。栖息于海拔600–2200米山地温暖、潮湿、阴暗的原始森林、灌木丛、冷竹林、溪边草丛和草坡上，尤其以小道旁边和枯枝落叶中较多。活动季节一般在每年4月下旬够至9月中、下旬，但以6月下旬至8月中、下旬小雨、雨后或者晨露未干之前时数量最多，也极为活跃。夏季至秋初在石块下、枯枝落叶中、草丛和松土内以及地表丛生的苔藓中产茧。冬季仅偶而见与青苔和草被的下面。
图9-4日本山蛭HaemadipsajaponicaWhitman,1886
a.背面观全形图χ7；b.头部背面观ⅹ10;c.雌性和雄性生殖系统ⅹ10
an.肛门；au.耳状突；cs.尾吸盘；cod.总输卵管；de.射精管；ds.背感器；
eb.射精球；ep.贮精囊；eyes眼；o.卵巢；od.输卵管；pr.前列腺；
ps.阴茎囊；st.条纹；te.精巢；va.阴道囊；vad.阴道管；vd.输精管。
（a，c笔者图；b自宋大祥等，1978）
图9-5天目山蛭HaemadipsatianmushanaSong,1977
a.背面观全形图χ4.5；b.雌性和雄性生殖系统ⅹ10
an.肛门；au.耳状突；cs.尾吸盘；cod.总输卵管；ds.背感器；
ep.贮精囊；eyes眼；o.卵巢；od.输卵管；pr.前列腺；ps.阴茎囊；
sp.斑点；st.条纹；te.精巢；va.阴道囊；vad.阴道管；vd.输精管。
3医学蛭类的唾液腺分泌物及其活性成分
图9-6日本医蛭Hirudonipponia消化系统解剖图
a.消化系统；b.和c.颚及其附属器官
an.肛门；cr.嗉囊;cs.尾吸盘；int.肠；ja.颚；mth.口；
oe.食道；rt.直肠；salg.唾液腺；wr.纵褶。
(一)水蛭素（Hirudin）
关于天然水蛭素的研究、报道和专利，决大部分是利用欧洲医蛭（Hirudomedicinalis）
（二）水蛭透明质酸酶（Hyaluronidase,HAse）
（三）前列腺素(Prostglandins)
俄罗斯国立莫斯科大学巴斯柯娃等人(Baskovaetal.,1987)应用放射免疫方法从欧洲医蛭的头部和整个身体中检测出前列腺素并且是以6–Keto–PGF(简称6–KF)的前体形式出现，这是一种前列腺素转化成的产物，具有明显的抑制血小板聚集和抗动脉硬化的功能特性，副作用也小，而血小板聚集是引起动脉粥样硬化和心肌梗塞的主要起因。6–KF前体多为一个具有五碳环和两个双键侧链的二十碳脂肪酸（PGI2）,它能迅速转化为性能稳定的最终产物6–KF，利用检测6–KF的含量变化可以判断PGI2的含量以及消长变化。研究表明前列腺素是人体内分布最广，作用极大的一类生物活性物质,它通过对某些激素的调节来控制人体平滑肌的收缩、血液供应（血压）、神经传递、发炎反应、电解质出钠以及血液凝固等生理过程。在实际应用中可以作为消散血栓和抗动脉脉粥样硬化的药物，是制造一系列具有良好性能药物的原料。
（四）安逖斯塔辛（Antistasin）
4医学蛭类化学感受器的特异性以及唾液腺分泌物的采集
图9-7吸血水蛭化学感受器的扫描电子显微镜观察
1日本医蛭头部背唇化学感受器扫描电镜图；2日本医蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描电镜图；3湖北牛蛭头部背唇化学感受器扫描电镜图；4湖北牛蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描电镜图；5日本医蛭口部内侧皮肤上的短棍棒状突起扫描电镜图；6湖北牛蛭口部内侧皮肤上的短棍棒状突起扫描电镜图（笔者图，2001）
(一)扫描电子显微镜观察
为了弄清我国两属吸血水蛭化学感受器的特异性，笔者与武汉大学电子显微镜室的同事合作做了日本医蛭和湖北牛蛭头部背唇及口部皮肤的扫描电镜观察以及取食行为实验。扫描电镜观察结果证明我国两种吸血水蛭头部背唇皮肤上也有两类大小不等的纤毛感觉墩，呈带状排列，约150个左右，每个墩的中央是由长度均一的纤毛状突起构成的纽扣状结构，前者的纤毛较稠密，后者的纤毛较稀疏。较大的一类纤毛感觉墩在光学显微镜下不具色素斑点，而在扫描电镜下日本医蛭每纤毛感觉墩约有30根等长的纤毛，湖北牛蛭每纤毛感觉墩约有25根等长的纤毛，前者呈稠密的丛状，后者呈稀疏的环状（见照片图组I:1,2和3，4）。在口部内侧皮肤上也有由3–4根短棍棒状突起构成的结构，日本医蛭的突起呈密集丛生状，湖北牛蛭的突起呈稀疏丛生状（见照片图9-7:5和6）。
（二）取食行为实验
为了验证以上两种吸血水蛭化学感受器的分布位置与取食反应的关系，笔者特用两组小玻璃杯分别盛以新鲜的猪血和牛血，杯口蒙上肠系膜并将其投入内有两种饥饿吸血水蛭的缸中。重复多次之后发现日本医蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜猪血的小玻璃杯非常敏感并喜食猪血，湖北牛蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜牛血的小玻璃杯非常敏感并喜食牛血。同时又用经过手术切除头部背唇和口部皮肤以及只部分切开而不摘除头部背唇和口部皮肤的两种饥饿吸血水蛭做了以上实验，重复多次之后发现切除头部背唇和口部皮肤的个体对盛有新鲜猪血和牛血的小玻璃杯均无任何取食反应发生，然而部分切开又不摘除头部背唇和口部皮肤的个体对以上的小玻璃杯有与不切除头部背唇和口部皮肤的个体同样的取食反应发生。这进一步证明了两种吸血水蛭的化学感受器均分布在头部背唇和口部皮肤上。
（三）吸血水蛭化学感受器的特异性以及唾液腺分泌物的采集
5医学蛭类唾液腺分泌物活性成分的分离、纯化与活力测定
(一)水蛭素的分离、纯化与活力测定
此段以我国产的日本医蛭为对象，先将其充分饥饿再采用以上唾液腺分泌物的采集方法大量提取唾液腺分泌物，置冰箱中冷冻保存待用。解冻后取250–300ml加进4倍置冰箱中4℃下预冷的含15%水的冷丙酮，搅拌后置冰箱中4℃下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸（约25ml）使其溶解，离心除去残渣，待上样进行柱层析。
阴离子交换柱层析取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂（DEAE-C52）加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸馏水洗涤至中性。装柱（2cmx60cm）至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时。经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再用双缩脲法测总蛋白质含量，继续以下凝胶过滤柱层析。
双缩脲法测总蛋白质含量取一系列试管分别加进0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0的标准牛血清白蛋白溶液（6mg/ml）,用水补足至2ml，然后分别加进4ml的双缩脲试剂（每
升溶液中含1.50gCuSO45H2O和6.0gNaKC4H4O64H2O,30gNaOH)，在室温下放置30分钟，用721分光光度计在540nm处比色，光密度分别为0，0.066，0.135，0.210，0.285，0.340。以光密度为纵坐标，牛血清白蛋白（BSA）含量为横坐标绘出标准曲线。取2.0ml于透析袋中用甘油浓缩后的样品按上述方法测540nm处的比色，便可以在标准曲线上查到对应的蛋白质含量的微克数。用测得的蛋白质含量结合用凝血酶滴定测得的数据，便可以求算出样品中水蛭素的比活力。日本医蛭唾液腺分泌物提取液纯化总得率为15%；纯化后的产物的比活力为6708AT-U/mg蛋白。
凝胶过滤柱层析取适量的交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex-G25）加蒸馏水浸泡4小时，按常规方法用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡。装柱（1.5cmx50cm）至所需高度，用pH7.4的0.1mol/LTris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样，洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。分别检测活力，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩。再检测活力后，待用DU-70贝克曼分光光度计在200nm至400nm波长范围内扫描，便能确定所得产物的纯度。
（二）蛭透明质酸酶的分离、纯化与活力测定
通过硫酸铵分级沉淀进行酶的分离与纯化分别取一定体积的日本医蛭和湖北牛蛭唾液腺分泌物提取液，缓慢加固体硫酸铵至40%饱和度，在冰浴中搅拌10分钟，并在700转/分钟下离心20分钟，取上清液调硫酸铵饱和度至80%，同上离心取沉淀，将此沉淀悬浮于10mlpH7.0的70%饱和度硫酸铵溶液中，充分搅拌并同上离心取沉淀，溶于5mlpH7.0的50%饱和度硫酸铵溶液中，同上离心取上清液，装入透析袋中对无离子水透析，直至用10%BaCl2检测无沉淀时终止，量取透析后液体体积，留适量用作测酶活及测蛋白质含量。整个过程采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法监测酶活。
通过二乙基氨基纤维素阴离子交换剂（DEAE-C52）柱层析进一步分离与纯化酶将预处理的DEAE-C52装柱（1.5cmx50cm），用pH7.1的0.05mol/LTris-HCl缓冲液平衡过夜。上样后，待记录仪基线平稳后再依次用pH6.0的0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.6的0.1mol/L乙酸缓冲液（含0.1mol/LNaCl）,pH4.0的0.1mol/L乙酸缓冲液（含0.2mol/LNaCl）洗脱，流速为40ml/小时。测定结果表明pH5.6下的洗脱峰水蛭透明质酸酶（HAse）酶活力最高。将该峰的洗脱液装入透析袋中对无离子水透析，然后加入3倍体积的冷丙酮沉淀，最后将沉淀抽干置-20℃下保存。
制定葡萄糖标准曲线用15℃下烘干到衡重的葡萄糖配制250微克/毫升的标准液，在成梯度容量的各标准液中加3毫升3，5-二硝基水杨酸(DNS),在沸水浴中5分钟显色后用自来水冷却至室温并加蒸馏水稀释。用72型分光光度计在550nm处测定光密度OD值,用OD550对葡萄糖微克数做标准曲线。
样品中酶活力的测定在0.8mlpH5.5的0.02mol/L柠檬酸缓冲液中加0.2ml的5mg/ml透明质酸溶液和0.2ml待测样品于38℃水浴中精确保温30分钟，然后将试管浸入沸水中终止反应。取0.1ml以上降解液加3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂显色，同时用0.2ml煮沸的酶液作对照测A550（吸光率），根据光密度OD550从标准曲线上查出还原糖的微克数。每毫升样品中酶活力单位数（I.U./ml）=还原糖在标准曲线上的微克数X12。结果表明用常规糖定量3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测水蛭透明质酸酶（HAse）较传统浊度法更简单和可靠，灵敏性和专一性都较好。日本医蛭的产率为17.8%，湖北牛蛭的产率为14.3%。
用福林(Folin)-酚试剂法测蛋白质含量首先按照常规方法测定吸光率A540，制定出牛血清蛋白(BSA)标准曲线。蛋白质含量(mg/ml)=A540x3.91,取1.0ml样品按上法测A540便可以在标准曲线上查到对应的微克数。用测得的蛋白质含量可以推算出样品的比活力。结果表明日本医蛭的比活力为3529u/mg,湖北牛蛭的的比活力为2352u/mg。从以上结果看出，两者在分离和纯化之后比活力都提高很多，且比活力之比在纯化之后下降了。从理论上看，经过纯化之后两者的比活力应该很接近，但其比活力之比仍大于1，这说明湖北牛蛭纯化的结果不如日本医蛭理想。