2、7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4保存。（2）标准丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL）：取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。（3）SGPT底物液（含-酮戊二酸2mol/ml及DL-丙氨酸200mol/ml）:取-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol/LNaOH调pH7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。（4）GOT底物液（DL天冬氨酸200mmol/L,-酮戊二酸2mm
3、ol/L）:称取-酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。（5）2.4-二硝基苯肼溶液:取分析纯2,4-二硝基苯肼19.8mg，用1mol/LHCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。（6）0.4mol/LNaOH溶液:称取16g固体NaOH，用蒸馏水溶解，冷却至室温，定容至1000mL，备用。操作步骤：1、标准曲线绘制：取试管18支按下表操作。试
4、管号对照12345丙酮酸标准液（1毫升2微克分子）00.050.100.150.200.25SGPT或SGOT底物0.500.450.400.350.300.250.1M磷酸盐缓冲液PH7.40.10.10.10.10.10.1相当于谷丙转氨酶单位0285797150200相当于谷草转氨酶单位02461114190每个样做3个平行，置37水浴30分钟，各管加2，4-二硝基苯肼液0.5mL，混匀，再在37水浴中放置20mL，各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL，混匀，10分钟后，从水浴箱中取出，以蒸馏水调“零”点，用520nm波长比色，读取各管之吸
5、光值，各管之吸光值均减去空白的吸光值，然后以吸光值为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。为了方便，可列出各光度相当于转氨酶单位表。2、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。试剂样品测定（每个样3个平行）对照（每个样3个平行）血清（mL）0.10.1SGPT或SGOT底物（mL）0.5置37水浴30分钟（SGOT为37，60分钟后再加枸橼酸苯胺1滴）2.4-二硝基苯肼（mL）0.50.5置37水浴20分钟SGPT或SGOT底物（mL）0.5NaOH溶液（mL）5.05.0对照及样品各做3个平行，充分摇匀，静置10分
6、钟后，用520nm波长比色，以蒸馏水调节零点，读取吸光值，用样品减去对照吸光值，求得样品的谷丙转氨酶活力谷丙转氨酶活性单位：37，pH7.4，每小时每毫升血清催化生成1mol丙酮酸为1个单位。例：0.1ml血清每小时催化生成0.1mol丙酮酸,即相当于GPT100U/100ml血清。1.在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2.标准曲线上数值在20500U是准确可靠的，超过500U时，需将样品稀释。3.转氨酶只能作用于L氨基酸，对D氨基酸无作用。实验室多用DL氨基酸（较L氨基酸价廉
7、），若用L氨基酸，则用量减半。4.溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。5.血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管优点：尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果
8、,但因其量不多,加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强,尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果比其他比色法准确.故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法.1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理,缺点：由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足,反应速度只能达到最大速度的65%;显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半;保温30min的酶促反应后,新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸
9、存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题,如此等等,使赖氏法的重现性较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大.*1个卡门氏单位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。*国际单位：在最适温度（25）下，1分钟产生1mol丙酮酸的酶量为1个活性单位，即1IU=1umol/min。*King法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60min，生成1mol丙酮酸称为一个单位。*Mohun法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，
12、敏度高，用量极微（一般只需0.02ml血清即可）。本实验是先将血清用生理水以1：4加以稀释再取0.1ml，故最后计算时，应乘以稀释倍数“5”2.试剂中加入硫胺脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象（小于5%/h）。3.此法操作简单，特异性强，不受其他非蛋白质含氮化合物如尿酸、肌酸等影响，但应控制好实验条件。4.吸管必须校正，使用时务必注意清洁干净，加量务必准确。5.尿液中的尿素氮也可用此法进行测定。由于尿液中尿素氮含量高，标本需用蒸馏水以1:50稀释。如果呈色后吸光度仍超过本法的线性范围，还需将尿液再稀释，重新测定。3尿素浓度以前习
14、进行定量测定。1、仪器：紫外分光光度计、水浴锅2、试剂：（1）葡萄糖标准母液（10mg/ml，用饱和苯甲酸溶液配制）（2）邻甲苯胺溶液：2.5g硫脲溶于冰醋酸，加入邻甲苯胺150ml及2.4%硼酸100ml，用冰醋酸定容至1升。3、操作步骤：（1）配置不同浓度葡萄糖标准溶液：取5支10ml容量瓶，标号，依次加入葡萄糖母液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0ml，用饱和苯甲酸稀释至10ml，混匀（则上述溶液100ml葡萄糖含量为25，50，100，200，300mg）；（2）分别精密吸取不同浓度葡萄糖标准溶液于试管中，设平行管，空白管加0.1mL蒸馏水，
15、各管加入邻甲苯胺试剂5.0mL，混匀后，置沸水中15分钟，立即移入冷水浴中冷却；（3）以空白号管调零，于紫外分光光度计波长630nm处测吸光值，以各管的吸光度为纵坐标，相应管中葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线，得出线性方程。4）测试样品：取全血0.1mL，设平行样，按上述方法测出其A630nm吸光值，通过线性方程求出其血糖含量。试剂（mL）012345邻甲苯胺试剂5.05.05.05.05.05.0不同浓度葡萄糖标准溶液00.10.10.10.10.1蒸馏水0.100000100mL全血相当于葡萄糖质量mg02550100200300A630n
17、在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（BCG）结合形成蓝绿色复合物，在波长630纳米处有光吸收峰，其颜色的深浅与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清白蛋白含量。试剂：1.溴甲酚绿（BCG）贮存液：取BCG419mg，用10ml0.1mol/LNaOH溶解，加NaN3100mg，定容至1000mL。贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取432mg.加水溶解。2.0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.2）：分别配制0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠溶液，然后按12.3：7.7的体积比例混合。每1000
18、ml混合液加入NaN3100mg。3.30%聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）溶液：取Brij-3530g，加少量水，60水浴溶解，加水至100ml（此可用Tween-20或Tween-80代替）。4.BCG应用液：BCG贮存液250ml，0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.2）750ml，30%Brij-358ml（也可以用Tween-208ml或Tween-8010ml代替）混合而成。5.标准蛋白溶液（10mg/ml）：称取白蛋白1.00g，用生理盐水。实验操作：1.白蛋白标准曲线绘制（1）稀释白蛋白标准液：分别精密量取
19、白蛋白标准液0.10mL，0.20mL，0.40mL，0.60mL于试管中，再在每个管中依次加入蒸馏水0.9mL，0.8mL，0.6mL，0.4mL，混匀，得到稀释后白蛋白标准液含量分别为1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml，6.0mg/ml。（2）分别精密量取每个不同浓度稀释白蛋白标准液0.2mL于试管中，空白管加入生理盐水0.2mL，设平行样，再在每个管中加入BCG应用液5.0mL，混匀后以空白管调零，立即于紫外分光光度计测吸光值，吸收波长为620mn，绘制标准曲线，得出线性方程。（3）样品血清白蛋白测定：用生理盐水按
21、35，如达不到此值，表示灵敏度较差。5蛋白质标准液是一个复杂的问题，实验证明，BCG不但与白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较白蛋白稍慢。由于30S内呈色对白蛋白特异，故BCG与血清混合后，在30S内读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。1本法操作简便、快速、胆红素、溶血和中度脂血无干扰，既可手工操作，也能自动化分析，是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。2本法线性范围10-60g/L，RCV<4%。但该法与溴甲酚紫法比较，对血清白蛋白
22、特异性稍差。六、血清总蛋白（TP）（双缩脲法）原理：血清中蛋白质分子的肽键与双缩脲试剂中的Cu+结合形成紫色化合物；其色度与总蛋白的浓度成正比，在546波长下进行比色测定。实际上凡是分子内含有两个氨基甲酰基（-CONH2）的化合物，不论直接相连或是通过一个氮或碳原子间接连接，均能与双缩脲试剂发生反应。蛋白质分子内含有许多肽键（-CONH2），因此可用双缩脲法作比色测定。但应注意的是不仅仅是（-CONH2），凡含-CSNH2、-C（NH）NH2或-CH2NH2等基团而具有累似结构的化合物对双缩脲试验亦呈阳性，所以本反应并非为蛋白质所特有。但在体液中，除
23、蛋白质外实际上不存在可与双缩脲试剂显色的物质。各种血浆蛋白质，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血浆蛋白的比色测定中，双缩脲反应是比较理想的方法。仪器：紫外分光光度计、水浴锅、电子天平、试剂：（1）10%氢氧化钠溶液：称取10.00g氢氧化钠，用蒸馏水溶解，冷却至室温后，定容至1L，备用。（2）双缩脲试剂：取1.50g硫酸铜和6.0g酒石酸钾钠，用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL10氢氧化钠溶液，1.0g碘化钾；用水稀释到1000mL，避光保存。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现，则需重新配制。（3）标准蛋白溶液：10
24、mg/mL牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（酪蛋白用0.05moL/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。（4）待测蛋白质溶液：待测血清按1:10倍数稀释，待用。（注意样品浓度不要超过10mg/ml）操作方法：（1）标准曲线的测定：精密吸取0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL的标准蛋白质溶液于试管中，分别依次加入蒸馏水1.0mL，0.8mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0mL，设平行样，然后加入4mL双缩脲试剂。充分摇匀后，
25、37水浴10min，以空白管调零点，在540nm波长处测定吸光值。以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2）样品的测定：用上述同样的方法，测定稀释的待测血清的蛋白质浓度。1.样品中总蛋白含量超过100.0g/L，则用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。2.试剂浑浊变色不能用。3.试剂使用后立即盖紧瓶盖。1、白蛋白/球蛋白=1.52.5/1，通过计算其比值可以判定肝脏的功能情况；2、总蛋白升高：脱水，皮肤大面积烧伤、发烧、腹泻、呕吐。3、总蛋白降低：大量输液将机体血浆稀释，某些水肿性疾病，长期营养不良和消耗性疾病。4、球蛋白大量降低：机体免疫功能降低
26、。七、总胆固醇（TCH）八、甘油三酯（TG）九、酪氨酸多巴氧化酶活性测定（多巴色素法）1、仪器设备：紫外分光光度计，离心机，秒表2、试剂：（1）0.10mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）:50mL0.20mol/LNa2HPO4与22mL0.1mol/LHCl混合，稀释至200mL。（2）0.010mol/L多巴溶液：称取0.195g多巴，用pH6.0磷酸缓冲液溶解并定容至100mL。3、实验方法：取0.1mL待测液于试管中，加入2.9mLpH6.0缓冲液，再加入2mL多巴溶液，立即摇匀于480nm波长下测吸光值，开始
29、。（4）60M核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100mL，避光保存。（5）2.25mM氮蓝四唑（NBT）溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。2、酶活性测定（1）反应混合液配制（以60个样为准）：分别取Met溶液162mL，EDTA-Na2溶液0.6mL，磷酸缓冲液5.4mL，NBT溶液6mL，核黄素溶液6mL,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30L酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3mL反应混合液
31、l）十一、CAT（过氧化氢酶）的测定方法1、试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液（Na2HPO4）457.5ml和B母液（NaH2PO4）292.5ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。2、酶活测定（1）反应液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.309ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。（2）样品测定：以PBS为对照调零，取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）样品液，立即测定A240（紫外），1min测一次，连续4min。（3）酶活性计算：以每minOD值减少0.01
34、2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。1、试剂和仪器仪器：可见光分光光度计、低温高速离心机、恒温水浴锅、微量加样器试剂：（1）叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0：分别称取NaN316.25mg，EDTA-Na27.44mg，Na2HPO41.732g，NaH2PO41.076g，加入蒸馏水溶解至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4保存。（2）1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液：称取GSH30
35、.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1-2天。3)1.25-1.5mmol/LH2O2溶液：取30H2O20.15mL-0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。（4）偏磷酸沉淀液：称取16.7gHPO（3先用蒸馏水溶解），0.5gEDTA，280gNaCl加蒸馏水溶解至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。（5）0.32mol/LNa2HPO4溶液：称取22.7gNa2HPO4加蒸馏水至500mL，室温保存。（6）DTNB显色液：称取40.0mgDTN，B1.000g柠檬酸三钠加蒸馏水溶解至100mL，4避光保存1个月。2、实验步骤样品制备溶血液：取鼠血10l加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20冻存，3d内测定，若4存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水