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不同品牌游离核酸保存管的比较
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鉴于游离核酸的重要检测意义，游离核酸的保存条件则直接决定了检测结果的可靠性。为确保游离核酸标本检测的准确性，本文采用了市面上常用的不同品牌游离核酸保存管，就保存效果进行了比较。
1.前言
2材料与方法
2.1材料
2.1.2血液样本健康人血10ml。
2.1.3试剂及设备（1）PremixEXTaq（TaKaRa,Cat.RR390A）；（2）探针及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；（3）QubitdsDNAHSAssayKit（InvitrogenbyThermoFisherScientific）；（4）Beta-actin质粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成；（5）BioRad-CFX96(BIO-RAD,Fostercity,California，USA），Qubit2.0Fluorometer(LifeTechnologies，USA)，Mili-QAdvantageA10，SHZ-82A恒温振荡器（常州医疗器件厂）。
2.2方法
2.2.1血液样本采集采用标准静脉穿刺采集年龄22-40岁健康人血10ml，各组年龄差异无统计学意义（P＜0.05），分别装于采血管及保存管。
2.2.2血浆分离方法轻柔上下颠倒混匀10次，800×g，20min，转移上层血浆至1.5ml离心管；16,000×g，室温，10min，转移上层血浆至1.5ml离心管冻存-80℃备用。提取游离核酸前，室温解冻，16,000×g，5min，吸取上层血浆，进行游离核酸提取。
2.2.3游离核酸提取方法根据QIAampCirculatingNucleicAcidHandbook试剂盒操作说明操作。
2.2.4Qubit荧光计定量血浆游离DNA的浓度采用Qubit2.0荧光计定量血浆游离DNA的浓度。
2.2.5Beta-actin拷贝数的检测Beta-actin10倍梯度稀释107-101，引物分别分actin-F1，actin-R1，探针为probeactin，引物及探针工作浓度为5uM，20ul荧光定量体系引物加入量为各1ul。
扩增程序为50°C、5min，95°C、10min，循环50次，95°C、20s，65°C、20s，72°C、10min，结束。扩增程序试剂组成：
Reagent
体积（ul）
TakaraPremix
10
PrimerF
1
PrimerR
Probe
模板
ddH2O
补足20ul
3结果
3.1不同天数下（25°C）游离核酸保存效果的对比
分别用3种不同的保存管（E、S及B）采集血液10ml，颠倒混匀15次后立即等分4份至无抗凝剂无促凝剂的玻璃采血管中，保存条件为25°C。分别于保存第0、3、7、14天时分离血浆，提取游离核酸。
图1不同保存天数下血液保存现象
图2Qubit检测不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml）
图3不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数
图3显示：Beta-actin绝对定量结果趋势与Qubit结果基本一致，室温25°C保存3天，3种保存管的差异不显著；保存第7天时，E与B组间的PValue<0.01，差异极显著，B与S组0.01 图4不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml） 图4Qubit结果显示：三种保存管7天内保存效果无明显差异，14天时，K组与S组保存管均出现明显的上升，分别是第0天的15.27倍和10.21倍，21天时，上升最为明显，分别是第0天的22.46倍和13.84倍。B组保护剂保存的血液在第0、3、7、14、21、28天检测时，每毫升血液cf-DNA浓度均无明显的上升。 图5Beta-actin绝对定量结果与图4基本一致。B2组保护剂保存的血液在第0、3、7、14、21、28天检测时，每毫升血液Beta-actin拷贝数均无明显的上升。 3.2不同天数下（4°C）游离核酸保存效果的对比 图6Qubit结果显示：在4°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。 图7Beta-actin结果显示：在4°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数并无明显的差异。 3.3不同天数下（37°C）游离核酸保存效果的对比 图8不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml） 图8Qubit结果显示：在37°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。 图9不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数 图9Beta-actin结果显示：在37°C情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数并无明显的差异。 3.4运输环境（25°C）对游离核酸保存效果的影响 考虑到保存管有可能应用于样品的长途或短途运输，因此需用摇床模拟运输环境对保护剂抑制细胞破裂的影响。S组、K组及B组分别采集血液一份，摇床设置180rpm，25°C，分别在0、3、7、14天检测核酸浓度和beta-actin拷贝量。 图10不同保存天数下每毫升血液cf-DNA浓度（ng/ml） 图10Qubit结果显示：在25°C模拟震荡情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA浓度并无明显的差异。 图11不同保存天数下每毫升血液Beta-actin拷贝数 图11Beta-actin结果显示：在25°C模拟震荡情况下，三种保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷贝数并无明显的差异。 4.讨论 5.参考文献 [1]MANDELP,MéTAISP.Lesacidesnucléiquesduplasmasanguinchezl’homme［J］.CRAcadSciParis,1948,142:241-243.[2]LEONSA,SHAPIROB,SKLAROFFDM,etal.FreeDNAintheserumofcancerpatientsandtheeffectoftherapy［J］.CancerRes,1977,37(3):646-750.[3]STROUNM,ANKERP,MAURICEP,etal.NeoplasticcharacteristicsoftheDNAfoundintheplasmaofcancerpatients［J］.Oncology,1989,46(5):318-322.[4]NortonSE,LechnerJM,WilliamsT,etal.Astabilizingreagentpreventscell-freeDNAcontaminationbycellularDNAinplasmaduringbloodsamplestorageandshippingasdeterminedbydigitalPCR[J].ClinicalBiochemistry,2013,46(15):1561-5.[5]RyanWL,FernandoRM,DasK.BLOODCOLLECTIONDEVICEFORSTABILIZINGCELL-FREEPLASMADNA:,WO2013123030A3[P].2013.