本申请系关于一种犬艾利希体的快速诊断，尤指一种检测犬艾利希体的引物对、套组及方法。
【先前技术】
犬艾利希体(ehrlichiacanis)为一小型、杆状、细胞内寄生且由壁虱传播的病原体，革兰氏染色呈阴性，属于α-变形菌(α-proteobacterium)，且主要由棕色犬壁虱(browndogtick，学名为rhipicephalussanguineus)所传播。此病原体呈微菌落方式寄生在以薄膜区隔的细胞内液泡，且主要寄生在哺乳类宿主的单核细胞及巨噬细胞中。艾利希体(ehrlichia)与立克次体(rickettsia)、无形体(anaplasma)及沃尔巴克氏体(wolbachia)是非常接近的菌种，且具有类似的细胞内结构。
犬艾利希体最早于公元1935年在阿尔及利亚被发现，且目前所知已广泛分布在美国、欧洲、南美洲及亚洲。犬艾利希体会造成犬只的艾利希体症(ehrlichiosis)，其系经由壁虱传播而感染，而感染的犬只若未受治疗，可能成为无症状的带原者长达数年，且最后因大量出血而死亡。艾利希体症会影响犬只、人类及其他驯养或野生的动物品种。随着全球暖化、壁虱分布区域的扩大及国际旅行的增加，此疾病也可能会散播至过去非流行的区域。
艾利希体症可产生多重有临床症状或无临床症状的表现，使得此疾病的诊断富有挑战性。急性和慢性期以及与其他蜱媒病原体的共同感染，也使得治疗更加复杂。尽管用抗生素治疗且临床症状已解除，通常病原体也无法被完全消除。
由于这些感染通常会造成血小板低下症，因此血小板计数是重要的筛检试验，然而少量的病原体增加了试验的困难度，故此诊断方法缺乏灵敏度。而其他用于犬艾利希体诊断的方法尚包括血液抹片、血清诊断及分子诊断，但前述方法皆有其限制。
利用血液抹片镜检来检测典型细胞内寄生的犬艾利希体之桑葚胚对于艾利希体症的诊断是具有高度专一性的，然而此方法相当费时且不是非常可靠，因为在急性感染期间，桑葚胚在血液抹片中仅有小量的存在，而此镜检的灵敏度仅有约4％。
血清诊断则有助于辨识犬艾利希体抗体的存在，但可能无法侦测出疾病急性期的早期感染。血清诊断的限制更在于交叉反应，尤其常见于艾利希体属(ehrlichiaspp.)及无形体属(anaplasmaspp.)之间。此外，血清诊断也无法区分出是曾经感染(postexposure)或是正在感染(presentinfection)。
而诊断犬艾利希体最佳的方式便是分子诊断，尤其是利用聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,pcr)进行检测。聚合酶连锁反应是一种更灵敏且更具专一性的技术，提供了诊断犬艾利希体的另一替代方案。举例而言，由bioingentech公司所提供的犬艾利希体检测套组(vetpcrehrlichiacanisdetectionkit)可用来检测犬艾利希体感染，且诊断快速、准确及可靠。然而，此检测套组仍须结合终端pcr侦测方法，例如凝胶电泳(gelelectrophoresis)，使得整个检测过程需花费3小时，仍是相当费时及费力。
因此，提供一种可改善现有技术缺点之犬艾利希体诊断方法实为本领域技术人员需要努力的方向。
技术实现要素：
本申请的目的在于提供一种用以检测犬艾利希体(ehrlichiacanis)的引物对，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出犬艾利希体感染。
本申请的另一目的在于提供一种用以检测犬艾利希体(ehrlichiacanis)的套组，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出犬艾利希体感染。
本申请的又一目的在于提供一种用以检测犬艾利希体(ehrlichiacanis)的方法，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出犬艾利希体感染。
为达上述目的，本申请之一较广义实施方案为提供一种用以检测犬艾利希体(ehrlichiacanis)的引物对，包含一顺向引物及一逆向引物，其中，该顺向引物的序列为5’-attaatgtactatgctccaag-3’，该逆向引物的序列为5’-gttgagtttctttcttctttag-3’。该顺向引物及该逆向引物系用于实时聚合酶链锁反应(real-timepcr)。
又，本申请之另一较广义实施方案为提供一种用以检测犬艾利希体(ehrlichiacanis)的套组，包含一顺向引物、一逆向引物及一探针，其中，该顺向引物的序列为5’-attaatgtactatgctccaag-3’，该逆向引物的序列为5’-gttgagtttctttcttctttag-3’，以及该探针的序列为5’-actatacaagacgataacactggtagc-3’。该顺向引物、该逆向引物及该探针系用于实时聚合酶链锁反应(real-timepcr)。又，该探针的5’端接上报导染剂(reporterdye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。
又，本申请之另一较广义实施方案为提供一种用以检测犬艾利希体(ehrlichiacanis)的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增犬艾利希体(ehrlichiacanis)的核酸分子，且所采用之一顺向引物的序列为5’-attaatgtactatgctccaag-3’，一逆向引物的序列为5’-gttgagtttctttcttctttag-3’，以及一探针的序列为5’-actatacaagacgataacactggtagc-3’。该探针的5’端接上报导染剂(reporterdye)，且3’端接上淬灭体(quencher)。
【附图说明】
第1图显示顺向引物、逆向引物及探针对应于p30基因序列的位置。
第2图显示顺向引物、逆向引物及探针的dna序列。
第3a图及第3b图显示实时聚合酶链锁反应扩增结果的分析。
【实施方式】
体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的方案上具有各种的变化，其皆不脱离本申请的范围，且其中的说明及图示在本质上系当作说明之用，而非用以限制本申请。
本申请系利用实时聚合酶链锁反应(real-timepolymerasechainreaction，简称real-timepcr)，又称定量聚合酶链锁反应(quantitativepolymerasechainreaction，简称为q-pcr)来进行犬艾利希体(ehrlichiacanis)的检测，且采用探针侦测系统(probe-baseddetection)。首先，具有专一性的顺向引物、逆向引物及探针会杂合到犬艾利希体的目标dna上，探针的5’端接上报导染剂(reporterdye)，3’端接上淬灭体(quencher)。在pcr扩增反应过程中，探针会被切割，使得报导染剂与淬灭体分离，即可侦测到报导染剂所发出的荧光。在一实施例中，报导染剂为fam荧光基团，淬灭体为bhq1基团。
为确认所采用的pcr引物及探针对犬艾利希体具有专一性，利用美国国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation,ncbi)提供的primer-blast系统对前述包含顺向引物及逆向引物的引物对及探针进行比对，结果显示没有其他相近的物种具有与本申请设计的引物对及探针完全相同的序列。此结果也显示本申请的引物对及探针的专一性相当高，且只能用来扩增及检测犬艾利希体的p30基因。
因此，本申请提供了一种用以检测犬艾利希体的引物对，包含一顺向引物及一逆向引物，其中，该顺向引物的序列为5’-attaatgtactatgctccaag-3’，该逆向引物的序列为5’-gttgagtttctttcttctttag-3’。本申请同时提供一种用以检测犬艾利希体的套组，包含一顺向引物、一逆向引物及一探针，其中，该顺向引物的序列为5’-attaatgtactatgctccaag-3’，该逆向引物的序列为5’-gttgagtttctttcttctttag-3’，以及该探针的序列为5’-actatacaagacgataacactggtagc-3’。另一方面，本申请亦提供一种用以检测犬艾利希体的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应来扩增犬艾利希体的核酸分子，且所采用之一顺向引物的序列为5’-attaatgtactatgctccaag-3’，一逆向引物的序列为5’-gttgagtttctttcttctttag-3’，以及一探针的序列为5’-actatacaagacgataacactggtagc-3’。
在另一些实施例中，由于本申请之引物对可专一地检测犬艾利希体，故只要是位于顺向引物及逆向引物序列位置之间的序列，皆可设计为探针序列，因此，本申请提供之检测犬艾利希体的套组或方法亦可不限制采用前述的探针序列，且探针可选择杂合至dna的任一股上，故相同位置的互补序列皆可做为探针序列。因此，与前述探针序列互补的序列亦可做为本申请之探针序列。
以下将以实例说明利用本申请设计之引物对及探针进行犬艾利希体的检测。
首先，取200μl以edta保存的待测全血样品进行dna萃取，其系利用qiagen提供的萃取套组qiaampdnabloodminikit来萃取，并溶在100μl的冲提缓冲液中。接着进行实时聚合酶链锁反应，其系利用bio-rad实时聚合酶链锁反应机器(cfx96)来执行。pcr反应混合物中包含10μl的kapafastprobeuniversalmastermix，250nm的顺向引物及逆向引物，及250nm的探针，其中，顺向引物的序列为5’-attaatgtactatgctccaag-3’，逆向引物的序列为5’-gttgagtttctttcttctttag-3’，以及探针的序列为5’-actatacaagacgataacactggtagc-3’。将3μl的萃取dna模板加入至每一反应管中，并使总体积达20μl。pcr循环条件则先95℃3分钟，接着进行95℃3秒钟的变性(denaturation)及60℃20秒钟的黏合退火及延伸(extension)，重复40个循环。
阳性对照组(positivecontrol)系为具有犬艾利希体部分p30基因片段的选殖载体(rbccloningsystem)。将此重组dna质体制备一系列十倍稀释液，分别为10,102,103,104,105及106copies/μl的稀释液。每一稀释液系进行三次重复(triplicate)分析，以测定犬艾利希体dna侦测的下限，以及实时聚合酶链锁反应扩增的线性关系及效率。
第3a图及第3b图显示实时聚合酶链锁反应扩增结果的分析。第3a图显示不同拷贝数的质体样本的扩增曲线，可看出本申请的检测方法具有相当高的灵敏度。第3b图显示本申请的检测方法具有相当好的线性关系，其r2为0.998，非常接近最佳理论值1.0，因此，本申请的检测方法可进行定量分析，用以估计临床样本中基因的拷贝数。
综上所述，本申请提供一种检测犬艾利希体的方法，其系利用实时聚合酶链锁反应及具有特异性的引物对及探针来进行侦测。本申请提供之方法具有高灵敏性，可在无临床症状的感染案例中检测到小量的犬艾利希体。此外，早期或急性期的诊断对于犬艾利希体的治疗非常关键，有些研究显示当犬只在艾利希体症急性期即获得治疗的话，可在24至48小时内快速复原，且在接受完整疗程后之预后相当良好。又，本申请提供之方法更具有高专一性，可区别出犬艾利希体及其他蜱媒病原体，且有助于兽医师选择最适当的治疗方法。再者，对于治疗后复发的病症或是治疗失败的情形，本申请提供之方法亦可判断是否原始诊断有误，并降低输血感染。
纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由熟悉本领域技术人员任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附申请专利范围所欲保护者。