在MRD数据分析的实际应用中，主要存在2种方法：第一种，根据患者发病时的LAIP设计特异性的抗体组合，选择固定的门(gate)对特定的细胞群进行设门分析，例如对发病时具有CD10+CD38-LAIP特征的B-ALL患者，通常以CD19+细胞设门，重点分析是否存在CD10+CD38-细胞;第二种，始终以同系列相同分化阶段的正常细胞作为对照，在每次检测时观察是否存在与正常细胞表型不同的细胞群体，即"不同于正常细胞表型"(DFN)的方法。
二、MRD检测抗体选择及常用抗体组合推荐
基于MRD检测的方法不同，MRD检测时抗体组合的选择主要参照以下原则：①有初发LAIP可供参考时，尽可能多地将LAIP涉及的抗原包括在MRD检测的组合中。②对于没有初发时免疫表型的患者，治疗后如果需要检测MRD，只能参考同类型的白血病出现LAIP的频率，选择出现频率高的抗原及选取较多的抗体进行检测，以免漏检。
(一)MRD检测的抗体选择
1.B-ALL
2.T-ALL
在T-ALL中，CD5低表达多见，尤其在ETP(earlyTprecursoracutelymphocyticleukemia)中。CD2在pro-T-ALL中表达缺失，组合中最好同时包含这些抗原;由于CD2和CD7在NK和T淋巴细胞中都可以表达，而且部分NK细胞也可以表达cyCD3，因此MRD检测时最好加入CD56和(或)CD16以去除cyCD3+mCD3-NK细胞群体的干扰。如果T-ALL初发时表达CD56，则也可将CD56作为异常抗原。其他在T-ALL中表达而正常骨髓或外周血T淋巴细胞一般不表达的抗原，如CD13、CD33、CD117、CD11b和CD65等，则可以根据具体情况选用相同荧光素标记。CD44在T-ALL中常可见异常低表达，也可在MRD检测组合中使用。CD4和CD8在T-ALL中可以出现双阴性、双阳性或单阳性，在荧光通道有空余或者通过上述标志不能鉴别异常T淋巴细胞时，可选择这两种抗原。文献报道CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7治疗后表达较稳定，但要注意，只出现CD3、CD2、CD5、CD7表达强度异常，甚至CD4+CD8+，也可见于周围型淋巴瘤，只有结合初治时表型，或者同时具有其他幼稚T淋巴细胞的表型才能判断为MRD阳性。
3.AML
髓系原始细胞通常表现为CD34+CD117+或者CD34-CD117+，HLA-DR在髓系不同阶段和亚型中表达有所不同。因此，CD34、CD117、HLA-DR、CD45入选为AML的"骨架"抗体。另外CD13和CD33的表达情况可以较好地区分正常和异常造血，CD38在正常原始细胞中高表达，而白血病细胞中常见低表达，尤其是骨髓增生异常综合征转化的AML。
除上述抗原以外，交叉抗原对于区分正常和异常造血很重要，也应该入选，如CD56、CD19、CD2、CD4和CD5等。多个交叉抗原同时表达时可以选用同种荧光素标记。由于CD7在AML中表达较为特殊(正常髓系原始细胞中可见低表达)，建议单独标记。同时，初发时若存在非同步抗原表达如CD34+CD11b+、CD34+CD64+、CD34+CD15+等，MRD检测组合中也可将这些抗原入选。CD123在AML中可见表达明显上调，NG2的异常表达在AML中也有一定的发生频率，初发时如果阳性，这两种抗原也可入选。因为骨髓中CD34+细胞群体主要包含CD10+B系原始细胞和CD10-髓系原始细胞，如果检测通道有空余的话，建议AML的MRD检测组合中加入CD10，尤其是CD34+CD117low/-AML，去除CD10+CD34+B系原始细胞群体更有利于识别异常髓系原始细胞;同时也可以观察骨髓B系的重建状态。对于急性早幼粒细胞白血病(APL)而言，PML-RARα融合基因检测的特异性和灵敏度都显著高于FCM，在此不做特别的抗体推荐。
4.PCN
(二)MRD检测的抗体组合推荐
(一)检测样本的选择(骨髓、外周血)
由于不同类型恶性血液病的细胞起源、遗传学背景、生物学特征、药物敏感性等因素的影响，化疗后不同时期，骨髓和外周血中肿瘤细胞的清除速率存在不同程度的差异。
在AML的研究中发现，在化疗后早期(3~7d)，由于尚未达到形态学缓解，外周血中还存在一定负荷的肿瘤细胞，因此在早期采取创伤性较小的外周血检测，背景细胞的干扰很少，MRD检测的敏感性和特异性较高。通过计算肿瘤负荷下降的速度可以判断其对治疗方案的敏感性，对于疾病的预后分层有一定的指导意义。而在达到形态学缓解后，骨髓的检测要明显优于外周血检测，二者的检测敏感性至少相差一个对数级。
国外的大样本研究证实，T-ALL的MRD检测由于具有比较特异的LAIP，因此较易在骨髓和外周血中检出，T-ALL的MRD检测在外周血的检测敏感性大致接近或略低于骨髓(约减低1个对数级)，因此在治疗早期骨髓和外周血的检测敏感性接近。
在B-ALL的MRD检测对比研究中发现，外周血的MRD检测敏感性比同期骨髓减低了1~3个对数级，因此对于B-ALL的MRD检测建议首选骨髓。另外，由于儿童B-ALL治疗方案已实现标准化，并且方案中已纳入了MRD的指导策略，国外对于骨髓样本的抽取强烈推荐选取第一管骨髓，以避免在抽取过程中造成不同程度的外周血稀释，而且建议抽取量不宜过多(一般在2ml左右，<5ml)。当然，样本的留取量要保证检测的敏感性，如要达到10-5的检测敏感性，并以检出≥50个异常细胞为判断标准，则抽取细胞数需≥1×107。
3.检测频率
(三)检测阈值
2.检测阈值的界定：
MRD的检测敏感性通常由以下三个因素决定：①可重复地定量鉴定MRD阳性细胞群体的最小细胞数：这个阈值指的是最低定量限(LLOQ)，而不是最低检出限(LOD)。LLOQ=(可重复地定量鉴定MRD阳性群体的最小细胞数/总细胞数)×100%。国际上的研究认为20个细胞是LOD的比较保守的值，考虑到计数误差，以95%可信限上限作为标准，LOD=30/获取细胞数×100%。而50个细胞是普遍接受的可重复定量检测的最低细胞数，因此LLOQ=50/获取细胞数×100%。如果获取500000个细胞，则LOD和LLOQ分别为0.006%和0.01%。②LAIP的特异性：指区分正常与异常造血的能力，所选LAIP在正常骨髓中的本底水平越低，则特异性越好。③获取的总细胞数：特异性足够好的话，理论上获取的细胞总数越高，敏感性就越高。文献报道获取细胞总数达5×106时，ALL和PCNMRD检测的敏感性均可达10-5。对于AML，由于多数患者的LAIP特异性较低，目前普遍认为敏感性只能达到10-3，但是如果LAIP的特异性较高时，有一部分AML患者的敏感性可以达到10-4，部分患者甚至可以达到10-5。
LAIP特异性是影响MRD阈值界定的关键因素。依据特异性不同，可将LAIP分为2种类型：一种是在正常骨髓中完全不存在而只在白血病细胞上存在的表型，例如抗原表达增强、减弱或缺失，这类LAIP与正常细胞发育轨迹完全没有重叠，因而具有较高的特异性和敏感性。第二种LAIP是在正常骨髓中存在较低水平的表达，例如AML中存在髓系幼稚细胞低水平表达CD7或CD2、CD34-CD117+CD11b+表型、CD34+CD33+CD56+表型等，这类表型在化疗后的骨髓恢复期或者外源性生长因子治疗后的正常髓系幼稚细胞上均有可能出现，因而导致其背景值(或噪音)增高，特异性和敏感性降低;而且，不同的LAIP在正常骨髓中表达的背景值也是不同的，因此，需要根据它们在正常骨髓幼稚细胞中表达的中位值来分别确定MRD检测的cutoff值。
四、MRD检测的质量控制与标准化
除去前面提到的多种因素外，FCM的质控也至关重要。如果质控做得不好，直接影响结果的准确性和特异性，因此将质控也纳入本共识中。本共识仅根据MRD检测的特殊性提出以下注意事项，具体的细则还需参照《白血病/淋巴瘤免疫分型检测质量控制指南》。
(一)检测体系的标准化
1.仪器的标准化及调整频率：
(1)光路校准：每天1次(一般为开机后)利用微球校准散射光和荧光(强度和CV值)。对于拥有多台流式细胞仪的实验室，不同仪器之间(包括同一型号)应进行平行比较，每6个月1次。用不同的仪器检测同一份样本(MRD水平接近LOD)，所测得的结果CV值不应超过30%。
(2)荧光补偿校准：荧光补偿与流式细胞仪光电倍增管的电压、增益，激光功率，光学滤片等有关，这些参数有变动时必须马上调整补偿值。
(3)预防交叉污染：检测交叉污染(carryover)的方法：依次检测以下样本：MRD接近LOD(≈0.01%)→较高水平MRD→MRD接近LOD，观察前后两次MRD低水平标本结果的一致性;两管之间的交叉污染不能超过检测特异性;交叉污染严重时，应在每个测试管之间插入装有清洁水(三蒸水、去离子水等)的管子进行冲洗，自动上样或孔板上样时尤其要注意。
2.方法学准确性：
(1)精确度/重复性：将已知数量的异常细胞混入正常骨髓标本中，3复管进行检测，计算CV%，最好<10%。当MRD水平很低(如接近LOD)时，<30%也可以接受。
(2)特异性和敏感性：详见第二、第三部分。
(4)数据收集：①建议每管中加入待标记的白细胞总数为2×106，上机获取1×106个白细胞。对于MRD检测敏感性要求更高的实验室，如预期敏感性为1×10-5时，则获取细胞总数需达2×106。②本共识推荐使用全血或全骨髓溶血标记法。根据预计待标记细胞数量确定所需标本体积：所需标本体积≤100μl时，染色后进行红细胞裂解;标本体积>100μl时，先裂解红细胞(注意选用不含固定成分的红细胞裂解液，例如氯化铵裂解液)，离心富集于100μl体系中，方可进行混合抗体染色。具体的抗体组合优化及染色步骤可参照《白血病/淋巴瘤免疫分型检测质量控制指南》。
(二)检测流程的标准化
1.在开展MRD检测项目前，必须利用相同的抗体组合至少分析20份正常对照标本的抗原表达模式，建立正常骨髓发育模板。正常对照标本应包含正常和重建(化疗后或移植后)骨髓。同时计算每种LAIP在正常骨髓中的本底水平(背景值)，MRD检测时对于某种LAIP而言，只有比例高于该水平才能认为MRD阳性。
2.对于有初发免疫分型结果的患者，首选初发时筛选出的异常抗原(尽可能同时监测多种LAIP)，对治疗后的骨髓标本进行分析。注意分析是否存在发病时LAIP+细胞，同时利用"DFN"的方法观察是否存在发生免疫表型变异或克隆转化的异常细胞群体。
3.如果发病时没有进行免疫分型检测，治疗后每次进行MRD检测时，都需要遵循"DFN"方法，选择较多的抗体，针对同类型白血病出现异常表达频率较高的标志进行检测。
(三)数据分析与报告模式的标准化
1.数据分析：
(1)初步设门：利用CD45/Time散点图选取液流稳定的区间;利用FSC-Height/FSC-Area和SSC-Height/SSC-Area(或FS-INT/FS-PEAK和SS-INT/SS-PEAK)散点图去除黏连体;利用FSC-Area/SSC-Area散点图去除碎片;先利用特定系列广泛表达的抗原/SSC-Area散点图圈定该系列所有细胞区域，如CD19/SSC、cyCD3/SSC、CD117/SSC圈定所有B淋巴细胞、T淋巴细胞群体及幼稚髓细胞群体，用CD38/CD138散点图圈定所有浆细胞群体;再利用CD19/CD45、cyCD3/CD45、CD117/CD45去除非特异性细胞。
图11例急性髓系白血病患者获得完全缓解后的微小残留病检测设门策略
图21例急性B淋巴细胞白血病(A)、急性T淋巴细胞白血病(B)和多发性骨髓瘤(C)患者获得完全缓解后的微小残留病检测结果
(3)MRD水平的计算：计算MRD定量结果的方法为异常细胞占所有白细胞或有核细胞的百分比。当异常细胞不表达CD45时(如PCN或部分B-ALL细胞)，白细胞数量应包含CD45阳性白细胞和阴性区的异常细胞，该计算方法不受红细胞裂解效果和碎片的影响。有核细胞不仅包含白细胞数量，也包括骨髓中的其他有核成分如有核红细胞，该计算方法受红细胞裂解效果影响较大，裂解过头则分母偏小，裂解不彻底则分母偏大。利用有核细胞总数作为分母时，建议在反应体系中加入核酸染料(如Syto-16)以准确圈定有核细胞群体，防止成熟红细胞以及碎片等非有核成分造成分母偏大。
2.报告内容及报告形式：
(1)报告内容：①检测报告中首先包含患者及标本信息，标本如有凝块，特殊原因未能及时检测或稀释等情况均应注明。②MRD结果报告为"阳性"或"利用所选抗体组合，本次检测未识别出免疫表型异常细胞"。③MRD如果为阳性，应描述报告所见异常细胞数量及异常细胞占白细胞或有核细胞百分比，并描述异常细胞的免疫表型，以对应的正常造血细胞为参照，描述异常细胞的各种抗原表达与否以及表达强度，散射光(FSC和SSC)信号有异常时也应提示。④报告获取的白细胞或有核细胞总数。同时报告方法学LOD和(或)LLOQ。⑤报告中应出具一系列散点图，显示异常(亮色突出)和正常细胞群体的抗原表达及散射光信号。⑥其他内容：MRD报告中应显示抗体组合(包括荧光素)、样本制备方法以及仪器型号。注明红细胞裂解方法，以及有核细胞计数时是否利用核酸染料染色等。尽可能描述骨髓中正常细胞组分，以反映骨髓重建状态。
(2)报告形式示例：
以图1所示的病例为例，报告内容如下：
患者及标本信息：略。
仪器型号：NAVIOS(Beckman-Coulter公司，3激光10色)。
样本制备方法：全骨髓溶血法(氯化铵溶血素：实验室自行配制)。
MRD检测选用抗体组合：CD38/CD56/CD34/CD33/CD117/CD13/HLA-DR/CD10/CD45(标记荧光素种类见图中标示)。
散点图：见图1。
结果：共获取476670个白细胞(LOD=30/476670×100%=0.006%，LLOQ=50/476670×100%=0.01%)，异常细胞占1.07%(5085个)。
异常免疫表型：CD117+CD34briCD38lowCD56+CD45low，CD13和CD33表达丧失异质性，为异常髓系原始细胞(见上图红色细胞群体)。
其他：可见正常CD10+幼稚B淋巴细胞(1.0%，上图黄色细胞群)和正常CD34+CD117+髓系原始细胞(0.63%，上图绿色细胞群)。
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