多家公司在研的伪狂犬亚单位疫苗已经进入临床试验阶段，离上市越来越近了。继圆环亚单位、猪瘟E2亚单位疫苗成功上市之后，伪狂犬亚单位是否能够再次刷新大家对亚单位疫苗的期待，在伪狂犬防控和净化发挥独特的作用呢？
本文看点：
1.保护效果：gD或gB+D免疫一次的仔猪用106.6TCID50的PRV-HNLH突变毒株攻毒后，没有出现临床症状、发热和排毒、组织（大脑、肺脏）带毒。相反，gB或灭活苗免疫仔猪出现临床症状、发热和排毒、组织（大脑、肺脏）带毒。
2.中和抗体：gB免疫仔猪中没有诱导出中和抗体，而gD免疫仔猪的中和抗体维持在2的5次方以上，一直持续至12周，远远高于全病毒灭活苗组（图5d）。这一发现再次提醒我们，评估伪狂犬活苗或者灭活苗免疫效果，使用gBELISA抗体试剂盒的局限性。在疫苗抗体监测方面，可能更需要的gD抗体的ELISA试剂盒。
3.细胞免疫：淋巴细胞增殖试验和IFN-γ水平显示，gB组的T细胞的免疫反应比其他组更强烈（图5c）。细胞免疫作为活苗免疫的主要保护性机制，在伪狂犬临床症状的消除方面发挥重要的作用，但其评估一直存在技术性难度。
4.本研究提示，gB抗原能够刺激产生强烈的细胞免疫，而gD抗原诱导产生很高的中和抗体，gB+D二价疫苗的表现可能更优，可以作为控制PRV的主要候选疫苗。
gD亚单位疫苗一次免疫就能抵抗伪狂犬病毒感染
AsingledoseglycoproteinD-basedsubunitvaccineagainstpseudorabiesvirusinfection
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摘要
1简介
在PRV的囊膜上，由UL27、UL44和US6基因编码的gB、gC和gD是最丰富的糖蛋白。另外，gB和gD对病毒和细胞膜或囊膜的融合是必不可少的，这也是α-疱疹病毒进入宿主细胞的必要条件。gC在融合过程中也起着重要作用，gC使病毒附着在细胞表面的硫酸肝素上，然后与其受体结合并置换C端结构域（PFD）以激活gB的融合。最后，在gH和gL异二聚体的帮助下完成融合。
已经证实，对于gB和gD产生的抗体可以保护猪免受PRV的致命感染。此外，gC也显示出对病毒的感染具有良好保护作用。然而，由于20世纪90年代基因工程技术的限制，从PRV病毒中获得这些蛋白的成本太高，劳动强度大，无法用于商业生产。
近年来，具有高纯度和免疫原性的亚单位疫苗在一些病毒疫苗中得到了大量的研究和应用，如乙肝、人乳头瘤病毒、猪圆环病毒2型和经典猪瘟病毒等。然而，很少有针对PRV的亚单位疫苗被开发。
为了开发更有效的针对于PRV变异株的疫苗，我们在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中表达了gB、gC和gD，并评估了它们的免疫原性和有效性，包括中和抗体（NA）滴度、存活率、临床症状、病毒载量、排毒和病理以及细胞因子的产生。结果显示，gB可以有效的诱导NA，并对小鼠的致命性感染提供全面保护，但对猪则没有；gD可以诱导有效的NA，并明显降低小鼠和猪的感染率。总的来说，我们的结果表明，gD亚单位疫苗可能是控制PRV的一个有希望的候选疫苗。
2材料方法
2.1.病毒和细胞
Vero细胞（本实验室存放），在含有10%的胎牛血清（FBS；赛默飞）的DMEM培养基（索莱宝）37C的5%CO2培养箱中培养。Sf21细胞（本实验室存放），在Sf-900II无血清培养基（SFM，赛默飞）中，28℃振荡培养箱中培养。PRV毒株HN-LH（本实验室存放），在动物实验中被证明为高致病性的PRV毒株，一个新的系统发育分析中的变异毒株。
2.2.表达质粒的构建和蛋白的制备
完成基因测序后，PRV毒株HN1201（GenBank:KP722022）的gB、gC和gD基因的DNA序列由生工生物公司合成。通过PCR扩增gB、gC和gD基因，然后设计gp67信号序列和6×His标签，在每个片段的N端和C端设计了6个引物（表1）。扩增产物通过BamHI和XhoI酶切后连接到pFastBacI载体中，并命名为pFastBac-gB、pFastBac-gC和pFastBac-gD。
所有的蛋白质都用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行表达。将重组质粒pFastBac-gB、pFastBac-gC和pFastBac-gD转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，构建重组杆状病毒。重组杆状病毒用来感染sf21细胞以生产大规模可溶性蛋白。三种蛋白通过His标签蛋白纯化树脂（GE）纯化，然后通过预填充柱（GE），通过免疫印迹试验、凝胶电泳和质谱分析，验证这三种蛋白的纯度。
2.3.小鼠疫苗免疫和攻毒
四周大的雌性巴比赛小鼠（n=72）随机分为9组，经过适应后，两组用等量的PBS和伪狂犬全病毒灭活苗（PCIV,武汉科前生物公司）进行免疫，gB、gC和gD组分别用30uggB、gC和gD蛋白免疫；gB+D组用30uggB和gD蛋白（各15ug）；gB+C组用30uggB和gC蛋白（各15ug）；gC+D组用30uggC和gD蛋白（各15ug）；gB+C+D用30uggB、gC和gD蛋白（各10ug）。所有组均在0和14天进行两次免疫，并在35天时用PRVHN-LH株（5LD50/每只老鼠）进行攻毒。每周采集尾静脉血样，攻毒后，每天观察小鼠，对其临床症状进行评分：1、免疫点瘙痒，强烈抓咬；2、烦躁不安，毛皮杂乱；3、自残行为，注射点皮肤被咬掉，精神萎靡；4、奄奄一息或死亡。
2.4.仔猪疫苗免疫和攻毒
将未感染猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、经典猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）的10周龄猪（n=32）随机分为6组（五组n=6，对照组n=2），通过耳标追踪。实验期间，每组都被放置在一个单独的栋舍。适应一周后，gB组注射25uggB；gD组注射25uggD；gB+D组每头注射25uggB和gD（各12.5ug）；PBS组和PCIV（灭活苗）组每头分别注射等量PBS和PCIV。最后两头猪作为对照组，没有免疫，也没有攻毒。免疫后四周，所有免疫疫苗的猪都用106.6TCID50PRV-HNLH毒株的攻毒。
攻毒前，每星期采一次血清样本。攻毒后，每隔一天采一次血清样本，每天观测临床症状和直肠温度，直到攻毒后14日。攻毒后每天收集口咽液（OPF）样本，直至攻毒后14日，用于监测排毒。在攻毒后10天，随机选择所有组别中的三头仔猪，并对其进行安乐死。采集大脑、小脑、扁桃体和肺，一半用4%（w/v）多聚甲醛固定，另一半保存在-80℃。所有血清用猪伪狂犬病病毒gI(gE)抗体检测试剂盒(爱德士)进行检测。
2.5.猪体内中和抗体的持久性
四周龄的猪（n=12），无PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV感染，随机分为三个组。在实验过程中，每组被安置在一个单独的房间里，适应一周，颈部肌肉注射中用PBS、gB25ug/头和gD25ug/头进行一次免疫，每两周收集一次血清，所有血清用猪伪狂犬病病毒gI(gE)抗体检测试剂盒(爱德士)进行检测。
2.6.中和试验
血清样本56℃灭活30分钟，用于在Vero细胞上进行中和试验。将血清稀释2倍，与100TCID50PRV病毒在37℃下培养1小时，加入含Vero细胞的96孔板中培养2天。通过IPMA与PRV-gE单克隆体（本实验室保存）观察细胞病变效应（CPE），在50%的孔内中和病毒的最高稀释倍数。
2.7.淋巴细胞的分离和刺激
根据产品说明书，用羟丙基甲基纤维素（索莱宝）从攻毒前7天和攻毒后4天的肝素钠的血清样本中分离出淋巴细胞。使用台盼蓝染色对细胞进行计数，评估细胞活力。将总共106个细胞/孔一式三份免疫到96孔板中，用100TCID50PRV病毒或等渗DMEM刺激，在37摄氏度下培养72小时，加入CCK-8（10ul/孔），在37摄氏度下再培养2小时，在450nm处测量吸光度。T淋巴细胞增殖用刺激指数（SI）表示，等于未刺激孔的平均读数/DMEM孔的平均读数。
2.8.INF-γELISA和排毒
根据提供的说明，使用市售的ELISA试剂盒（索莱宝，中国）检测攻毒前7天和攻毒后4天的血清中的IFN-γ水平。
使用宝生物工程公司的MiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0提取OPF样本的病毒DNA，引物（50-TCCACTCGCAGCTTCT-30和50-GCACGTCATCACGAAGGA-30）进行PCR检测。
2.9.病毒载量的定量
在无菌条件下，将100毫克的大脑、小脑、肺和扁桃体切成小块置于灭菌的PBS中充分研磨（重量/体积=1:3）。完全研磨后，将组织在PBS中的悬浮液在-20℃冷冻，并在37℃下冻融三次，在4℃下以8000转的速度离心10分钟，收集上清液并通过0.22um的滤器进行过滤。使用宝生物工程公司MiniBESTUniversalGenomicDNAExtrac-tionKitVer.5.0提取样本的DNA，于-20℃保存，用引物（50-TGCAGCTACACCCTCGTCC-30和50-TCAAAACAGGTGGTTGCAGTAAA-30）扩增出UL54片段，大小为65bp。荧光定量PCR是使用罗氏FastStartUniversalSYBRgreenmaster（ROX）试剂进行的快速实时荧光定量PCR。
2.10组织病理和免疫组化
每组每头猪抽取三份有代表性的样本，经4%甲醛固化的组织中切下，并处理成小块。根据说明书将大约3-4um厚的切片用苏木素-伊红染色法进行染色。
每组每头猪的三个组织切片进行脱蜡和清洗，然后在3%的H2O2中保持20分钟，然后在37℃下用10%的马血清阻断1小时。切片用PBS洗三次，在PRV-gD单克隆抗体10F7（PBS中1:200稀释；实验室储存）中孵化30分钟，然后4℃过夜。然后，用PBS洗三次以去除多余的抗体，并在37℃下用辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG（1:500；杰克逊免疫研究公司，115-035-003）孵育1小时；然后用PBS再次洗三次。根据说明书，用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒（天根生物，北京，中国）对抗体结合进行可视化。使用DMI3000B徕卡显微镜（徕卡,韦茨拉尔,德国）收集图像，每个切片的感染细胞百分比由五个随机的不同视野计算出来的（每个视野计数300个细胞）。
所有动物实验均经河南省农业科学院动物实验委员会批准，批准号为LLSC1009605和LLSC1009618。所有的动物都中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会（IACUC）的动物伦理学程序和指南，符合良好动物行为的人道关怀。
3结果
3.1.gB、gC、gD的表达和纯化
3.2.对小鼠用PRV-HNLH毒株攻毒的保护
为了评估小鼠免疫后对当前流行毒株的保护作用，将30ug的gB、gC和gD注入小鼠体内两次，一次在第1天，另一次在第14天。然后，小鼠皮下注射5LD50的PRV-HNLH毒株（本实验室证明为新的变异毒株），在二免后的三周末进行攻毒（图1b）。免疫后14天，gB和gD免疫的小鼠的血清中首次检测到中和抗体（图1a）。免疫后21天，gC免疫的小鼠血清中检测到中和抗体。总的来说，gB、gC和gD诱导中和抗体的速度比灭活苗（PCIV）的小鼠快，灭活苗在二免后14天产生中和抗体（图1a）。用gB、gC和gD免疫的小鼠的中和抗体均在加强免疫后14天达到峰值，然后缓慢下降（图1b）。gD组的中和抗体滴度（25.5）明显高于gB组（23.25）、gC组（22.25）和灭活苗组（22.75）（图1a和b）。在5LD50PRV-NLH攻毒后，注射gB和gD的小鼠存活率分别为100%和87.5%，明显高于gC组（50%），然而，注射PBS的小鼠只有12.5%存活（图1d）。攻毒后三天，观察到以下临床症状：免疫部位瘙痒与强烈的咬伤，注射部位的皮肤被咬掉并坏死，攻毒后第七天，一只用gD免疫的小鼠死亡，gB组没有小鼠死亡，gC组有4只小鼠死亡，而PBS组有7只小鼠死亡（图1c和d）。总的来说，我们发现在小鼠的保护力方面，gB和gD优于gC。
3.3.猪的免疫原性和攻毒保护
为了确定gB和gD是否能诱导足够的免疫反应并保护猪免受挑战，我们在猪体内肌注了25ug的gB、gD或50:50的gB和gD的组合。与其他组相比，从免疫后7天到攻毒为止，gD以及gB+gD联合免疫的猪体内检测到的PRV特异性中和抗体的滴度具有统计学意义。然而，单独使用gB免疫的猪的血清中没有检测到中和抗体（图2a）。攻毒后，注射gB和灭活苗的猪的血清中中和抗体滴度缓慢增加，这可能是病毒感染的结果（补充图3）。用gD和gB+D免疫的猪的血清中的中和抗体在维持了8天的高水平后进一步增加，直到14天；gD组猪血清的NA值仍明显高于PBS和gB组（补充图3）。
图2.猪的免疫效果。10周大的猪（n=32）随机分为6组（每组n=6，正常组n=2）。gB组被注射了25uggB；gD组：25uggD；gB+D组：25uggB和gD（各12.5ug）；PBS和灭活苗组：同等的PBS和灭活苗。所有免疫猪只都在第28天时攻毒，定期监测血清中的中和抗体（a）和直肠温度变化（b）（n=6）。使用GraphPadPrism软件进行分析（***p值<0.001）。
此外，在攻毒106.6TCID50的PRV-HNLH后，所有被攻毒的猪的直肠温度上升了4天，然后开始下降。不同组的免疫猪的发热情况见图2b。用PBS、gB和灭活苗免疫的仔猪的直肠温度（40.7-42.1℃）都超过了40.5℃，而gD和gB+D组的仔猪的直肠温度则没有升高（39.5-40.3C）。为了检测排毒情况，从口咽液（OPF）样本中提取病毒DNA，用PRV-gE特异性引物进行扩增。攻毒后，第1天至14天，gD或gB+D免疫的猪没检测到排毒，而PBS组的仔猪在第4天至8天检测到排毒，gB组第4天到第6天检测到排毒。在灭活苗组中，猪从第5天到第7天均检测到排毒（表1）。最后，在对照组中，任何时候均未检测到排毒。
对于gE抗体，用gD或gB+D免疫的猪的血清，第14天前都是阴性的；用PBS免疫的猪的所有血清样本从第10天到第14天均为阳性；在gB免疫组中，一头仔猪在第10天时转为阳性；在灭活苗组中，两头猪第10天时为阳性，并有一头猪第12和14天时为阳性。在整个过程中，对照组的猪血清均为阴性（表2）。
3.4.病毒在组织中的复制和免疫组化
为了分析不同组织的感染水平，每组随机选择3头仔猪，在第10天安乐死，收集大脑、小脑、扁桃体和肺部，每个器官的一部分于-80摄氏度保存，用于荧光定量PCR分析，确定PRV的病毒载量；每个组织的另一部分在4%（w/v）多聚甲醛中固定，用于免疫组化和组织病理学检查。结果显示，用gD、gB+D和灭活苗免疫的猪的组织中几乎检测不到病毒DNA，而PBS组的大脑（8×102Copies/mg）和肺部（4×102Copies/mg）检测到病毒（图3a）。由于检测量的限制（102Copies/mg），在小脑和扁桃体中没有检测到病毒。免疫组化检查显示，gD组（图3b中）和gB+D组（图3b右）的组织几乎没有被感染的细胞，说明受病毒感染损伤非常小。相比之下，在PBS组，几乎所有的细胞都被感染了（图3b左）。总的来说，gD和gB+D组的受感染的细胞百分比最小，其次为灭活苗组和gB组的肺部和大脑（补充图4）。
为了准确评估保护作用，对感染率进行了分析。经过统计分析，与PBS组（90.3%和78.9%）、gB组（42.3%和30.3%）和灭活苗组（45.7%和16.7%）相比，gD组（10.6%和6.8%）和gB+D组（9.8%和5.8%）的大脑和肺部的感染率明显下降（图3c）。
图3.猪组织中PRV基因组的定量和免疫组化。用UL54引物对猪组织中的PRVDNA进行荧光定量PCR。。PRV载量（a）显示为每毫克组织的拷贝数。用PBS（左）、gD（中）和gBD（右）免疫的猪的肺部和大脑（b）进行了免疫组化检查（比例：100um）。感染率对用PBS、gB、gD、gB+D和灭活苗免疫的猪的大脑和肺部感染细胞的百分比（c）进行了统计分析（n=3）。使用GraphPadPrism软件对数据进行分析（**p<0.01，***p<0.001）。
3.5.免疫猪和攻毒猪的代表性器官的组织病理学分析
每组中抽取3头猪的组织（大脑、小脑、肺和扁桃体）样品，经苏木精-伊红（H&E）染色后进行组织病理学检查，分析PRV-HNLH攻毒后的组织损伤程度。gD（图4b、e、h和k）和gB+D组（图4c、f、i和l）猪的组织没有明显的病理损伤。PBS组，大脑中的血管扩张和充血（图4a）。此外，在PBS组的小脑中观察到无序的浦肯野氏细胞和血管周围的袖套现象（图4d），肺部充血（图4g），扁桃体坏死（图4j）。与gD组和gB+D组相比，灭活苗组和gB组（补充图5）的病理损伤更为严重，但灭活苗组和gB组对病毒损伤的保护作用优于PBS组。
图4.疫苗免疫的猪和攻毒后的猪的代表性器官的组织病理学。PBS（a）、gD组（b）和gB+D组（c）的脑组织，PBS（d）、gD组（e）和gB+D组（f）的小脑组织。PBS（d），gD组（e）和gB+D组（f），PBS（g），gD组（h）和gB+D组（i）的肺组织，以及PBS（j），gD组（k）和gB+D组（l）的扁桃体组织。在10个月大时采集扁桃体组织，切成3-4um的片状，用H&E染色，在20×放大镜下分析。比例：100um
为了评估免疫效果，从血清中分离淋巴细胞，进行T淋巴细胞增殖试验。结果显示，在攻毒前后，gB和gB+D免疫的猪的淋巴细胞的产生比PBS组多（图5a）。为了评估T细胞的反应，我们评估了攻毒前7天和攻毒后4天血清中的IFN-γ水平。gB和gB+D疫苗的猪的IFN-γ水平明显高于PBS和gD组（图5b）。
4讨论
PRV在全世界的猪场流行了近100年，给一些国家的养猪业带来了相当大的经济损失。以前的研究表明，PRV非净化猪场相比PRV净化猪场每年多损失802万元人民币。最近在中国报道的人类感染PRV，表明PRV可能对公共卫生构成重大威胁。因此，净化PRV不仅可以带来经济效益，而且对公共卫生和安全也很重要。
自2011年底以来，尽管免疫了Barthak-61疫苗，但PRV的变异株开始出现。研究表明，新毒株可能是由疫苗和野生毒株之间的基因重组造成的，这大大加强了病毒的毒力。因此，我们迫切的需要一种新型、安全并且有效的疫苗。在本研究中，我们获得了高纯度的gB、gC和gD抗原，评估了其对小鼠和猪的保护效力。
为了引起强大的免疫反应，抗原的糖基化是必须的，尤其是对于糖蛋白。因此，我们用Bac-to-Bac杆状病毒系统中表达了这三种糖蛋白，以便蛋白翻译后可以进行更好的修饰。本研究中表达的gB、gC和gD的分子质量预期分别为78.1kDa、45.8kDa和38.4kDa，但表达后的分子质量分别为100kDa（补充图1d）、63kDa（补充图1e）和48kDa（补充图1f），说明这些成熟的蛋白发生了翻译后的修饰。
在最初的动物实验中，我们参考了以前的研究，共用100uggD（gp50）免疫猪。为了刺激更好的免疫效果，我们对小鼠免疫了总共30ug的蛋白，然而，基于免疫评估的结果，重组蛋白gB和gD表现出较高的免疫原性；因此，我们减少了免疫剂量，在仔猪上使用了25ug。一般来说，在野毒攻毒后，动物的中和抗体的水平会迅速增加。然而，如图1b所示，中和抗体首先下降，然后在用蛋白免疫的组中增加。攻毒之前，抗原免疫诱导的高滴度中和抗体可能被野毒攻毒引起的中和抗体上升所掩盖或延迟。如图1所示，我们发现灭活苗组的中和抗体迅速上升。相反，小鼠在攻毒前没有产生任何的中和抗体。为了研究gB、gC和gD的免疫协同作用，用这三种蛋白的抗原混合物对小鼠进行免疫，gB+D组的中和抗体滴度明显高于gB+C和gB+D组，这种情况从第35天持续到第70天（补充图2a）。gB+D组小鼠的存活率（100%）高于gB+C组（75%）和gC+D组（62.5%）（补充图2b），表明gB和gD对小鼠PRV感染提供了更有效的免疫保护。此外，用gB和gD免疫的小鼠的存活率明显高于gC，这意味着gB和gD是更有效的亚单位候选疫苗，这三种蛋白之间没有明显的免疫协同作用。因此，我们进一步评估了gB和gD对猪的免疫效应。
尽管一些研究表明，在小鼠中gB可以诱导PRV针对性的保护性抗体，但在猪中是否能达到同样的免疫效果仍是未知数。在本研究中，结果显示，gB在仔猪中没有诱导出中和抗体。然而，荧光定量PCR和免疫组化及组织病理学分析显示，gB组的病毒载量也有所下降，这表明gB可能诱导细胞免疫。进一步分析淋巴细胞增殖和IFN-γ水平显示，gB组的淋巴细胞刺激指数和IFN-γ水平明显更高，这意味着gB组的T细胞的免疫反应比其他组更有效地呈现出来（图5c）。
总之，本研究获得的gD可以诱导有效的中和抗体并明显降低小鼠和猪的感染率。此外，gD可以减少不同组织中的病毒量和病理病变，这表明gD可以作为控制PRV的主要候选疫苗。
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