13、本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行
19、又较差，不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液。因此，根据公式A=bC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为A/bC。假设，葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5L，酶试剂加入量为335L，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光
20、系数=6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的为6220。（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。最常用色素原底物及其产物为:ALP测定以磷酸对硝基苯酚(4-Nitrophenylphosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以-L-谷氨酰对硝基苯胺(-L
21、-Glutamyl-p-nitroanilide)或-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid，ANBA)。对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm)。下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。试剂：4-NP标准储存液(1Ommo1/L)。4-NP标准应用液(
22、2.5mmo1/L，以0.84mol/LAMP缓冲液稀释而成)。底物缓冲液(l5mmol/L4-NPP配于0.84mol/LAMP-HCL缓冲液中，37,pHl0.09土0.02)。测定方法：4-NP标准液加入量为5L，底物缓冲液加入量为350L，波长405nm，光径0.7cm，温度37，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度A=A1-A2，若测得A为0.460，则实测4-NP摩尔吸光系数186622校准K值酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度
23、检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。一般来说以使用校准K值为好，但必须有两个先决条件：必须使用配套的试剂；必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果。关于酶活性标准品，欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物，但目前尚无公认的标准（校准）品问世。（四）透射比浊法抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmissionturbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定
24、。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。使用散射比浊法（scatterturbidimetry）能更加准确快速地检测抗原抗体形成浊度的大小或其速度，目前专用的特定蛋白分析仪可做此法检测。有关免疫比浊法原理详见第二章。二、常用生化检测项目分析方法举例1终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）
26、如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。第三章常用生化检测项目分析方法举例及参数设置一、常用生化检测项目分析方法举例1终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均
28、储器里，用户不能修改。各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。1试验名称试验名称（testcode）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。2方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。3反应温度一般
29、有30、37可供选择，通常固定为37。4主波长主波长（primarywavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。5次波长次波长（secondarywavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。6反应方向反应方向（responsedirection）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。7样品量样品量（samplingvolum）一般是2l35l，以0.1l步进，个别分析仪最少能达到1.6l。可设置常量、减量和增量。8第一试剂量第一试剂量（firstregengtvolum）
32、ange），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。17小数点位数检测结果的小数点位数（decimalpointdigit）。（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。1样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。2底物耗尽值底物耗尽值（substrateexhaustlimit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。
33、3前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别（A）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。4试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。5试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。6方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。7参考值范围对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。（三）某些参数的特殊意义1最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2l，目前也有小
34、至1.6l的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。2最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10l，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。3弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期
37、生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。（三）次波长的确定方法当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。（四）双波长的具体应用对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长
39、某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。若先加入缺乏-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。1试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂
40、空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。试剂空白的测定方法有两种：每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。2试剂空白变化速率监测一些酶试剂在反应温度下不
43、算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。5底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图7-96方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自
44、动将样品减量或增量重新测定。第四章标准品和校准品传统的临床检验，要使检验结果可靠或有依据，往往有一个标准品(Standard)。以临床化学检验的比色测定为例，常作三个检测：空白、标准、测定。用空白液调整吸光度为零，读出测定比色液和标准比色液的吸光度，分别为As和Au；已知标准液浓度为Cs。在一定范围内，某分析物浓度和吸光度呈良好比例关系。为了克服纯标准液和病人样品间的基体差异，20年前开始引用具有与病人样品基体相似的校准品替代标准品，用于日常工作。由于以往在使用标准品时不强调它的专用性，国内在应用校准品时忽略了它的专用性。任何方法或仪器、试剂使用一个校准品，严重影响检验质量。一、标准液的定值一
45、般而言，检验工作使用的标准品属应用标准。配制或供应这类标准品的实验室或厂商具有符合质量标准的纯品。称取一定量的纯品，然后将其溶解，在容量瓶内用溶剂稀释至容积刻度，混匀，标准液配制完成。由称量法获得的称量值和容量法配制的容积，计算出该标准品浓度。检定部门抽样测定，结果在规定范围内属合格。即使测定检定结果在范围的上、下限，也不能将实测值作为标准值。因为测定值的可靠性取决于检定方法，一般的分析方法的可靠性不如分析化学公认的称量法和容量法。所以标准品的定值由称量和容积计算确定。检定不合格即报废，决不可将实测值替代修正。二、校准品的定值1校准值随方法而异如前述，由于纯标准液和新鲜病人标本间的基体差异，以
48、160;三、原则上，以具有参考值的新鲜病人标本去校准某检测系列（包括方法、试剂、仪器）后，检测系列再去检测候选的校准品（处理过），得到的检测值为初始校准值。以初始校准值反过来再校准组合的检测系列后，该检测系列又去检测病人的新鲜标本。观察病人标本的检测值是否和参考方法的测定值具良好的可比性。实践说明，只有不断地调整校准值，直至用该校准值校准指定的检测系列（加上具有校准值的校准品，即组合成检测系统）后，检测系统再检测病人标本，得到的测定值和病人标本的参考方法测定值具有满意的可比性（测定值和参考值间的偏倚2%）。此时，校准品的校准值可以确认。1校准值不是测定值，是纠正的调整值(Correcte
50、目标是：公司提供的仪器、试剂和方法系列（加上校准品即为检测系统）对病人样品的检测结果和参考方法对病人样品检测结果具可比性。首先，用侯选校准品的定值对检测系列校准后，检测一级参考品的血清。由于侯选校准品和病人样品间的基体差异，以它的参考实验室定值对检测系统校准后，检测系统对病人样品的检测结果必然和这些血清已有的参考值有偏倚。要使组成的检测系统实现校准目标，唯一方法是调整侯选校准品的校准值。经反复检测和调整、统计，最终实现校准目标时的校准值，为该校准品的定值。这个校准品是公司的一级校准品，是公司内部具有可溯源性的第一代的校准品，不外售。3）以后公司在生产供应给客户的校准品时，生产质量规格相同于一级
51、校准品，定值方案也相同于上述步骤；但此时分发给各实验室的一级校准品已具有了真正校准该检测系统的校准值。各实验室的检测系统被一级校准品校准后，检测一级参考品血清和新校准品。首先确认各系统对一级参考品血清检测结果和原有的血清参考值具良好的可比性，说明一级校准品有效。再以新校准品的定值去校准各系统后，各系统再检测一级参考品血清和一级校准品，观察检测结果。若能实现校准目标，校准确认，则新校准品的定值为它的校准值。在实践中血清结果往往仍然出现偏倚，必须对新校准品的定值略作调整，反复检测，直至实现校准目标，调整的最佳值为该批校准品的校准值。此时这批校准品可供市售。4）为使公司供应的各批校准品间具可比性，以
53、使用他们的校准品，按公司指定校准您原系统的校准值去校准系统，可以使新组合的检测系统（原仪器、方法、检测程序，新试剂和新校准品）的病人标本检测结果和原配套检测系统的病人标本检测结果具可比性。由于各公司的原检测系统，从试剂、校准品、仪器都有各自特点，形成了各检测系统间的差异。而这类试剂厂商专门针对客户不同检测系统，在替用他们的试剂时强调了替换后必须用他们的校准品，而且必须按校准品说明书上原系统名称下指定的校准值校准新系统，可使新系统对病人样品的检测结果和原系统结果具可比性。同一个校准品适用于不同系统必须有不同的校准值，这样的做法充分说明校准值的专用特性。决不能一个校准品、一个校准值、一种试剂盒用于各种不同的仪器；也不能一个校准品、一个校准值，用于不同的、已具有原试剂配