从多重呼吸道病原体EQA调查项目结果可以看出，开展该项目的不少实验室整体检测能力欠佳，仍需进一步整改提升。
呼吸道感染是临床常见的疾病类型之一，根据感染部位可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸道感染主要累及鼻腔、咽/喉部等，而下呼吸道感染多为喉以下的气管支气管感染及肺部感染。导致急性呼吸道感染的病原体包括病毒、细菌、真菌、支原体和衣原体等。
引自：同济大学附属上海肺科医院检验科余方友教授《呼吸道感染病原体检测技术与发展趋势》
世界卫生组织（WHO）发布的2019年全球前10位死亡病因中，下呼吸道感染位居第4位，其每年可导致约260万人死亡（见下图）。特别是急性下呼吸道感染可严重威胁婴幼儿生命健康，其在5岁以下儿童死因中位列首位，占所有死亡病例的13.3%。
WHO.GlobalHealthEstimates:GlobalHealthEstimates:Lifeexpectancyandleadingcausesofdeathanddisability(2021-05-03)
因呼吸道感染病原谱具有种类多样、变异频繁的特点，往往还存在复杂的合并感染情况。因此，及时、快速、准确的病原学诊断，以尽早明确目标病原并进行对症治疗，对于呼吸道常见感染性疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。
呼吸道病原体常用检测方法包括分离培养、抗原检测、抗体检测和核酸检测等，其中分离培养费时费力且阳性率不高（因病毒培养难度高、部分病原体无法培养等原因）；抗原检测灵敏度较低，易发生漏检；抗体检测窗口期长，对大部分呼吸道病原体感染的早期诊断价值相对较小。核酸检测具有灵敏度高和特异性强的优点，早期感染诊断价值大，有利于呼吸道感染的早发现、早隔离、早报告和早治疗。因此，核酸检测在临床中的应用也越来越广泛。
但是，当前临床所用核酸检测方法学较多，包括PCR荧光探针、恒温扩增、溶解曲线、微流控芯片、数字PCR、核酸质谱和宏基因组高通量测序等，不同方法间检测性能可能存在差异。此外，上述较多方法目前尚未取得国家药品监督管理局（NMPA）注册证，其检测质量可能并未得到有效保证。
而即便已取得NMPA注册证的厂家，其所涉及的检测原理、检测靶标和检测流程也各有不同，其检测性能间也可能存在差异。
基于实时荧光PCR的已注册试剂
基于其它方法的已注册试剂
因此，考虑到当前多重呼吸道病原体检测方法众多、检测靶标各异、操作流程不同等因素，这些都可能会对检测结果产生影响，进而导致实验室间检测结果不一。为了评估临床实验室多重呼吸道病原体核酸检测能力，我们在2022年底组织实施了一次多重呼吸道病原体核酸检测室间质量评价（EQA）调查活动。虽然2023年初已将EQA报告发放至各参评实验室，但当时并未对外发布整体检测情况报告。
EQA样本充分考虑了常见代表性呼吸道病原体类别，包含了8种病毒（流感病毒/呼吸道合胞病毒/腺病毒/副流感病毒/偏肺病毒/新冠病毒）和1种支原体（肺炎支原体）。此外，模拟上述病原体的单一感染和合并感染情况（2重感染和3重感染）。上述灭活病原体经稀释后制备而成，共设置12个样本，具体组成如下：
所有EQA样本制备后均经多种有证试剂（PCR荧光探针法）验证，结果证实其含有预期病原体。此外，考虑到高浓度样本对于评价实验室检出能力作用不大，故本次EQA中未设置高浓度样本，所有EQA样本的检测Ct值在30-37之间，也即为中低浓度样本。
发布报名通知后，多个已开展或准备开展此项目的实验室踊跃报名，经审核确认，报名结束时共计有来自25个省份的265家实验室符合报名条件。之后，我们将分装好的EQA样本通过干冰物流发送至上述参评实验室，实验室检测后上报其检测结果。
参评实验室所用试剂情况如下图所示。由图中可见，120家实验室使用了有证试剂，在所有试剂中占比约为87%（120/138），且以PCR荧光探针法为主，这说明绝大多数实验室还是以合规开展和便于操作为主。需说明的一点是，之江生物并无已有证的多重病原体核酸检测试剂，上报此结果的实验室使用了多个有证单检试剂联合检测的方式。
此外，还有18家实验室回报了未注册产品的检测结果。结果显示此部分检测试剂也是以PCR荧光探针法为主，但检测病原体数量相对有证产品更多。此外，还有少量实验室使用了tNGS和mNGS方法进行了EQA样本检测，虽然最终对其结果也进行了评价，但我们并不建议实验室使用上述方法检测本项目中的EQA样本，这点其实我们在EQA报名通知和项目说明书中都做了明确说明。
随后，参照如下评分标准对结果进行评价分析：实验室应按所用试剂检测病原体范围进行结果评价，与样本预期结果完全一致为符合，否则不符合。如0-3个样本不符合为成绩“合格”；＞3个样本不符合为成绩“不合格”。评价结果也已于2023年初反馈至各参评实验室。但为更好地给大家呈现实际检测情况，下面将按“优秀”（全部样本均符合）、“合格”（1-3个样本不符合）、“不合格”（＞3个样本不符合）的标准给大家介绍，成绩分布情况如下图所示。可见本次EQA的整体合格率为91%，但优秀率仅为60%。
EQA样本检测整体符合率
12个EQA样本检测的整体符合率如下图所示。从图中可见，所有样本均出现检测不合格情况，且随样本浓度降低检出率逐步下降，这也符合预期结果。此外，本次EQA还发现个别试剂对特定病原体的检出率较差，主要体现在FluB和RSV上。因RSV整体检出率均较低，本次EQA未将此病原体纳入最终评价。
假阳性情况
本次EQA结果中假阳性结果相对较少，16家实验室共计回报了28个假阳性结果，其中大部分假阳性结果为本次EQA已包含样本，这说明其可能为人为操作误差所致。有1家实验室出现7个假阳性结果，主要为ADV假阳性情况，这提示实验室很可能发生了气溶胶污染。此外，还有少部分假阳性结果为本次EQA活动不包含样本，如HRV、CP等，这很可能也为实验室气溶胶污染所致。还需提及的一点是，本次EQA结果中新冠病毒样本检测结果无一假阳性！
假阴性情况
相比假阳性情况，假阴性情况就更为普遍，47家实验室共计回报了120个假阴性结果，这很可能和本次EQA样本浓度不高有关。7家实验室出现了超过5个及以上的假阴性结果，上述实验室所用试剂均有证，但所用方法学各有不同，这提示其实验室检测系统可能存在较大问题，如核酸提取效率、检测试剂灵敏度、人员操作能力等。同样值得提及的一点是，本次EQA结果中新冠病毒样本检测结果仅出现1例假阴性！
个别检测试剂质量问题
还需重点说明的一点是，本次EQA活动也发现个别试剂未能有效检出特定病原体，如先前提及的某品牌试剂均未检出FluB样本（其它试剂可有效检出），某试剂组较多参评实验室未能检出RSV样本。以上结果说明这两款试剂本身可能存在问题，这提示试剂厂商应对试剂性能进行再评估后进行检测性能的优化改进提升！
小结
最后，加强人员检测能力建设是保证检测质量极为关键的一环，新冠病毒核酸检测结果几乎100%合格也充分说明了这点。
致谢
衷心感谢参与此次室间质评的所有机构和个人！感谢你们的信任，才能让我们顺利完成此次调查活动，谢谢！
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