骨关节炎病程早期软骨损伤仍存在逆转可能，这一阶段也是治疗的黄金时期，本研究旨在抓住骨关节炎早期阶段，探索对损伤软骨进行抢救性修复的药物缓释材料。
姚裕斌1，魏刚2，丁婕3，崔文国1,2
1.温州医科大学附属第一医院骨科（浙江温州325000）
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院上海市伤骨科研究所上海市中西医结合防治骨与关节病损重点实验室（上海200025）
3.南京航空航天大学医院（南京210000）
基金项目：国家自然科学基金资助项目（52273133）
通信作者：崔文国
关键词：低聚倍半硅氧烷；水凝胶微球；抗炎；软骨再生；骨关节炎
引用本文：姚裕斌,魏刚,丁婕,等.可注射水凝胶微球治疗骨关节炎的实验研究.中国修复重建外科杂志,2023,37(8):918-928.doi:10.7507/1002-1892.202302105
摘要
目的
制备负载低聚倍半硅氧烷-双氯芬酸钠（polyhedraloligomericsilsesquioxane-diclofenacsodium，POSS-DS）纳米颗粒的甲基丙烯酰透明质酸（hyaluronicacidmethacrylate，HAMA）水凝胶微球，对其进行表征并探究体内外生物学特性。
方法
结果
POSS-DS纳米颗粒总体粒径均一，约100nm。HAMA@POSS-DS为不透明球体，粒径约100μm，呈多孔结构；体外降解周期为9周，期间缓释负载的POSS-DS。CCK-8试剂盒及活/死染色法检测显示HAMA@POSS-DS无明显细胞毒性，且其释放的POSS-DS对细胞增殖有促进作用（P<0.05）。软骨细胞抗炎实验中，HAMA@POSS-DS组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量高于对照组和空白组、AGGmRNA相对表达量高于空白组、MMP-13、Adamts5以及TAC1mRNA相对表达量低于空白组，上述差异均有统计学意义（P<0.05）。体内实验显示术后大鼠骨关节炎关节间隙宽度减小，但HAMA@POSS-DS可延缓关节间隙变窄进程，并改善关节周围骨赘增生情况（P<0.05）。
结论
HAMA@POSS-DS可有效改善局部炎症微环境，并显著促进软骨细胞增殖，有利于促进骨关节炎的软骨再生与修复。
正文
近年来，大量骨关节炎治疗研究中采用水凝胶等新型生物活性材料作为药物递送载体，但大多局限于改善局部炎症环境[12-17]。而再生医学的关键是损伤组织的原位再生[18-20]，因此开发一款兼具药物缓释和抗炎、促软骨修复的药物递送体系，是提高骨关节炎治疗效果的突破口。低聚倍半硅氧烷（polyhedraloligomericsilsesquioxane，POSS）是一类有机/无机纳米杂化材料[21-22]，具有促细胞增殖效果[23]，其中八巯基POSS（sulfhydrylPOSS，POSS-SH）可通过巯基反应接枝各类功能性小分子。为此，本研究选择POSS-SH作为纳米构筑平台，采用“点击化学”法将聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）、DS以化学键接枝，构建POSS杂化分子，命名为POSS-DS；进一步将POSS-DS与甲基丙烯酰透明质酸（hyaluronicacidmethacrylate，HAMA）结合，制备多功能水凝胶微球，将其命名为HAMA@POSS-DS；并通过体内外实验探讨其用于骨关节炎治疗的可行性。
1、材料与方法
1.1实验动物及主要试剂、仪器
12周龄雄性SD大鼠30只，体质量350～400g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。软骨细胞购于上海中乔新舟生物科技有限公司。
POSS-SH、PEG、无水二氯甲烷、碳酸钾、丙烯酰氯二氯甲烷、二羟甲基丙酸、四氢呋喃、透明质酸（hyaluronicacid，HA）、甲基丙烯酸酐（methacrylicacidanhydride，MA）、氢氧化钠、石蜡油、司班80、异丙醇（上述试剂均为分析级；Sigma-Aldrich公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cellcountingkit8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）；活/死细胞染色试剂盒（ThermoFisher公司，美国）；兔抗Ⅱ型胶原一抗、FITC标记驴抗兔抗体（AffinityBiosciences公司，美国）；Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）；反转录系统试剂盒、SYBRPremixExTagKit（Takara公司，日本）；ABI7500型实时荧光定量PCR系统（ApplicationBiosystems公司，美国）；Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）、基质金属蛋白酶13（matrixmetalloproteinase13，MMP-13）、解聚蛋白样金属蛋白酶5（recombinantAdisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondin5，Adamts5）、速激肽1（recombinanttachykininprecursor1，TAC1）以及GAPDH的特异性引物［上海生物工程（上海）股份有限公司］。
BrukerAMX-600核磁共振波谱仪（Bruker公司，瑞士）；Lambda35紫外吸收光谱仪（PerkinElmer公司，美国）；光镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；TecnaiG2SpiritBiotwin透射电镜（ThermoFisher公司，美国）；Sirion200扫描电镜（FrequencyElectronics公司，美国）；Micro-CT成像系统（SkyScan公司，比利时）；透析袋（截留相对分子质量14×103；北京索莱宝科技有限公司）；微量注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）；自制改进微液流动性聚焦装置；小动物X线成像仪（Faxitron公司，美国）。
1.2POSS-DS制备及表征
1.2.1POSS-DS制备
①PEG丙烯酸单酯（PEG-acrylate，PEG-Ac）以及DS丙烯酸单酯（DS-acrylate，DS-Ac）制备：于200mL三口烧瓶中依次加入1.6gPEG（4mmol）、60.0mL无水二氯甲烷以及0.6g碳酸钾（4mmol），氮气保护下于冰水浴（0～5℃）条件下持续搅拌10min。完全溶解后，缓慢滴加10mL丙烯酰氯二氯甲烷溶液（4mmol），室温下继续反应24h。滤去过量碳酸钾，并进行萃取；无水硫酸钠吸收残留水分，旋干，获得PEG-Ac。DS-Ac制备过程与PEG-Ac一致，仅将PEG更换为DS（2mmol）。
②POSS-DS合成：称取0.726mgPOSS-SH（1.6mmol）、0.120gPEG-Ac（0.120mmol）以及二羟甲基丙酸，加入10mL四氢呋喃充分溶解。将上述溶液转入50mL三口烧瓶中，室温下使用365nm紫外灯照射反应2.5h。称取0.127gDS-Ac（0.2mmol）溶解在5mL四氢呋喃中，加入至上述溶液中继续紫外灯照射反应6h。旋蒸去除四氢呋喃，获得POSS-DS。
1.2.2观测指标
①核磁共振波谱仪分析：将POSS-SH、PEG-Ac、DS-Ac以及POSS-DS分别溶解于氘代DMSO中，采用核磁共振波谱仪分析化学组成和结构特征。测试条件：扫描频率600MHz，以四甲基硅烷为内标。
②透射电镜观察和能谱分析：将1μLPOSS-DS置于1mL无水乙醇中，超声使其分散均匀后，取少量平铺于铜网上，待无水乙醇挥发后将样品置于透射电镜，观察纳米颗粒形态及粒径，同时对样品中化学元素进行能谱分析。
1.3HAMA@POSS-DS制备
1.3.1HAMA合成
参考本团队既往研究方法[24]合成HAMA。取10gHA加入500mLPBS中加热至60℃，机械搅拌至澄清透明、完全熔化；滴加MA10mL，于50℃不间断机械搅拌下持续混合反应1h；采用微量注射泵滴加浓度为5mol/L氢氧化钠溶液，冰水浴条件下避光反应24h。反应结束后，在搅拌同时加入PBS溶液稀释停止反应，将溶液转移至透析袋中，室温下透析1周过滤杂质。最后将HAMA水溶液冷冻过夜后进行冻干处理。
1.3.2HAMA@POSS-DS制备
采用微流控技术，以自制改进微液流动性聚焦装置制备HAMA@POSS-DS。在含4wt%HAMA的PBS溶液中加入1wt%POSS-DS以及0.5wt%光引发剂，充分搅拌混合至澄清透明，即为水相。于石蜡油中加入5wt%司班80充分混匀，即为油相。通过连接注射器泵的注射器控制水相和油相流量，将得到的单分散乳液滴在紫外光下进行光学交联化。用试管收集光交联后的水凝胶微球，加入适量异丙醇进行振荡洗涤2～3遍，最后以250×g离心10min，获得HAMA@POSS-DS。见图1。
图1微流控技术制备HAMA@POSS-DS流程图
1.4HAMA@POSS-DS体外观测
1.4.1光镜及扫描电镜观察
将含HAMA@POSS-DS的PBS悬液滴至载玻片，使其均匀分散单层平铺。将载玻片置于光镜明场下观察水凝胶微球形态并测量粒径大小。HAMA@POSS-DS冻干处理后呈粉末状，直接置于扫描电镜下观测表面形态及粒径大小。实验重复3次。
1.4.2体外降解及药物释放实验
1.5HAMA@POSS-DS细胞毒性观测
1.5.1POSS-DS最佳浓度选择
取软骨细胞制成浓度为0.5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔0.5mL。将细胞分为5组，每组6个复孔；除对照组采用DMEM培养基进行培养外，其余4组分别采用含100、10、1μmol/L及100nmol/LPOSS-DS的DMEM培养基进行培养。于37℃、5%CO2条件下进行孵育，每2天更换1次培养基。培养12、24、48h后，每孔加入100μL含CCK-8的培养基（90μLDMEM培养基混合10μLCCK-8溶液），继续孵育2h。最后，在450nm波长下检测A值，以此筛选出促进细胞增殖的POSS-DS最佳浓度进行后续实验。
1.5.2细胞培养及观测
①CCK-8观测：同1.5.1方法将软骨细胞接种至96孔板后，随机分为4组，每组6个复孔；除对照组采用DMEM培养基培养外，HAMA组、HAMA@POSS-DS组、POSS-DS组分别采用含HAMA（0.1mg/mL）及最佳浓度HAMA@POSS-DS、POSS-DS的培养基进行培养。于37℃、5%CO2条件下进行孵育，每2天更换1次培养基。培养后12、24、48h，同上法测量A值。
②活/死细胞染色观测：取浓度为5×104个/mL的软骨细胞悬液接种于24孔板，每孔1mL。同CCK-8观测方法分组培养12、24、48h后，吸弃培养液，PBS清洗细胞后参照活/死细胞染色试剂盒说明进行染色，室温下孵育40min后荧光显微镜下观察，其中活细胞呈绿色，死细胞呈红色。每组取3个视野，应用ImageJ软件进行细胞计数。
1.6HAMA@POSS-DS抗炎作用观测
1.6.1软骨细胞炎症模型构建
1.6.2免疫荧光染色观察
参照既往研究[25]，取HAMA、HAMA@POSS-DS按照1mg/mL浓度置于DMEM培养基中自然降解2周，取浸出液用于细胞培养。
取浓度为5×104个/mL的软骨细胞悬液接种于24孔培养板的盖玻片上，每孔1mL，随机分为5组。对照组采用单纯DMEM培养基培养，空白组、DS组、HAMA组及HAMA@POSS-DS组的DMEM培养基中加入20ng/mLIL-1β以模拟炎症环境，后3组进一步对应加入DS、HAMA浸出液和HAMA@POSS-DS浸出液。培养48h后，将细胞置于4%多聚甲醛固定15min，0.1%TritonX-100处理10min，2%牛血清白蛋白孵育45min；4℃与兔抗Ⅱ型胶原一抗（1∶500）孵育过夜，PBS洗涤3次，与FITC标记的驴抗兔抗体（1∶800）室温下孵育1h；PBS洗涤3次后，分别用鬼笔环肽（1∶2000）和DAPI（1∶1000）对细胞骨架和细胞核进行染色，荧光显微镜下观察Ⅱ型胶原表达强度。
1.6.3实时荧光定量PCR检测
将浓度为5×105个/mL的软骨细胞悬液接种于6孔板中，每孔2mL，同1.6.2方法随机分5组进行培养，每组3个复孔。培养24h后，取细胞同1.6.1行实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原、AGG、MMP-13、Adamts5、TAC1mRNA相对表达量。引物序列见表1。
1.7HAMA@POSS-DS体内观测
1.7.1大鼠骨关节炎模型构建及分组
将30只SD大鼠随机分为5组，分别为假手术组、PBS组、DS组、HAMA组和HAMA@POSS-DS组。经面罩异氟烷吸入麻醉、皮下注射美洛昔康（1mg/kg）和丁丙诺啡缓释剂（1mg/kg）麻醉后，左后肢备皮、消毒。于左侧股骨远端至胫骨近端平台作一长2～3cm切口，切开髌腱内侧关节囊并用剪刀张开；将髌腱拨至外侧，钝性分离脂肪垫，显露内侧半月板的半月板胫侧韧带。假手术组不作其他处理，其余4组用显微外科剪切开半月板胫侧韧带并切除内侧半月板前角，然后依次缝合内侧关节囊及皮肤创面。手术完成后，用无菌生理盐水彻底冲洗关节，并重新定位髌骨；可吸收缝线缝合关节囊和皮肤。各组术后皮下注射温热生理盐水（20mL/kg），单独饲养，自由获取食物和水，并允许自由活动；3d内皮下注射美洛昔康（1mg/kg，q24h）、丁丙诺啡缓释剂（1mg/kg，q48h）。此外，PBS组、DS组、HAMA组和HAMA@POSS-DS组分别于术后第1、4、7周关节腔内注射200μLPBS、DS溶液（1μmol/L）、含10mg/mLHAMA的PBS悬液和含10mg/mLHAMA@POSS-DS的PBS悬液；假手术组不作特殊处理。
5组大鼠从术后1周开始每隔1d在水平跑步机上以15m/min速度进行1h跑步训练，诱导膝关节骨关节炎，持续至术后8周实验结束。
1.7.2观测指标
1.8统计学方法
采用GraphPadPrism8.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验；检验水准α=0.05。
2、结果
2.1POSS-DS表征
2.1.1核磁共振波谱仪分析
①POSS-SH：化学位移在0.76ppm左右为与Si-CH2-相连的质子氢的振动吸收峰，1.37ppm左右为-SH质子氢的振动吸收峰，1.71ppm左右是Si-CH2-CH2-质子氢的振动吸收峰，2.56ppm左右为Si-CH2-CH2-CH2-质子氢的振动吸收峰。②PEG-Ac：6.63ppm和6.19ppm为乙烯基=CH2上质子氢的振动吸收峰，6.07ppm为=CH-上质子氢的振动吸收峰，4.21ppm为-CH2-上质子氢的振动吸收峰，3.69～3.39ppm为PEG重复单元中-CH2-上质子氢的振动吸收峰。③DS-Ac：丙烯酰氯接枝成功表现为在6～8ppm区间有1个三重峰，6.77、6.96、7.09ppm处为丙酰氯特征峰，说明接枝成功。④POSS-DS：原6.77、6.96、7.09ppm处丙烯酰氯特征峰消失，而在1.5ppm处有SH质子伸缩振动峰。上述结果提示DS已被成功链接在POSS上。见图2a～d。
图2POSS-DS制备及表征a～d.POSS-SH、PEG-Ac、DS-Ac、POSS-DS核磁氢谱；e.POSS-DS能谱分析；f.POSS-DS透射电镜观察（×5000）
2.1.2透射电镜观察
POSS-DS总体粒径均匀，约为100nm。能谱分析结果显示，POSS-DS中硅、碳、氧等基本组成元素含量高且分布均匀，DS特有的氯元素和钠元素含量相对较少，但总体仍呈均匀分布，进一步说明POSS-DS制备成功。见图2e、f。
2.2HAMA@POSS-DS体外观测
2.2.1光镜及扫描电镜观察
图3HAMA@POSS-DS表征a.大体观察；b.光镜观察（×200）；c.扫描电镜观察（×3000）；d.降解曲线；e.药物释放曲线
2.2.2体外降解及药物释放实验
HAMA@POSS-DS降解过程相对缓慢，第1周降解缓慢，此后降解速率稍增加，并维持较平稳降解状态，最终在第9周时基本完全降解。药物释放曲线显示前4周药物释放速率逐步提升，4～6周稍有减缓，6周后趋于平缓。见图3d、e。
2.3HAMA@POSS-DS细胞毒性观测
2.3.1POSS-DS最佳浓度选择
培养12、24、48h，与对照组相比，不同浓度POSS-DS组A值均增高，差异有统计学意义（P<0.05）；且1μmol/LPOSS-DS组高于其他浓度POSS-DS组（P<0.05），故后续实验选择1μmol/LPOSS-DS以及对应的0.1mg/mLHAMA@POSS-DS。见图4a。
图4HAMA@POSS-DS细胞毒性观测a.不同POSS-DS浓度下细胞增殖情况；b.CCK-8检测结果；c.活/死细胞染色细胞计数结果；d.活/死细胞染色观察（荧光显微镜×200）从左至右分别为对照组、HAMA组、HAMA@POSS-DS组、POSS-DS组，从上至下分别为培养12、24、48h
2.3.2CCK-8及活/死细胞染色观测
2.4HAMA@POSS-DS抗炎作用观测
2.4.1软骨细胞炎症模型构建
2.4.2免疫荧光染色观察
空白组Ⅱ型胶原荧光强度与对照组相比显著减弱。相比于空白组和HAMA组，DS组荧光强度较强，但与对照组仍存在明显差距。HAMA@POSS-DS组Ⅱ型胶原荧光强度显著强于空白组、DS组、HAMA组，甚至超过对照组。
2.4.3实时荧光定量PCR观测
①Ⅱ型胶原：与对照组比较，空白组、DS组、HAMA组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量均降低，而HAMA@POSS-DS组有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组比较，DS组和HAMA@POSS-DS组升高（P<0.05），HAMA组差异无统计学意义（P>0.05）。
②AGG：与对照组比较，空白组、DS组、HAMA组AGGmRNA相对表达量均下降（P<0.05），而HAMA@POSS-DS组差异无统计学意义（P>0.05）；与空白组比较，DS组和HAMA@POSS-DS组升高（P<0.05），HAMA组差异无统计学意义（P>0.05）。
③MMP-13：与对照组比较，其余各组MMP-13mRNA相对表达量均升高（P<0.05）；与空白组比较，DS组、HAMA组、HAMA@POSS-DS组的MMP-13mRNA相对表达量均降低（P<0.05）。
④Adamts5：除HAMA@POSS-DS组与对照组差异无统计学意义（P>0.05）外，Adamts5mRNA相对表达量组间差异总体与MMP-13一致。
⑤TAC1：与对照组比较，其余各组TAC1mRNA相对表达量均升高（P<0.05）；与空白组比较，DS组和HAMA@POSS-DS组的TAC1mRNA相对表达量下降（P<0.05），HAMA组差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。
图5HAMA@POSS-DS抗炎作用观测a.Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察（荧光显微镜×200）从左至右分别为对照组、空白组、DS组、HAMA组和HAMA@POSS-DS组，从上至下分别为Ⅱ型胶原、细胞核、细胞骨架及重叠图像；b.IL-1β处理后软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA相对表达量；c～g.实时荧光定量PCR检测各目的基因相对表达量
2.5HAMA@POSS-DS体内观测
2.5.1X线片检查
术后1周，各组大鼠相对关节间隙宽度差异无统计学意义（P>0.05）。8周时，PBS组、DS组、HAMA组和HAMA@POSS-DS组相对关节间隙宽度均小于假手术组，HAMA@POSS-DS组大于PBS组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5.2Micro-CT成像评估
与假手术组相比，PBS组、DS组和HAMA组膝关节软骨下骨骨质明显增厚，发生了不同程度软骨下骨硬化；而HAMA@POSS-DS组未见明显上述变化。
PBS组骨赘体积最大，其次是HAMA组、DS组，HAMA@POSS-DS组及假手术组最小。其中，PBS组、HAMA组、DS组TOV与假手术组比较，PBS组与DS组、HAMA@POSS-DS组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图6。
图6HAMA@POSS-DS体内治疗效果观测a.术后1周（上）、8周（下）膝关节侧位X线片从左至右分别为假手术组、PBS组、DS组、HAMA组和HAMA@POSS-DS组；b.术后8周Micro-CT断层影像（上）及三维重建影像（下）从左至右分别为假手术组、PBS组、DS组、HAMA组和HAMA@POSS-DS组，箭头示骨赘；c.术后1周各组相对关节间隙宽度；d.术后8周各组相对关节间隙宽度；e.术后8周各组膝关节TOV
3、讨论
本研究通过“点击化学”法以POSS-SH为纳米构筑平台，成功合成了集抗炎、促软骨再生于一体的功能性纳米颗粒POSS-DS，并利用微流控技术制备了粒径均一、高度单分散的杂化水凝胶微球HAMA@POSS-DS。细胞实验中，HAMA@POSS-DS表现出了良好的生物相容性；与软骨细胞共培养48h过程中，随着其负载的POSS-DS少量被缓释到培养基中，软骨细胞数量明显增多，提示POSS-DS在促进软骨细胞增殖方面具有显著优势，这与POSS骨架有利于细胞黏附密不可分[23]。此外，HAMA@POSS-DS还表现出了优异的抗炎性能。在软骨细胞抗炎实验中，HAMA@POSS-DS组在炎症环境下可有效促进软骨细胞增殖以及Ⅱ型胶原和AGG的表达，防止软骨基质流失，进而对软骨细胞起到有效保护作用。HAMA水凝胶微球缓慢的降解过程有利于其原位注射后在关节腔内的长期滞留，并缓慢释放负载的抗炎药物，这不仅大幅提升了目标药物利用率，更有助于维持稳定的药物浓度。促进软骨细胞增殖，协同缓释DS改善局部组织炎症微环境，将更有助于软骨组织的修复和再生。
骨关节炎病程早期软骨损伤仍存在逆转可能，这一阶段也是治疗的黄金时期，本研究旨在抓住骨关节炎早期阶段，探索对损伤软骨进行抢救性修复的药物缓释材料。因此，在动物实验中选取了较短的观测周期（8周）[26]。从治疗终点的影像数据可以看出，HAMA@POSS-DS复合水凝胶微球对比传统药物治疗具有显著优势，不仅在相同治疗周期内获得显著治疗效果，而且还减少了给药频率，有望减少患者在治疗过程中的痛苦，提高依从性。与以往研究中单纯将生物活性材料作为抗炎药物的递送载体不同，本研究的POSS纳米颗粒本身对细胞增殖具有显著促进作用，利用这一独特的材料优势制备出兼具抗炎和促再生的多功能微纳水凝胶微球，两方面作用相辅相成，极大地提高了骨关节炎治疗效果。未对骨关节炎晚期病程进行进一步动物实验是该研究不足之处。有了现阶段正向的实验结果，后续研究将进一步延长动物实验周期，以针对逆转骨关节炎晚期病程进行更深入探索。
通信作者
第一作者
姚裕斌，硕士研究生，温州医科大学附属第一医院、上海交通大学医学院附属瑞金医院/上海市伤骨科研究所。研究方向：基于转化生物医用材料。以第一作者/共同一作在AdvancedScience、等国际期刊发表SCI论文3篇。
参考文献：略
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