本申请要求于2017年10月19日提交的美国临时专利申请第62/574,592号和于2017年12月15日提交的美国临时专利申请第62/599,117号的优先权，其每一个通过引用整体并入本文。
背景
本公开大体上涉及对称二甲基精氨酸(sdma)的检测。更具体地，本公开涉及使用固相检测sdma。
类似地，生物样品中游离sdma的水平可以用作动物心脏病的标志物。可以将样品中sdma的水平与心脏疾病的已知标志物的水平进行比较，以确定用于诊断心脏病的边界范围(jamsocnephrol(2006)17:1128-1134)。
因此，发明人已经确定本领域需要精确和有效地测定来自人和其他动物的样品中的sdma。
技术实现要素：
在一个方面，本公开涉及一种装置，其包括固体基质，例如多孔基质，所述固体基质具有非扩散地结合于其上的颗粒，其中所述颗粒包括捕获试剂，所述捕获试剂包括分析物或所述分析物衍生物的类似物，所述分析物或所述分析物衍生物的类似物共价连接于与颗粒连接的蛋白质。在各种实施方式中，蛋白质可以共价或非共价地连接到颗粒。蛋白质可以是牛血清白蛋白(bsa)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)中的一种或多种。与bsa、卵白蛋白或klh的非共价连接相比，蛋白质与颗粒的非共价连接可以更耐受表面活性剂或高盐浓度。衍生物可以是精氨酸衍生物，诸如甲基化精氨酸衍生物，例如不对称二甲基精氨酸(adma)、l-精氨酸、n-甲基精氨酸(mma)、酰化adma、酰化l-精氨酸和酰化mma。基质可以布置在盒体或壳体中。
在另一个方面，本公开涉及捕获试剂，其包括连接到颗粒的n-甲基精氨酸(mma)或酰化mma的类似物。在各种实施方式中，类似物可以通过连接基团与颗粒结合。类似物可以与连接到颗粒的蛋白质共价连接，并且蛋白质可以与颗粒共价或非共价连接。蛋白质可以是牛血清白蛋白(bsa)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)中的至少一种。
连接基团可包括以下结构：
且捕获试剂可以是：
在各种实施方式中，可以使混合物与具有作为捕获试剂的一部分的sdma的装置接触，并且抗sdma抗体对精氨酸衍生物的亲和力低于对sdma的亲和力。例如，抗sdma抗体对精氨酸衍生物的亲和力可小于抗体对sdma的亲和力的约25％，小于约10％，小于约5％，小于约1％，小于约0.1％，小于约0.01％，或小于约0.001％。
更进一步地，本公开内容涉及用于测定样品中sdma的试剂盒，所述试剂盒包括本公开的装置和轭合物，所述轭合物包含与标记轭合的抗sdma抗体，其中所述抗sdma抗体对于捕获试剂的亲和力小于抗体对sdma的亲和力的约25％(例如，约10％，约5％，约1％，约0.1％，约0.01％，或约0.001％)。
在另一方面，本公开涉及用于测定样品中sdma的试剂盒，所述试剂盒包括固体基质，所述固体基质包括含有甲基化精氨酸的衍生物和轭合物的捕获试剂，所述轭合物包含与标记轭合的抗sdma抗体的，其中抗sdma抗体对捕获试剂的亲和力小于抗体对sdma的亲和力的约25％(例如，约10％，约5％，约1％，约为0.1％，约0.01％，或约0.001％)。
在另一方面，本公开涉及包含甲基化精氨酸衍生物的类似物的固相，诸如n-甲基精氨酸(mma)或酰化mma，其共价连接于非共价连接到颗粒的g6pdh。固相可包括多孔基质，其可安装在壳体中。抗sdma抗体可以与类似物结合，其中抗体对类似物的亲和力低于它对sdma的亲和力。例如，抗sdma抗体对类似物的亲和力小于抗体对sdma的亲和力的约25％(例如，约10％，约5％，约1％，约0.1％，约0.01％，或约0.001％)。抗sdma抗体可以是经标记的。
在另一方面，本公开涉及一种组合物，其包含固定在固体基质上的甲基化精氨酸衍生物的类似物，诸如n-甲基精氨酸(mma)或酰化mma，其中所述类似物与抗sdma抗体配合。抗体可以对固定化类似物具有亲和力，而不是对溶液中的sdma具有亲和力。例如，抗sdma抗体对固定的类似物的亲和力可小于抗体对sdma在溶液中的亲和力的约25％(例如，约10％，约5％，约1％，约0.1％，约0.01％，或约0.001％)。抗sdma抗体可以是经标记的。类似物可以与蛋白质共价连接。蛋白质可以是牛血清白蛋白(bsa)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)中的一种或多种。蛋白质可以非共价连接于固体基质，其中蛋白质可以非共价连接到颗粒，该颗粒非扩散地结合到固体基质。
在另一方面，本公开涉及包含抗t4抗体和抗sdma抗体的组合物。抗t4抗体和抗sdma抗体中的至少一种可以与生物素、链霉亲和素、亲和素或可检测标记连接。可以将抗体冻干。该组合物可以是试剂盒的一部分，所述试剂盒包括含有该组合物的容器。试剂盒可以进一步包括清洗溶液，并且可以进一步包括酶底物。
附图说明
被包括以提供对本公开的进一步理解的附图被并入并构成本说明书的一部分，其示出了本公开的实施方式，并且与具体实施方式一起用于解释本公开的原理。没有试图更详细地示出本公开的结构细节，而是示出对本公开的基本理解和可以实践它的各种方式的必需内容。
图1a和1b示出了根据本公开方法使用作为固相的蛋白质g6pdh-mma被动包被的乳胶颗粒和抗sdmaspdphrp轭合物制作的sdma校准曲线。
图2示出了使用根据本公开方法使用作为固相的klh-mma包被的颗粒和抗sdmaspdphrp轭合物制作的sdma校准曲线。
图3示出了根据本公开方法使用作为固相的mma化学修饰的颗粒和抗sdmaspdphrp轭合物制作的sdma校准曲线。
图4示出了根据本公开方法使用作为固相的g6pdh-mma颗粒和液体spdp轭合物制作的样品分析。
图7a示出了根据本公开方法的具有共价连接的胺-mma颗粒或被动包被的g6pdh-mma颗粒的匹配的犬血清和血浆样品的catalystsdma测定的结果。
图7b示出了根据本公开方法的具有共价连接的胺-mma颗粒或被动包被的g6pdh-mma颗粒的匹配的猫血清和血浆样品的catalystsdma测定的结果。
图8示出了根据本公开方法的具有g6pdh-mma颗粒或卵白蛋白-mma颗粒的20对血清和血浆样品上进行的catalystsdma测定的结果。
图9示出了根据本公开方法的具有卵白蛋白-mma颗粒的20对血清和血浆样品上进行的catalystsdma测定的结果。
图10示出了根据本公开的测定结果来评估被动包被的颗粒(包被有g6pdh-mma、g6pdh-mma或卵白蛋白-mma)的稳定性。
图11示出了使用g6pdh-mma被动包被的颗粒的catalystsdma校准曲线，其中预先用1mnacl温育和没有预先用1mnacl温育。
图12示出了在用或不用20表面活性剂预温育后使用g6pdh-mma被动包被的颗粒的sdma校准曲线。
图13示出了使用直接包被在载玻片膜上的蛋白质klh-mma轭合物(实施例2)的sdma校准曲线。
具体实施方式
在多个方面，本公开提供了用于检测样品中的对称二甲基精氨酸(sdma)的装置、试剂、试剂盒和方法，诸如来自动物的生物样品。该方法包括通过使用免疫测定形式(诸如竞争性免疫测定)检测样品中sdma的存在或量。该测定包括使用对sdma有特异性的sdma抗体，且所述sdma抗体具有对其他精氨酸衍生物较低的亲和力，包括不对称二甲基精氨酸(adma)、l-精氨酸和n-甲基精氨酸。
在进一步详细描述本公开之前，定义了许多术语：
ab是抗体。
精氨酸的结构是：
l-精氨酸是精氨酸的l-异构体。
精氨酸衍生物包括但不限于甲基化精氨酸衍生物、酰化精氨酸和衍生物，以及具有以下结构的化合物：
其中n是0、2或3的整数。在一些实施方式中，出于定义的目的，精氨酸衍生物不包括sdma、adma和/或n-mma，以提供一类不包括sdma、adma和n-mma中的一种或多种的精氨酸衍生物。
adma是不对称的二甲基精氨酸。adma的结构是：
n-mma是n-单甲基精氨酸，或简称为n-甲基精氨酸，其在本文中也简称为“mma”。n-单甲基精氨酸的结构是：
sdma是对称的二甲基精氨酸。sdma的结构是：
游离sdma是指不是多肽链一部分的sdma和sdma盐。sdma的一个或多个氨基酸残基可以存在于多肽中。
如本文所用，术语“甲基化精氨酸衍生物”是指具有以下结构的化合物：
其中n是0、1、2或3的整数；且r1、r2、r3、r4、r5和r6各自独立地为氢或甲基，条件是r1、r2、r3、r4、r5和r6中的至少一个是甲基。甲基化精氨酸衍生物的示例包括mma、sdma和adma，尽管是甲基化衍生物的某些亚组为了定义的目的不包括这些化合物中的一种或多种。
如本文所用，术语“盐”是指在化合物的酸性和碱性官能团之间形成的盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、磷酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸和盐。术语“盐”还指在具有酸性官能团(诸如羧酸官能团)的化合物与无机或有机碱之间形成的盐。合适的碱包括但不限于碱金属的氢氧化物，诸如钠、钾和锂；碱土金属的氢氧化物，诸如钙和镁；其他金属的氢氧化物，诸如铝和锌；氨和有机胺。
如本文所用，术语“类似物”通常是指其中一个或多个单个原子已被不同原子或不同官能团取代的化合物，其提供将分析物接合到另一部分的手段，诸如标记或固体基质。例如，将分析物接合到另一部分的手段可以是连接基团。类似物可以与分析物竞争受体。特别地，分析物类似物可以以与分析物类似的方式结合抗体。因为分析物与基质或另一分子的共价结合通常通过使用分析物类似物来实现，所以本文公开的简单“分析物”连接或轭合到基质或另一分子上包括使用分析物类似物来实现免疫测定领域的普通技术人员容易理解的这种共价连接或轭合。例如，在下面的实施例中公开了多种mma类似物。
分析物的“衍生物”是指分析物的修饰形式，其可以与分析物竞争受体，该修饰是添加或修饰官能团，其不提供将分析物接合到另一部分的手段，诸如标记或固体基质。两个分子可以是彼此的衍生物，使得任一分子可以是分析物或分析物的衍生物，视情况而定。例如，精氨酸、sdma、mma和l-精氨酸都是彼此的衍生物，分子之间的差异是异构的，或者一个或两个甲基的存在或位置
如本文所用，术语“抗体”通常是指b淋巴细胞响应于暴露于抗原而产生并与该抗原特异性结合的糖蛋白。术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。
如本文所用，术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变结构域。具体地，例如，抗体片段可包括fab、fab’、f(ab’)2和fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子；和来自抗体片段的多特异性抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”通常是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂相反，所述多克隆抗体制剂通常包括针对不同表位的不同抗体，每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。修饰语“单克隆”仅指抗体的特征，不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。具体地，例如，单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法制备，或者可以使用已知技术从噬菌体抗体文库中分离。
如本文所用，“抗sdma抗体”、“抗sdma抗体部分”或“抗sdma抗体片段”和/或“抗sdma抗体变体”等包括含有包括至少一部分的免疫球蛋白分子的分子的任何蛋白质或肽，诸如但不限于重链或轻链恒定区的一个互补决定区(cdr)、框架区或其任何部分。如本文所用的抗sdma抗体可根据美国专利第8,481,690号制备，该专利以其整体并入本文。
如本文所用，术语“抗原”通常是指在适当条件下能够与对抗原特异的抗体反应的物质。
如本文所用，术语“分析物”通常是指检测和/或测量的样品中的物质或物质组。根据本公开的示例方面，sdma或sdma的盐被认为是分析物的示例。
如本文所用，术语“生物样品”通常是指来自人或动物的组织或液体的样品，包括但不限于全血、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹液(腹水)、外部皮肤段、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、尿液、血细胞、肿瘤、器官、组织和体外细胞培养成分的样品。许多这样的样品在分析之前需要处理。样品包括原始样品和/或处理的样品。
如本文所用，术语“标记”是指可检测的化合物，其可以直接或间接轭合(例如，经由共价或非共价方式，单独或包封)至本公开的抗体或类似物。标记可以自身检测(例如，放射性同位素标记、化学发光染料、电化学标记、金属螯合物、乳胶颗粒或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变(例如，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶)。本公开中使用的标记可以是但不限于：碱性磷酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“g6pdh”)；辣根过氧化物酶(hrp)；化学发光剂如异鲁米诺，荧光剂如荧光素和罗丹明化合物；核酶；和染料。标记也可以是本身可检测的特异性结合分子(例如，生物素、亲和素、链霉亲和素、异羟基洋地黄毒苷、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基胂酸盐、ssdna、dsdna等)。标记的使用产生可以通过诸如电磁辐射的检测或直接可视化的方式检测的信号，并且可以任选地测量该信号。
如本文所用，术语“多肽”通常是指具有通过肽键连接的氨基酸序列的分子。该术语包括蛋白质、融合蛋白、寡肽、环肽和多肽衍生物。以上在单独的部分中讨论了抗体和抗体衍生物，但出于本公开的目的，抗体和抗体衍生物被视为多肽和多肽衍生物的亚类。
如本文所用，术语“固体支持物”、“固相”和“固体基质”是指本公开的结合配偶体可以连接的非水基质。固体支持物、固相和固体基质的示例包括部分或全部由玻璃形成的支持物(例如，可控孔径玻璃)，合成和天然聚合物，多糖(例如琼脂糖)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇和硅氧烷，色谱条，微量滴定聚苯乙烯板，或允许与从未结合的物质清洗或分离的结合配偶体来结合的任何其他物质。在一些实施方式中，固体支持物、相和基质可以是多孔的。在某些实施方式中，取决于应用，固体支持物、固相和固体基质可以是测定板的孔。固体支持物、固相和固体基质可包括如美国专利公开第2014/0315216号中所述的分析测试载玻片，其通过引用整体并入本文。
“受体”是指能够识别分子的特定空间和极性组织(例如表位或决定位点)的任何化合物或组合物。示例性受体包括抗体、fab片段等。
如本文所用，术语“交叉反应性”通常是指抗体的单个抗原结合位点与多于一种抗原决定因子反应的能力或抗体分子群体与多于一种抗原反应的能力。通常，交叉反应的产生是因为(i)交叉反应抗原与免疫抗原共有表位，或者(ii)它具有与免疫抗原上的表位结构相似的表位(多特异性)。
“结合特异性”或“特异性结合”是指第一分子对第二分子的实质性识别，例如多肽和多克隆或单克隆抗体，或对多肽特异的抗体片段(例如fv、单链fv、fab’或f(ab’)2片段)。例如，如本文所用，“特异性”通常是指单个抗体结合位点仅与一种抗原决定因子反应的能力或抗体分子群体与仅一种抗原反应的能力。通常，抗原-抗体反应具有高度特异性。抗体可以区分(i)抗原的一级结构、(ii)抗原的异构形式和(iii)抗原的二级和三级结构中的差异。表现出高特异性的抗体-抗原反应表现出低交叉反应性。
在另一方面，当在一组特定测定条件下第一分子表现出对第二分子的反应性低于其表现出的对第三分子的反应性的25％，例如低于20％、低于15％、低于10％、低于5％，或低于1％时，一个分子在交联反应性意义上基本不能结合或识别另一分子。可以使用若干众所周知的方法测试特异性结合，例如，免疫组织化学测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)或western印迹测定。
抗体对其靶标的亲和力可受抗体和/或靶标的环境的影响。例如，当一个或另一个与固相结合或与另一个分子轭合时，分子之间的亲和力可能不同于溶液中两个分子之间的亲和力。在某些实施方式中，本文公开的方法利用分析物在溶液中时抗分析物抗体对分析物的亲和力与分析物与固相结合时的亲和力的差异。另外，在各种实施方式中，本公开的方法利用抗体对分析物的亲和力与抗体对分析物衍生物的亲和力的差异。例如，虽然抗分析物抗体可能基本上不结合分析物的衍生物，但抗体可以以足够的反应性结合衍生物，使得甚至抗体和衍生物的低结合亲和力可用于本公开的方法中。例如，当抗体和分析物在溶液中且衍生物与固相结合时，低结合亲和力(例如，抗分析物抗体结合分析物的衍生物具有少于25％的抗体与分析物结合的反应性)可以是有用的。
在一个具体方面，本公开的示例装置包括固体基质，其具有与其非扩散地结合的颗粒，其中所述颗粒包括与其共价或被动(非共价)结合的捕获试剂。捕获试剂包括分析物或分析物的衍生物，其共价连接于与颗粒连接的蛋白质。基质可以是多孔基质，其可以布置在盒体或壳体中以便于处理和用于自动分析仪。参见美国专利公开第2014/0315216号。
当分析物是sdma时，衍生物包括精氨酸衍生物，诸如不对称二甲基精氨酸(adma)、l-精氨酸、n-甲基精氨酸(mma)、酰化adma、酰化l-精氨酸、酰化mma和具有下式的化合物：
其中n是0、1、2或3的整数。不对称二甲基精氨酸(adma)、l-精氨酸、n-甲基精氨酸(mma)、酰化adma、酰化l-精氨酸和酰化mma可以进一步衍生化。在一个方面，当衍生物固定在固体支持物上时，精氨酸衍生物对抗sdma抗体或抗酰基-sdma抗体具有亲和力。精氨酸衍生物本身可以是sdma或酰基-sdma。或者在一些实施方式中，sdma、adma、n-mma及其酰化形式中的一种或多种特异性地排除在精氨酸衍生物的组之外。
多种蛋白质可用于将分析物或分析物的衍生物连接到固相。具体的示例包括牛血清白蛋白(bsa)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)。虽然g6pdh是众所周知的酶标记，但在这种情况下，它的作用是将分析物或衍生物连接固相。除非使用合适的底物，否则它不起标记的作用，这可以通过使用除g6pdh之外的分子(诸如hrp)作为本文进一步描述的测定中的标记而在本公开的方法中避免。g6pdh可以源自真核生物、原核生物、酵母或重组表达。
与分析物衍生物或类似物结合的蛋白质的任何叙述，诸如bsa、klh、卵白蛋白或g6pdh，也包括蛋白质的变体、同种型、片段和突变体。变体、同种型、片段和突变体保留结合分析物、类似物或衍生物或与分析物、类似物或衍生物轭合和/或结合固体支持物的能力。如果蛋白质是酶，则蛋白质的变体、同种型、片段或突变体可以保留或不保留酶活性。例如，具有各种氨基酸取代的g6pdh的突变形式描述于美国专利第6,455,288号中，其全部内容通过引用并入本文。
将精氨酸衍生物或其类似物固定在装置或固体支持物上，使得衍生物或类似物不会被样品、稀释剂和/或清洗程序洗掉。
如本文所述，sdma本身可以通过与蛋白质的轭合和蛋白质与颗粒的连接而与固相结合。sdma与蛋白质的轭合物的示例在美国专利申请公开第us2016/0245801号中示出，其全部内容并入本文。在其他实施方式中，可以使用sdma的衍生物(例如，精氨酸衍生物、甲基化精氨酸衍生物)代替sdma，其中抗sdma抗体对衍生物的亲和力低于对sdma的亲和力。在特定示例中，抗sdma抗体对衍生物的亲和力小于抗体对sdma的亲和力的约25％，小于10％，小于5％，小于1％，小于0.1％，小于0.01％，或小于0.001％。
基质材料包括由合成或天然纤维(例如，基于玻璃或纤维素的材料或热塑性聚合物，诸如聚乙烯、聚丙烯或聚酯)组成的纤维垫；由颗粒材料(例如玻璃或各种热塑性聚合物)组成的烧结结构；或者由硝酸纤维素、尼龙、聚砜等(通常是实质上合成的)组成的浇铸膜。基质也可以由烧结的聚乙烯细颗粒组成，通常称为多孔聚乙烯，诸如烧结的聚乙烯珠。这种材料的密度可以为0.35至0.55克/立方厘米，孔径为5至40微米，空隙体积为40至60％。也可以使用由交联或超高分子量聚乙烯组成的颗粒状聚乙烯。示例性基质包括来自chromexcorporationfn#38-244-1(brooklyn,n.y.)的10-15微米多孔聚乙烯和可来自whatman,inc.,usa的fusion5tm基质。
在特异性结合测定中使用试剂浸渍的测试条也是众所周知的。在这样的程序中，将测试样品施加到测试条的一部分上并使其迁移或芯吸通过条带材料。因此，待检测或测量的分析物可以通过或沿着材料，可以借助于洗脱溶剂，洗脱溶剂可以是测试样品本身或单独添加的溶液。分析物迁移到测试条上的捕获或检测区，其中固定有分析物类似物或能够结合抗分析物抗体的其他化合物。抗体在检测区中结合的程度可以借助于与抗体轭合的标记来确定，其中轭合物与样品混合。在一个实施方式中，能够结合抗体的类似物在不同位置处固定在固体支持物上。在加入样品-轭合物混合物后，可以通过本领域已知的任何方法检测固体支持物上的sdma-抗体配合物。例如，美国专利第5,726,010号，其全部内容通过引用并入本文，描述了侧向流动装置的示例，免疫测定装置(idexxlaboratories)，其可用于本发明。
在另一方面，本公开涉及使用精氨酸衍生物及其类似物的捕获试剂用于根据本文公开确定sdma的方法。特别地，本公开涉及含硫醇、含羟基、含氨基和含羧酸盐的精氨酸衍生物类似物，其中硫醇基、羟基、氨基或羧酸盐基团使得衍生物与另一分子连接(轭合靶标)，诸如活化蛋白质，以形成轭合物。本公开的类似物使得衍生物能够与轭合靶标连接，诸如蛋白质、多肽、可检测标记、固体支持物等。
本公开的一个方面涉及捕获试剂，其包括精氨酸衍生物的类似物，所述精氨酸衍生物包括连接到颗粒的甲基化精氨酸衍生物，例如n-甲基精氨酸(mma)或酰化mma。在一个实施方式中，类似物通过连接基团与颗粒结合，使得类似物与连接到颗粒的蛋白质共价连接。蛋白质可以共价或非共价(被动地)连接到颗粒。蛋白质可以是牛血清白蛋白(bsa)、卵白蛋白，匙孔血蓝蛋白(klh)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)中的至少一种。通过被动或共价方式将类似物连接到颗粒，并使用颗粒将类似物固着于固相，导致与使用直接连接有类似物的固相相比增加的测定的线性范围。该实施方式还导致样品偏差的减小或消除，如本文进一步描述和举例说明的。
在本公开的捕获试剂的一个示例中，连接基团包括以下结构：
当mma通过该连接基团与颗粒连接时，捕获试剂具有以下结构：
此外，以下mma类似物可具有以下结构以提供或联接和连接到蛋白质以供例如在捕获试剂中使用：
其中x和y是1至5的整数。
根据一个实施方式，本公开的mma类似物具有以下通式：
其中r1可以是硫醇(或保护的硫醇)、羟基(或保护的羟基)、氨基(或保护的氨基)基团或羧酸盐(包括羧酸)或保护的羧酸盐基团。
合适的硫醇、羟基、氨基和羧酸盐保护基团是本领域技术人员已知的，例如在t.w.green等人protectivegroupsinorganicsynthesis，第三版中所述。
在一个具体实施方式中，本公开涉及式(1)的mma类似物：
或其盐。式(1)的化合物提供可用的硫醇，其可与包含合适的“硫醇反应性位点”(即与巯醇基团反应的位点)的轭合靶标反应。例如，马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物和α-卤代酰基是示例性的硫醇反应性位点，其可以与硫醇反应形成硫醚。类似地，吡啶基二硫化物可与硫醇反应形成混合的二硫化物。
在另一个实施方式中，r1是x-r2，其中x是-s-、-o-、-n-或-coo-且r2是具有硫醇、羟基、氨基或羧酸盐反应性基团的标记。
在一个实施方式中，r1是x-r2，其中x是-s-、-o-、-n-或-coo-且r2是已经官能化以包含硫醇、羟基氨基或羧酸盐反应性基团的蛋白质。
在一个实施方式中，mma类似物与马来酰亚胺活化的蛋白质轭合，诸如，例如马来酰亚胺活化的匙孔帽贝蛋白(klh)或马来酰亚胺活化的牛血清白蛋白(bsa)。
在一个实施方式中，式(1)的化合物与马来酰亚胺活化的蛋白轭合，诸如，例如马来酰亚胺活化的匙孔帽蛋白(klh)或马来酰亚胺活化的牛血清白蛋白(bsa)。
因此，在一个具体实施方式中，本公开涉及式(1)化合物与具有下式的马来酰亚胺活化的蛋白的轭合物：
通常，m大于5。然而，m的值是可变的。例如，在可商购自sigma-aldrichofst.louis,mo的马来酰亚胺活化的bsa中，m为每个蛋白质约15个马来酰亚胺基团；在可商购自sigma-aldrich的马来酰亚胺活化的klh中，m为每个蛋白质约80个马来酰亚胺基团；在可商购自thermoscientificpierceproteinresearchproductsofrockford,il的马来酰亚胺活化的bsa中，m为每个蛋白质约15至约25个马来酰亚胺基团；在可商购自thermoscientificpierceproteinresearchproducts的马来酰亚胺活化的klh中，m为每个蛋白质大于约400个马来酰亚胺基团；和在可商购自a.g.scienceofsandiego,cam的马来酰亚胺活化的klh中，m为每个蛋白质约150至约300个马来酰亚胺基团。通常，m受免疫原性蛋白质中存在的可用胺基团数量的限制。通过将免疫原性蛋白质与多胺轭合，可以增加可用胺的数量。
在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约5。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约10。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约25。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约50。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约75。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m在约5至约80的范围内。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约75。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m在约10至约80的范围内。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约75。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m在约20至约80的范围内。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m大于约75。在一个实施方式中，蛋白质是bsa并且m在约30至约80的范围内。
可以使用本领域技术人员熟知的方法表征式(1)的化合物和马来酰亚胺活化蛋白的轭合物(参见，例如，sigma-aldrichtechnicalbulletinformaleimideactivatedbsa,klhconjugationkit(目录编号mbk1))。
在一个替代实施方式中，mma类似物通过硫醇、羟基、氨基或羧酸盐基团直接与固体支持物联接。
标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记、化学发光染料、电化学标记、金属螯合物、乳胶颗粒或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化底物化合物的化学改变，或为可检测的组合物(例如，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶)。标记可以是本身可检测的特异性结合分子(例如，生物素、亲和素、链霉亲和素、异羟基洋地黄毒苷、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基胂酸盐、ssdna、dsdna等)。可以使用本领域技术人员熟知的方法将mma与可检测标记联接。作为说明性示例，mma类似物可以与来自辣根冻干粉的马来酰亚胺活化的过氧化物酶联接(根据产品手册中的说明，购自sigma-aldrichst.louis,mo(目录编号p1709))。
式(1)的类似物可以根据以下程序由mma(购自emdchemicalsinc.ofgibbstown,nj)制备。mma的伯氨基和仲氨基通过使mma与二碳酸二叔丁酯(boc2o)反应来保护。然后将得到的叔丁氧基羰基(boc)保护的mma((boc3)-mma与树脂联接。例如，(boc3)-mma可以通过使(boc3)-mma与树脂在2-(1h-7-氮苯并三氮唑-1)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸甲铵(hatu)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)的存在下在二甲基甲酰胺(dmf)中接触而联接到半胱胺-4-甲氧基三苯甲基树脂(购自emdchemicals,inc.,ofgibbstown,nj)以提供树脂结合(boc3)-mma半胱胺。除去树脂结合(boc3)-mma半胱胺上的boc保护基团，并使用例如在二氯甲烷中的三氟乙酸从树脂上切除所得的树脂结合的mma半胱胺，以得到mma半胱胺，其通过与盐酸反应转化为盐酸盐。
如上所述的式a-d的类似物可以使用类似的方法制备。
使用如本文所述的其他甲基化精氨酸衍生物的mma轭合物或轭合物，可以构建装置的固相组分。例如，固相可包括共价连接到g6pdh的mma或酰化mma类似物，所述g6pdh非共价连接于非扩散地与固相(诸如多孔基质)结合的颗粒。如本文所述，固相可以安装在壳体或支架中，以便于其在自动分析仪或侧向流动装置中使用。
在一个方面，包含非扩散性结合的颗粒的固相可以通过在固相上点样含有颗粒的颗粒点样稀释剂来制备。例如，颗粒点样稀释剂可包括各种缓冲剂、表面活性剂和/或促进颗粒附着于固相的其他化合物(例如糖)。施加到固相的稀释剂的体积和稀释剂中颗粒的浓度将影响在施加稀释剂后与固相结合的颗粒的数量。在各种实施方式中，稀释剂具有约0.001％和1.0％的颗粒浓度，例如0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％和1.0％，包括0.001％和1.0％之间的所有值，如在此详尽列举。
在使用中，固相还包括与类似物结合的抗sdma抗体，其中抗体对类似物的亲和力低于其对sdma的亲和力。例如，抗sdma抗体对类似物的亲和力可小于抗体对sdma的亲和力的约25％，小于约10％，小于约5％，小于约1％，小于0.1％，小于0.01％，或小于0.001％。在实施方式中，标记sdma抗体。
类似地，本公开涉及包含n-甲基精氨酸(mma)、酰化mma、adma、酰化adma或另一种甲基化精氨酸衍生物的类似物的组合物，其中所述类似物与抗sdma抗体配合。在各种实施方式中，抗体对固定的类似物的亲和力低于其在溶液中对sdma的亲和力。例如，抗sdma抗体对固定的类似物的亲和力小于抗体在溶液中对sdma的亲和力的约25％。在实施方式中，标记sdma抗体。该类似物可以与诸如牛血清白蛋白(bsa)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)的蛋白质共价连接，并且该蛋白质可以非共价连接于固体支持物。在一个实施方式中，蛋白质非共价连接到颗粒，所述颗粒非扩散地结合至固体支持物。在另一个实施方式中，蛋白质通过使用例如本领域技术人员熟知的技术共价连接到颗粒。
在一个特定示例中，此类试剂盒将包括具有特异性结合试剂(例如，非固定化标记的特异性结合试剂和固定化分析物捕获试剂)和清洗试剂，以及检测试剂和阳性和阴性对照试剂，如果需要或适当的话。另外，可以包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂等。可以改变各种试剂的相对量，以提供基本上优化了试验的灵敏度的试剂在溶液中的浓度。特别地，试剂可以干粉形式提供，通常是冻干的，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液以与样品结合。
该装置还可以包括液体试剂，其将未结合的材料(例如，未反应的流体样品和未结合的特异性结合试剂)从反应区(固相)转移出去。液体试剂可以是清洗试剂，仅用于从反应区中除去未结合的材料，或者它可以包括检测试剂并用于去除未结合的材料并促进分析物检测。例如，在与酶轭合的特异性结合试剂的情况下，检测试剂包括在反应区与酶-抗体轭合物反应时产生可检测信号的底物。在与放射性、荧光或光吸收分子轭合的标记的特异性结合试剂的情况下，检测试剂仅作为清洗溶液，通过洗去未结合的标记试剂，促进在反应区检测配合物形成。
两种或更多种液体试剂可以存在于装置中，例如，装置可以包括用作清洗试剂的液体试剂和用作检测试剂并促进分析物检测的液体试剂。
因此，在一个实施方式中，本公开涉及一种测定来自患者的生物样品中sdma的组合的方法。该方法包括使样品与抗t4抗体和抗sdma抗体接触，并测定t4和抗t4抗体之间的结合，并测定sdma和抗sdma抗体之间的结合。在某些实施方式中，抗t4抗体或抗sdma抗体或两者都连接于可检测标记。为了促进该方法，本公开的一个方面包括含有抗t4和抗sdma抗体两者的试剂组合物。本公开还涉及一种试剂盒，其包括含有试剂组合物的容器，用于储存或用于进行t4和sdma组合的测定。在另一个实施方式中，可以将试剂组合物及其组分(可以在容器中)冻干。试剂盒还可以包括含有适用于t4测定和sdma测定的清洗溶液的容器。试剂盒还可以包括用于酶标记的底物，其中标记可以与抗体连接或者可以与适合于t4测定和sdma测定的sdma或t4类似物轭合，具体取决于测定的形式。
无需进一步详细说明，相信使用前述描述的本领域技术人员可以最充分地利用本公开。根据以下实施例，本公开的其他特征和优点将显而易见。提供以下内容仅用于示例目的，并不旨在限制以上广义术语描述的本公开的范围。本公开中引用的所有参考文献均通过引用并入本文。
实施例
实施例1：制备mma、adma和sdma与g6pdh轭合物
通过将mma-sh、adma-sh或sdma-sh与由琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(sia)活化的g6pdh轭合来制备mma、adma或sdma与g6pdh的轭合物。sia交联剂含有胺反应性n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯和巯基反应性碘乙酰基。nhs酯与侧链赖氨酸(k)残基和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)的n-末端上存在的伯氨基团(-nh2)反应。通过透析纯化后，碘乙酰基与活化的mma(mma-sh)、adma(adma-sh)或sdma(sdma-sh)的巯基反应，产生稳定的硫醚联接的g6pdh-mma或g6pdh-sdma轭合物。轭合程序的进一步细节如下所示。
合成g6pdh-mma轭合物
g6pdh-mma轭合物具有以下结构：
根据以下程序制备轭合物。首先，将108mgg6pdh粉溶于33mlmes缓冲液(50mm，ph6.5)中，并在25℃下温育10分钟以制备2.11mg/mlg6pdh储备溶液(通过bca试剂盒测量)。将28.4mlg6pdh储备溶液加入到9.1mlmes缓冲液(50mm，ph6.5)中以形成g6pdh反应溶液。将50mgsia溶于1mldmso中以制备浓度为50mg/ml的sia储备溶液。将一定量的84.9μlsia储备溶液(50mg/ml，在dmso中)加入到上述g6pdh反应溶液(37.5ml)中并快速混合并在25℃下翻转2.0小时。将反应混合物在4℃下对pbs(4l)透析两次，并在4℃下对mes缓冲液(50mm，ph8.0)透析一次。然后将edta(0.5m，ph8.0)加入到反应混合物中至5mm的最终edta浓度。
将25mgmma-sh.2hcl化合物溶于8.4ml5mmedta溶液中并充分混合。然后将5.76mlmma-sh溶液加入到上述sia-活化的g6pdh溶液中并在4℃下翻转24小时。然后将g6pdh-mma轭合物在4℃下对pbs透析三次并且对mes缓冲液(50mm，ph5.0)透析一次。通过bca试剂盒测量g6pdh-mma轭合物的浓度，然后在-80℃下储存以供进一步使用。
合成g6pdh-adma轭合物
g6pdh-adma轭合物具有以下结构：
根据以下程序制备轭合物。首先，将32.3mgg6pdh粉溶于10mlmes缓冲液(50mm，ph6.5)中，并在25℃下温育10分钟以制备2.2mg/mlg6pdh储备溶液(通过bca试剂盒测量)。将50mgsia溶于1mldmso中以制备浓度为50mg/ml的sia储备溶液。将一定量的18.1μlsia储备溶液(50mg/ml，在dmso中)加入到上述g6pdh反应溶液(8ml)中并快速混合并在25℃下翻转2.0小时。将反应混合物在4℃下对pbs(4l)透析两次，并在4℃下对mes缓冲液(50mm，ph8.0)透析一次。然后将edta(0.5m，ph8.0)加入到反应混合物中至5mm的最终edta浓度。将2.7mg的如下合成的并溶于5mmedta溶液(8.4ml)的adma-sh然后加入到上述sia-活化的g6pdh溶液中并在4℃下翻转24小时。然后将g6pdh-adma轭合物在4℃下对pbs透析三次并且对mes缓冲液(50mm，ph5.0)透析一次。通过bca试剂盒测量g6pdh-adma轭合物的浓度，然后在-80℃下储存以供进一步使用。
根据以下程序合成adma-sh.2tfa。向20ml小瓶中加入半胱胺4-甲氧基三苯甲基树脂(0.9g，0.74mmol)、fmoc-adma(pdb)-oh(1.0g，1.5mmol，2.0当量)、hatu(0.7g、1.8mmol，2.5当量)、二异丙基乙胺(0.6ml，3.7mmol，5.0当量)和无水dmf(20ml)。盖上混合物并在25℃下翻转16小时。然后通过过滤除去液体，并用dmf(20ml，4次)和甲醇(20ml，4次)清洗树脂。然后用20ml20％哌啶的dmf溶液处理树脂3次，且每次温育30分钟。用dmf(20ml，4次)和甲醇(20ml，4次)清洗树脂，并在真空下干燥。为了从树脂上切除adma-sh，将3mltfa加入到上述树脂中并在25℃下翻转3小时。滤出树脂后，将tfa液体在真空下蒸发至干，得到adma-sh.2tfa糖浆状产物。将adma-sh.2tfa产物溶于5mmedta溶液中，作为3.8mmadma-sh储备溶液(通过ellman试剂测量)。
合成g6pdh-sdma轭合物
g6pdh-sdma轭合物具有以下结构：
实施例2：合成klh-mma轭合物
klh-mma轭合物具有以下结构：
根据以下程序制备轭合物。将5mg马来酰亚胺活化的klh蛋白质溶于含有5mmedta的2.0mlmes缓冲液(50mm，pk8.0)中，然后与2.5mlmma-sh(5mg/ml，在5mmedta溶液中)混合。将反应混合物在4℃下翻转超过36小时，并测量偶联效率。然后将反应混合物翻转额外的24小时，并再次测量偶联效率。然后将制备的klh-mma轭合物在4℃下对pbs(4l)透析三次得到10k分子量的切除。将klh-mma轭合物进一步对mes缓冲液(25mm，ph5.0)透析。
实施例3：合成klh-sdma轭合物
klh-sdma轭合物具有以下结构：
根据以下程序制备轭合物。将5mg马来酰亚胺活化的klh蛋白质溶于含有5mmedta的2.0mlmes缓冲液(50mm，pk8.0)中，然后与2.5mlsdma-sh(3.6mm，在5mmedta溶液中)混合。将制备的反应混合物在4℃下翻转超过36小时，并测量偶联效率，然后将反应混合物翻转额外的24小时，并再次测量偶联效率。然后将制备的klh-mma轭合物在4℃下对pbs(4l)透析三次得到10k分子量的切除。将轭合物然后对mes缓冲液(25mm，ph5.0)再次透析。
实施例4：合成bsa-mma轭合物
bsa-mma轭合物具有以下结构：
根据以下程序制备轭合物。将25mgmma-sh溶于dmso中以制备50mmmma-sh储备溶液，并经由ellman试剂测定浓度。将mma-sh储备溶液稀释到mes缓冲液(50mm，ph8.0和5mmedta)中至3.6mm的终浓度。将2.5ml3.6mmmma-sh溶液加入到5mg马来酰亚胺活化的bsa中，混合均匀，然后在4℃下翻转36小时。然后将制备的bsa-mma轭合物在4℃下对pbs(4l)透析三次，并在4℃下再对mes缓冲液(25mm，ph5.0)透析一次。
实施例5：合成bsa-sdma轭合物
bsa-sdma轭合物具有以下结构：
根据以下程序制备轭合物。将从sdma-硫醇-树脂中新鲜切除的sdma-sh(100mg)溶于mes缓冲液(50mm，ph8.0，含5mmedta)中，经由ellman试剂盒测定净sdma-sh的浓度为3.6mm。将2.5mlsdma-sh溶液加入到5mg马来酰亚胺活化的bsa中，充分混合，然后在4℃下翻转36小时。将制备的bsa-sdma轭合物在4℃下对pbs(4l)透析三次。然后将轭合物对mes缓冲液(25mm，ph5.0)再透析一次。
实施例6：在乳胶颗粒上被动包被g6pdh-mma和g6pdh-adma的轭合物
使用以下程序制备具有被动包被g6pdh-mma轭合物的乳胶颗粒。使用类似的程序制备具有被动包被的g6pdh-adma轭合物的乳胶颗粒。可以使用类似的程序用g6pdh和其他精氨酸衍生物的轭合物被动包被颗粒。此外，可以使用类似的程序用含有其他蛋白质的轭合物包被颗粒。
将500μl乳胶颗粒悬浮液(5％w/v％；粒径0.52μm)加入到2ml塑料管中，并以10krpm离心5分钟，取出上清液并弃去。将500μl包被缓冲液加入到颗粒沉淀中并通过移液管充分混合。然后将混合物离心以除去上清液。
将1.48mlg6pdh-mma(0.638mg/ml，在包被缓冲液(mes25mm，ph5.0)中)加入到颗粒沉淀中，并将颗粒重新悬浮并充分混合。为了用单层轭合物包被0.5μm乳胶颗粒，使用34.3μg每mg珠粒的轭合物。将颗粒悬浮液和轭合混合物在4℃下翻转16小时。然后将颗粒悬浮液以10000rpm离心5分钟。除去上清液并用0.2μm过滤器过滤。使用bca蛋白质测定试剂盒(thermofischer)测量轭合物残余物以确定包被效率。用包被缓冲液清洗颗粒两次，然后重悬于包被缓冲液中并在4℃下储存。通过在995μl水中稀释5μl上述颗粒悬浮液(x200稀释度)并在650nm读数来测定包被颗粒浓度。a650为0.348，相当于1.8％的固体颗粒(w/v)。
实施例7：合成化学修饰的mma-氨基-颗粒
化学修饰的mma-氨基-颗粒的制备用以下示意图和在以下程序中示出。该程序通常可与其他精氨酸衍生物一起使用：
sm(peg)12活化氨基-颗粒
将10ml胺改性的聚苯乙烯颗粒(5％w/v；粒径0.55μm)的悬浮液加入到50mlfalcon管中，并以7000rpm离心25分钟，然后弃去上清液。将颗粒沉淀用20ml磷酸盐缓冲液(50mm，ph7.4)清洗两次，然后重悬于20ml，ph7.4的磷酸盐缓冲液中。将100mgsm(peg)12(thermofischerpierce)溶于1mldmso中至终浓度为100mg/ml。在振荡器中，将sm(peg)12溶液逐滴加入到胺颗粒悬浮液中，然后在25℃下翻转4小时。通过在7000rpm下离心20分钟将颗粒混合物清洗四次，通过超声处理1分钟重悬于磷酸盐缓冲液(40ml)中，并温育20分钟。第四次清洗后，将颗粒重悬于20ml含5mmedta的磷酸盐缓冲液中。
mma-sh与sm(peg)12颗粒轭合
将25mgmma-sh-2tfa溶于4.2ml的5mmedta溶液中以制备12.5mmmma-sh储备溶液。将mma-sh储备溶液(12.5mm)稀释至1.25mm以制备中间体mma-sh溶液，然后再稀释一次至0.05mm以制备mma-sh工作溶液。振荡上述sm(peg)12活化颗粒溶液(10ml)，并将相应体积的mma-sh工作溶液(0.05mm)逐滴加入到颗粒溶液中。通过超声将颗粒充分混合，然后在25℃下翻转15小时。加入5mm的半胱胺并与颗粒一起温育额外的1小时。然后将颗粒以6000rpm离心15分钟，并通过超声处理和重悬浮用12ml磷酸盐缓冲液清洗五次。颗粒然后重悬于10ml磷酸盐缓冲液中。为了测量颗粒浓度，将悬浮液在去离子水中稀释200倍并在650nm下读取od。
实施例8：制备颗粒点样稀释剂
对于500ml规模，混合以下材料，并将液体的最终ph调节至7.4。
50ml1m磷酸盐缓冲液
50克蔗糖
20μl20表面活性剂
450ml去离子水
实施例9：合成抗sdma-抗体-hrp轭合物
使用四步反应方案经由抗体和traut试剂的磺基活化或酶辣根过氧化物酶(hrp)的spdp试剂活化制备抗sdma抗体和hrp轭合物。在步骤1中，使用马来酰亚胺封端抗体溶液中的任何游离巯醇片段，以避免在smcc活化过程中抗体交联。在步骤2中，使smcc交联剂与抗体反应以产生马来酰亚胺活化的抗体(smcc-mab)。在步骤3中，在通过透析除去过量的未反应的交联剂后，使smcc活化的抗体与巯基活化的hrp反应，所述巯基活化的hrp通过用traut试剂活化hrp或spdp来制备。smcc活化的抗体通过巯基与hrp酶反应。mab-hrp的合成化学路径显示在以下示意图中(步骤3和4由用traut试剂或spdp活化hrp表示)：
或者，步骤3和4可以如下完成：
步骤3：hrp的spdp活化和通过dtt/tcep还原
步骤4：smcc-mab和巯基活化的hrp的轭合
步骤1-4的程序更具体地示出如下：
步骤1：杂质自由硫醇的马来酰亚胺封端
向在pbs中的4ml5.6mg/mlanti-sdmamab(如美国专利第8,481,690号中制备)(总共22.4mg)中加入15μl在dmso中的0.5m马来酰亚胺，然后在室温下翻转45分钟。将封端的抗体溶液在4℃下对pbs(4l)透析三次。通过用pbs10倍稀释抗体并读数od280nm(od280＝1.37对应1mg/ml)来测定抗体浓度，为5.2mg/ml。
步骤2：抗sdmamab的smcc活化
然后将50μlsulfo-smcc(无重量形式，在打开前平衡小瓶至室温以避免水分冷凝，2mg加入100μldmso以制备10.0mg/ml溶液)加入到3.3ml的在pbs中的马来酰亚胺封端mab(5.2mg/ml)中，将其轻柔混合并在室温下翻转(轻柔且低速)1小时。将smcc活化的抗体在4℃下对pbs(4l)透析三次。通过用pbs10倍稀释抗体，然后在280nm处读取od来测定smcc活化的抗体(smcc-ab)的浓度，为4.9mg/ml。
步骤3(替代方案1)：traut的hrp的试剂活化
将40mghrp溶于3ml含5mmedta的pbs中，hrp的终浓度为13.3mg/ml。将0.275ml在水(10mg/ml)中的traut试剂(20当量)加入到上述hrp溶液中，然后在25℃下翻转1小时。然后将溶液用pd-10柱脱盐，并用含有5mmedta的pbs缓冲液清洗。收集具有棕色的级分，测量405nm处的od以确定hrp浓度为7.8mg/ml。
步骤3(替代方案1)：抗体-hrptraut轭合物的制备
将0.7ml在pbs中的smcc-mab(2.23mg/ml)加入到edta溶液(0.5m，ph8.0)中，以达到5mm的终edta浓度。加入如上纯化的0.64mltraut-hrp(12eq，7.8mg/ml)，然后将混合物在4℃下翻转24小时。将半胱氨酸(0.5m)以0.5mm的终浓度加入混合物中以淬灭反应，并将混合物在室温下静置2小时。然后通过0.2μm旋转过滤器过滤制备的轭合物溶液。将轭合物在4℃下储存，且sds-page和sec用于表征溶液中存在的轭合物。
步骤3(替代方案2)：hrp的spdp激活
将250mghrp溶于12.5mlpbs中以制备20mg/ml溶液。将100mgpeg4-spdp(peg化的长链spdp交联剂；spdp是琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)(thermofisherscientific)冷却至室温，然后溶于1mldmso中以制备100mg/mlpeg4-spdp溶液。然后将0.7mlspdp溶液加入到12.5mlhrp溶液中并在室温下翻转1小时。将spdp-hrp轭合物在4℃下对pbs(4l)透析三次。经由在405nm处的读数测定20倍稀释的spdp-hrp溶液的hrp浓度为15.2mg/ml。
通过tcep树脂去除spdp-hrp的封端
将6mltcep树脂浆液离心(3000rpm，2分钟)，弃去上清液。然后用6ml含有5mmedta的pbs缓冲液清洗树脂沉淀两次。然后将40μl0.5medta溶液加入到4mlspdp-hrp溶液(15.2mg/ml)中，充分混合，然后加入到tcep树脂中。然后将该溶液充分混合并在室温下翻转2小时。滤除树脂后，通过20倍稀释和405nm处的od读数测定hrp浓度，得到10.5mg/ml的浓度。
步骤4(替代方案2)：抗体-hrpspdp轭合物
将在2.2mlpbs中的smcc-mab(4.9mg/ml)加入到edta中以制备5mm混合物。向该混合物中加入2.2ml去除封端的spdp-hrp(10.5mg/ml，8当量的hrp/ab)，充分混合，然后在4℃下翻转15小时。为了淬灭smcc反应，加入4.4μl0.5m的0.5m半胱氨酸水溶液(0.5mm)，并在4℃下温育2小时。为了阻断游离硫醇，加入4.4μl0.5m在dmso中的半胱氨酸(1mm)，然后在4℃下温育1小时。然后通过0.2μm旋转过滤器过滤制备的轭合物溶液并在-80℃下储存。sds-page和sec用于分析轭合物。
实施例10：制备抗sdma液体轭合物试剂
如实施例11中所述，在轭合物稀释剂中制备抗sdma本体轭合物溶液。使用轭合物稀释剂将抗sdma抗体轭合物预稀释至50μg/ml。为了制备工作溶液，将本体轭合物溶液(50μg/ml)加入到轭合稀释剂中至终浓度为0.3或0.8μg/ml。然后通过在25℃下旋转溶液30分钟将工作溶液充分混合。然后将工作溶液包裹在箔中并在4℃下储存直至使用。
实施例11：制备轭合物试剂稀释剂
按所列顺序将下列材料加入到150mlstablzyme稳定剂中。然后通过在25℃下旋转混合物2小时来混合，并将ph调节至7.0。
180mgans
2.625g水杨酸
17.5g蔗糖
16.5mg肝素
50ml无活性hrp
0.5ml蓝色染料
将上述材料加入到250mlstablzyme稳定剂中，并轻柔翻转混合几分钟。将稀释剂通过0.2μm过滤器过滤，然后用铝覆盖并在4℃下储存。
实施例12：制备用于catalyst分析仪的sdma测定载玻片
将储存的g6pdh-mma或g6pdh-adma被动包被的乳胶颗粒混合到点样稀释剂(实施例8)中，终颗粒浓度为0.1％。使用fusion5单层基质膜(gehealthcarelifesciences)将35μl稀释的颗粒溶液加入到预组装的每个载玻片上(参见us2014/0315216)。然后将载玻片在49℃的干燥通道中干燥，流率为745保持30分钟。将干燥的载玻片放入带有干燥剂的箔袋中，将含有载玻片的袋密封并在4℃下储存。
为了使用mma-氨基-颗粒制备载玻片，将实施例6和7中所述的颗粒稀释到点样稀释剂中，得到终颗粒浓度为0.1％，然后在载玻片上点样并使用上述干燥程序干燥。
实施例13：在catalyst分析仪上的sdma测定
根据以下一般程序并根据制造商(idexxlaboratories,inc.)的说明进行catalyst测定。将样品和抗sdma-hrp轭合物在室温下温育两分钟。将混合物的两个11μl将等分试样施加到如实施例12中所述制备的catalyst固相。用9μl清洗缓冲液清洗固相三次。加入tmb底物的两个11.5μl等分试样。然后在645nm处以0.5秒的间隔读取两分钟内的载玻片od。
图1示出了使用蛋白质g6pdh-mma被动包被的乳胶颗粒作为固相和抗sdmaspdphrp轭合物的sdma校准曲线。sdma校准物在未剥离的犬血清中制备。固相：颗粒浓度(0.1％)；液体轭合物＝0.3μg/ml。
图1b示出了使用蛋白质g6pdh-mma被动包被的乳胶颗粒作为固相和抗sdmaspdphrp轭合物的sdma校准曲线图。sdma校准物在未剥离的犬血清中制备。固相：颗粒浓度(0.025％)；液体轭合物＝0.027μg/ml。示出的数据代表六次重复实验。
图2示出了使用klh-mma被动包被的颗粒作为固相和抗sdmaspdphrp轭合物的sdma校准曲线。sdma校准物在未剥离的犬血清中制备。固相：颗粒浓度(0.1％)；液体轭合物＝0.8μg/ml。
图3示出了使用mma化学修饰的颗粒作为固相和抗sdmaspdphrp轭合物的sdma校准曲线。sdma校准物在未剥离的犬血清中制备。固相：颗粒浓度(0.1％)；液体轭合物＝0.8μg/ml。
图4示出了使用g6pdh-mma被动包被的颗粒固相和液体spdp轭合物对校准物和患者样品的catalystsdma样品分析。
实施例14：比较sdma、adma和mma包被颗粒的固相性质
为了开发基于催化剂分析仪的sdma测定，开发了不同形式的固相，包括具有固定化颗粒的固相，所述固定颗粒被动地包被有如实施例1和12中所述的基于蛋白质的mma、adma和sdma轭合物。还研究了如实施例7中所述的用mma和sdma化学修饰的固定化颗粒。
一个发现是固定化mma并在固相上使用时改善了测定性能。通过基于蛋白质的被动包被的乳胶颗粒或化学修饰的颗粒固定在固相上的sdma固定化的使用导致sdma校准物板之间仅有限的分离。mma化学修饰的乳胶颗粒给出了校准曲线，其具有改进的测定性能，包括测定精确度和准确度，但在两种样品类型(血清和血浆)之间存在大偏差。通过被动包被在固定在固相上的颗粒上的g6pdh-mma轭合物提供最佳的catalystsdma测定性能。颗粒导致测定具有优异的精确度、准确度和稳定性。
如实施例9中所述，还使用traut试剂或spdp研究抗sdma-酶轭合物。形成的轭合物被示出在sdma测定中提供宽动态范围并改善测定性能。
如表1所示，bsa-mma/bsa-sdma对乳胶颗粒(-25％)的包被效率远低于klh-mma/klh-sdma和g6pdh-mma/g6pdh-sdma的包被效率(～95％)。klh-mma和klh-sdma包被的乳胶颗粒在它们被点样在载玻片上之前在储存条件下聚集，导致测定的大变化，除非在点样之前对颗粒进行充分超声处理。当将载玻片在37℃下温育一周时，如果将klh-mma直接点样在fusion5载玻片上则是稳定的。但是当将载玻片在37℃下温育两周时不稳定。g6pdh-mma在乳胶颗粒上具有高包被效率，并且在干燥的载玻片上非常稳定，即使在37℃下温育两周，因此为sdmacatalyst测定提供了最佳固相。
表1
表2示出了使用固相与被动包被的klh-mma和klh-sdma颗粒的测定性能的比较。
表2
表3示出了使用固相与具有被动包被的g6pdh-mma、g6pdh-adma和g6pdh-sdma的固定化颗粒的测定性能的比较。
表3
如表3所示，具有被动包被的g6pdh-mma、g6pdh-adma或g6pdh-sdma的固定化颗粒可各自用于catalystsdma测定。
表4示出了使用固相与具有被动包被的bsa-mma和bsa-sdma的固定化颗粒的测定性能比较。
表4
实施例15：分析测定性能
对于犬样品和猫样品，将dxsdma测试性能与lc-ms和测定(参见美国专利公开第2016/245801号)进行比较。
实施例16：比较共价连接的胺-mma颗粒和被动包被的g6pdh-mma颗粒中血清/血浆偏差
在匹配的血清和血浆样品上进行catalystsdma测定，其为共价连接的胺-mma颗粒或被动包被的g6pdh-mma颗粒。实验一式两份进行。样品偏差如下计算：(血清sdma(μg/dl)-血浆sdma(μg/dl))/((血清sdma(μg/dl)+血浆sdma(μg/dl))/2)，这反映了血清和血浆值之间的差值除以血清和血浆值的平均值。
如表5和图7a中所示，在犬样品中，观察到用胺-mma共价连接的颗粒的64-82％的血清/血浆偏差。相比之下，观察到用被动包被的g6pdh-mma颗粒的0％至11％的血清/血浆偏差。因此，被动包被的g6dph-mma颗粒极大降低了用共价连接的胺-mma颗粒在犬样品中观察到的血浆/血清偏差。
如表6和图7b中所示，在猫样品中，观察到用胺-mma共价连接的颗粒的-36％至35％的血清/血浆偏差。相比之下，观察到用被动包被的g6pdh-mma颗粒的-3％至6％的血清/血浆偏差。因此，被动包被的g6dph-mma颗粒极大降低了用共价连接的胺-mma颗粒在猫样品中观察到的血浆/血清偏差。
表5
表6
实施例17：被动包被的g6pdh-mma颗粒和被动包被的卵白蛋白-mma颗粒中的血清/血浆偏差
在20对的犬血清和血浆样品上进行catalystsdma测定，其为g6pdh-mma颗粒(图8)或卵白蛋白-mma颗粒(图9)。图8和9中的图表的y轴描绘了实际和测量的sdma浓度(μg/dl)之间的差异。这种差异被称为“偏见”。实验一式两份进行。g6pdh和卵白蛋白包被均导致血清或血浆中测量的sdma值之间的偏差最小。此外，血清样品中实际和测量的sdma值之间的偏差最小，血浆样品中实际和测量的sdma值之间的偏差最小。
实施例18：被动包被的蛋白质-mma颗粒的稳定性
评估在颗粒上的蛋白质-mma被动包被稳定性。
在水溶液中的稳定性
在含有高盐浓度的水溶液中的稳定性
为了评估被动包被对高盐浓度的耐受性，用g6pdh-mma被动包被的颗粒进行sdma测定，在4℃下用1mnacl预处理过夜和不预处理。用sdma标准品在0、6.25、12.5、25、50和100μg/dlsdma下进行测定。
图11示出了使用g6pdh-mma被动包被的颗粒在用和不用1mnacl预选温育和没有预先温育情况下的catalystsdma校准曲线。实验一式三份进行。sdma校准曲线在暴露于1m氯化钠的颗粒(标记为“剥离”)或对照颗粒(标记为“未剥离”)的颗粒之间难以区分。这表明g6pdh-mma被动包被的颗粒在4℃下在1m氯化钠中过夜是稳定的。
在表面活性剂中的稳定性
将g6pdh-mma被动包被的颗粒在4℃下在含有或不含有0.1％表面活性剂20(聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的缓冲液中温育过夜(>12小时)。过夜温育后，将颗粒用于catalystsdma测定。在加入sdma的犬血清中制备sdma校准物至终浓度为0、20、40、60、80或100μg/dl。得到的校准曲线在图12中示出。数据表明，表面活性剂的预温育对测定中g6pdh-mma被动包被的颗粒的性能没有影响。
进行另一个实验以比较g6pdh-mma、bsa-mma和klh-mma被动包被的乳胶颗粒的表面活性剂耐受性。将每种类型的轭合物包被的乳胶颗粒用0.1％，或1％tween20在储存缓冲液中于4℃处理过夜。通过microbca试剂盒测量释放到储存缓冲液中的蛋白质，以确定残留在颗粒上的轭合物的百分比。如表7所示，在三种类型的轭合物中，bsa-mma包被的乳胶颗粒在tween20存在下最不稳定。相比之下，即使用1％tween20温育，g6pdh-mma包被的乳胶颗粒也显示出最高的耐受性。klh-mma包被的颗粒对表面活性剂处理相对耐受，但是颗粒在储存期间容易聚集，导致测定精度差。
表7
总之，详述的各种实验表明g6pdh-mma包被的乳胶颗粒示出最高的包被效率和稳定性。g6pdh-mma颗粒也保持单分散于储存和点样缓冲液中，并且与用诸如bsa-mma和klh-mma的其它轭合物包被的颗粒相比提供最佳测定性能。
实施例19：将klh-mma直接包被到测定载玻片上。
图13示出了使用直接包被在载玻片膜上的蛋白klh-mma轭合物(实施例2)的sdma校准曲线。将35μl等分试样的klh-mma轭合物(14.3μg/ml，在具有2％蔗糖和0.05％tween20的磷酸盐缓冲液中)置于预组装的具有fusion5单层基质膜(gehealthcarelifesciences)载玻片上(参见us2014/0315216)。然后将载玻片在49℃的干燥通道中干燥，且流率为745保持30分钟。sdma校准物在未剥离的犬血清中制备。将校准物用抗sdma-hrp轭合物以0.6μg/ml在室温下温育2分钟。将混合物的两份11μl等分试样施加到载玻片上。用9μl清洗缓冲液清洗固相三次。加入tmb底物的两个1.5μl等分试样。然后在645nm处以0.5秒的间隔读取两分钟内载玻片的od。图上的每个点代表一式三份实验的平均结果。
应理解，本公开不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因为这些可以如本领域技术人员将认识的那样变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不意图限制本公开的范围。还应注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“连接基团”的提及是指一种或多种连接基团及其本领域技术人员已知的等同物。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本公开的实施方式及其各种特征和有利细节参考非限制性实施方式更全面地解释和/或在附图中示出并在以下描述中详述。应当注意，附图中示出的特征不一定按比例绘制，并且如本领域技术人员将认识到的，一个实施方式的特征可以与其他实施方式一起使用，即使这里未明确说明。
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