2023年02月，浙江大学医学院范顺武教授/课题组在ScienceAdvances期刊发表的题为“Metaboliteasymmetricdimethylarginine(ADMA)functionsasadestabilizationenhancerofSOX9mediatedbyDDAH1inosteoarthritisx”（IF：14.957）的研究成果，通过非靶向代谢组学技术、组织学和免疫组织化学、蛋白质免疫印迹技术、蛋白质组学技术、Nano–LC-MS/MS等研究方法，发现了OA软骨细胞特征，探究了OA中ADMA调节的潜在机理，描绘了ADMA参与OA进展图谱，为OA诊断提供了理论依据。
基本信息
中文标题：代谢物不对称二甲基精氨酸作为SOX9的失稳增强剂DDAH1介导骨关节炎
研究对象：人软骨组织
发表期刊：ScienceAdvances
影响因子：14.957
合作单位：浙江大学医学院
运用生物技术：非靶向代谢组学技术、组织学和免疫组织化学、蛋白质免疫印迹技术、流式细胞术、蛋白质组学技术、Nano–LC-MS/MS
研究背景
骨关节炎（OA）是一种退行性疾病，主要由老化和机械损伤引起。在OA软骨细胞中，分解代谢调节因子释放多种炎症因子，最终导致细胞外基质（ECM）变性，使OA的发病机制陷入恶性循环。退化的软骨细胞和OA中，下调的二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶-1（DDAH1）伴随着不对称二甲基精胺酸（ADMA）的增加。ADMA诱导软骨细胞变性和衰老，并减少ECM沉积，而加速OA发展。研究ADMA在OA中的作用及对OA的影响，探究ADMA调节下游的潜在机制。
研究思路
研究方法
1.实验分组
1）DMM模型：C57BL/6小鼠，雄性，12周
2）老年OA模型组：C57BL/6小鼠
3）老年OA模型对照组：C57BL/6小鼠，4个月大
4）自发性OA模型组：OASTR/Ort小鼠
5）自发性OA模型对照组：CBA/CaCrl小鼠
2.技术路线
1)动物行为学测定：热板法、旋转棒法和6分钟距离法
2)LC-MS：细胞ADMA检测
3)显微CT分析：小鼠软骨组织
4)微物质培养：评估ECM沉积
5)3D琼脂糖培养：软骨细胞
6)实时定量PCR分析：QuantStudio6Flex实时PCR系统
7)细胞计数试剂盒-8测定：软骨细胞
8)NO测定：NO检测法
9)GSTpull-down：检测蛋白质
3.统计分析
研究结果
1.OA软骨细胞中ADMA的增加触发软骨变性
OA患者和患者软骨细胞的代谢组学证明了代谢产物的一系列改变（图1A）。LC-MS确认OA软骨细胞中ADMA水平升高，其异构体对称二甲基精氨酸（SDMA）的变化（图1B）。
免疫组织化学染色证实，暴露于ADMA软骨中的II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达降低（图S1H）。热板分析、旋转棒分析和开放场分析显示，注射ADMA的小鼠疼痛阈值和运动能力显著较低（图S1I），说明退化的软骨细胞中ADMA的增加会引发软骨退化和衰老。
图1|DDAH1上调ADMA加速OA形成
2.下调的DDAH1负责OA中ADMA的升高
与非OA组织相比，DDAH1在OA组织中的RNA表达较低，而DDAH2的RNA表达较高（图S2C）。通过三种不同的OA动物模型表明，DDAH1在OA中被抑制，从而增加软骨细胞中ADMA水平（图1C-D）。
免疫印迹蛋白技术和免疫组织化学证实了DDAH1的缺失（图1H和图S3A）,微质体培养和3D琼脂糖培养显示DDAH1/原代软骨细胞中ECM沉积较低（图1E-F）。
20周龄的DDAH1/小鼠中DDAH1缺失，显著加速了DMM诱导的OA小鼠的软骨退化（图1G）,免疫组织化学显示DDAH1/小鼠软骨中II型胶原和聚集蛋白聚糖减少（图1H）。
3.软骨特异性DDAH1参与OA进展
RT-PCR显示合成代谢因子（COL2A1和ACAN）减少，代谢因子（MMP3和MMP13）增加（图2A），聚集蛋白聚糖和COL2A1的蛋白表达显著DDAH1缺失后下调（图2B），软骨中DDAH1的缺失可能导致DMM术后严重的软骨损伤（图2C和图S5C）。
在Col2-CreERT2、DDAH1fl/fl和ACAN-CreERT2小鼠软骨中II型胶原和聚集蛋白聚糖的蛋白表达显著降低（图2D和图S5D），DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2小鼠中则观察到较多的骨赘和较高的软骨下骨体积（图2E-F和图S5E-F）。
这些数据表明软骨特异性DDAH1敲除对OA进展至关重要，而DDAH1的过表达对OA具有治疗作用。关键合成代谢因子II型受损软骨中DDAH1过表达后，膝关节软骨中的胶原和聚集蛋白聚糖显著上调（图S6B）。
热板、旋转杆和6分钟距离法表明其疼痛阈值显著提高（图S6C）。LC-MS证实了DDAH1过度表达的软骨细胞可降低ADMA（图S6D）。表明DDAH1可部分逆转DMM诱导的OA。
图2|软骨特异性敲除DDAH1加速OA进展
4.ADMA激活SOX9的泛素蛋白体途径
免疫组织化学显示，SOX9的表达来自PD404182或DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl，ACAN-CreERT2小鼠（图3F-H）。ADMA中的SOX9半衰期短于对照细胞，证明ADMA导致了SOX9的不稳定。而MG132阻断了SOX9的衰变而氯喹却没有，表明SOX9的降解依赖于蛋白酶体途径，而不是溶酶体途径（图3I-J）。
ADMA诱导了SOX9衰变，并在过表达的DDAH1软骨细胞中部分逆转，通过泛素-蛋白酶体途径触发了SOX9的降解，增加了SOX9的水平（图3K-L）。
图3|ADMA通过泛素-蛋白酶体途径诱导SOX9降解
5.ADMA阻断SOX9与USP7交互途径
共聚焦显微镜显示USP7和SOX9共定位，ADMA处理细胞后，SOX9的荧光信号减弱，而USP7没有改变（图4-F)。分子对接技术预测ADMA、USP7和SOX9之间相互作用模型，发现ADMA可阻断SOX9和USP7之间的相互作用区域，并可减弱其相互作用(图4G-H)。
ADMA刺激免疫印迹中SOX9蛋白水平导致不平衡，调整SOX9蛋白水平后发现，ADMA处理的软骨细胞中USP7和SOX9之间的相互作用减少(图4I)。GST下拉分析验证了USP7和SOX9之间的直接结合作用可被ADMA部分阻断（图4J）。
抑制USP7后，ADMA未能影响SOX9的表达和泛素粘附在SOX9上的表达(图4K-L)。DMM术后1周，将USP7AAV关节注射到DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2小鼠膝关节，免疫组化结果显示，DMM术后8周软骨损伤得到明显修复，SOX9、II型胶原蛋白和聚集蛋白表达分别增加(图4M-N)。
图4|ADMA阻止SOX9和USP7之间的交互途径
6.滑膜液中的ADMA是一种潜在的OA诊断指标
近几十年来，OA的诊断主要依赖于临床症状和放射学。而在临床实践中，OA患者的软骨细胞和滑液中ADMA显著增加。ADMA能够区分OA患者和相对健康的患者，并且在早期诊断OA方面具有良好的敏感性和特异性。尽管需要更多的样本，但滑膜液中的ADMA可能仍然是OA诊断的潜在生物标志物。
图5|滑液中ADMA可预测OA的诊断
OA发病过程中，软骨细胞中的许多酶发生变化，导致一系列代谢变化，使其某些代谢产物可能是OA的诊断标志物，代谢产物ADMA的增加，伴随着DDAH1的下调。受DDAH1调节，ADMA通过促进软骨细胞变性和衰老而加速OA的发展，而不是依赖于NOS/NO通路。ADMA直接与SOX9和USP7结合，并阻断相互作用区域。
SOX9的降解依赖于蛋白酶体途径，而不是溶酶体途径，通过促进SOX9泛素-蛋白酶体途径进行降解，增加SOX9的水平。
研究结论
通过研究表明，OA软骨细胞滑液中ADMA显著增加，对早期OA诊断具有良好的敏感性和特异性，且能够区分OA患者和相对健康患者，说明滑液中的ADMA可能是诊断OA的潜在标志物，对OA早期诊断具有预测价值。ADMA的增加伴随着软骨细胞中DDAH1的下调，可在体内和体外诱导软骨细胞基质降解，促进软骨细胞变性和衰老，加速OA的进展。揭示了ADMA的靶点，并探讨了ADMA调节的潜在机制。
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