空肠弯曲菌是革兰氏阴性微需氧菌,主要存在于家禽和野禽体内,是一种人畜共患的细菌病原体,会引发腹泻、流产、不育、乳房炎以及传染性肝炎等疾病。世界卫生组织已将空肠弯曲菌定义为常见的食源性致病菌之一。微酸性电解水(SAEW)是在无隔膜电解槽中电解稀盐或稀盐酸溶液而生成的具有特殊理化性质的水溶液,因具有杀菌高效广谱、腐蚀性低、安全环保、pH值更加温和等优点,已在食品行业中广泛应用。
西北农林科技大学食品科学与工程学院的宋欣坤、庞柳欣、张春玲*等以空肠弯曲菌作为研究对象,考察SAEW对纯培养空肠弯曲菌的杀灭效果,以及有机质对杀菌效果的影响,同时对SAEW杀灭多代空肠弯曲菌的效果进行评估,以确保SAEW杀菌方式的安全性;最后,对SAEW杀灭空肠弯曲菌的特性和机制进行研究,以期为SAEW对食品中空肠弯曲菌的杀灭提供理论依据。
1不同ACC的SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果
采用不同ACC的SAEW和NaClO溶液对空肠弯曲菌进行2min杀灭处理。由图1可以看出,随着ACC的增加,SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果逐渐增强,呈浓度依赖性。相同ACC时,SAEW处理后空肠弯曲菌的减少量显著大于NaClO处理(P<0.05),表明SAEW杀灭作用更强。有研究表明,ACC为20mg/L的SAEW处理1h或2h后,空肠弯曲菌减少1.5~1.7(lg(CFU/g)),抑制作用显著大于相同ACC的酸性电解水处理组。
3蛋白质对SAEW杀灭空肠弯曲菌的影响
3.1
不同蛋白质量浓度SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果
在不同质量浓度BSA干扰下,采用ACC为30mg/L的SAEW处理空肠弯曲菌2min,结果如图3所示。随着蛋白质量浓度增加,SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果逐渐减弱,BSA为0g/L时,SAEW处理组空肠弯曲菌减少量为5.72(lg(CFU/mL)),BSA为30g/L时,SAEW处理组为3.41(lg(CFU/mL)),与BSA质量浓度为0g/L时相比下降了40.38%,不同蛋白质量浓度对SAEW杀菌效果的影响有显著差异(P<0.05)。相同蛋白质量浓度下,NaClO处理组杀灭效果弱于SAEW处理组。有研究发现SAEW杀菌效果会随着蛋白质浓度的增加而减弱。Ni等研究也发现,SAEW处理大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效率随着ACC的增加而增加,随着BSA质量浓度的增加而降低,并且增加蛋白质浓度可以加速SAEW的ACC的降低。以上研究表明,蛋白质会显著影响SAEW和NaClO的杀灭效果,蛋白质量浓度越高,SAEW的杀菌效果越差,因此在SAEW的实际应用中应降低接触蛋白质的浓度,保证SAEW的杀灭效果。
3.2
蛋白质存在时不同ACC的SAEW对空肠弯曲菌的杀灭效果
在10g/L蛋白质存在时,采用ACC分别为10、20、30、40mg/L和50mg/L的SAEW和NaClO溶液处理菌液2min,结果如图4所示。随着ACC的增加,SAEW对菌液的杀灭效果逐渐增加,当ACC小于20mg/L时,SAEW处理组和NaClO处理组的杀菌效果无显著差异(P>0.05),推测蛋白质在一定程度上干扰了ACC较低时SAEW中游离氯的作用,当ACC大于20mg/L时,即使存在蛋白质干扰,SAEW的杀菌效果也强于NaClO,表明当ACC小于20mg/L时,蛋白质消耗了大部分有效氯,导致杀菌效果大大减弱。在电解水应用于肉类工业的研究中发现,有机物存在时,与NaClO的杀菌效果相比,SAEW的杀菌效果更稳定。因此在处理肉类等含有蛋白质的样品时,应选取合适ACC的SAEW处理样品。
3.3
4SAEW多代杀菌效果
采用ACC为10mg/L的SAEW对多代培养的空肠弯曲菌处理2min,考察SAEW的杀灭效果,结果如图6所示。SAEW对第一代菌的杀菌率为26.3%,之后每代的杀菌率均在24.95%~29.80%,且差异较小。梁铎通过连续多代处理,分析SAEW对单增李斯特菌的多代杀菌效果,第一代杀菌率为56.33%,之后每代的杀菌效果均在47.71%~82.75%之间,且差异不显著(P>0.05),这表明单增李斯特菌在10代之内对SAEW不产生耐药性。由实验结果可知,10代以内空肠弯曲菌不会对低浓度SAEW产生耐受性而降低杀菌效果,因此,可以采用SAEW杀灭空肠弯曲菌。
5SAEW处理对空肠弯曲菌细胞活力的影响
6SAEW处理对空肠弯曲菌形态的影响
对不同ACC的SAEW处理了2min的空肠弯曲菌形态通过扫描电子显微镜进行观察,以无菌去离子水作为对照,结果如图9所示。无菌去离子水处理的菌体图像呈现较完整和光滑的弯曲形(图9A),而SAEW处理的菌体表面能清楚地观察到不规则、褶皱、凹陷、破损甚至破裂(图9B~F),且菌体表面损伤程度随着ACC的增加而增加。类似研究发现,SAEW会破坏和损伤大肠杆菌和枯草芽孢杆菌,使其形态发生改变,推测SAEW可能通过改变菌体形态、增强膜的渗透性和细菌悬浮液中的导电性,导致钾离子和蛋白质从细菌细胞中释放出来。以上研究表明,SAEW处理会改变菌体形态,导致其表面呈现不同程度的损伤,因此可以推测SAEW可能通过改变和破坏菌体形态结构杀灭空肠弯曲菌。
7SAEW处理对空肠弯曲菌细胞膜损伤的影响
7.1
SAEW处理后空肠弯曲菌细胞内DNA的泄漏情况
7.2
SAEW处理后空肠弯曲菌细胞内蛋白质的泄漏情况
蛋白质量浓度可以反映细胞膜的完整性,已测定的标准曲线表明OD570nm与蛋白质量浓度有良好的线性关系(y=0.5772x+0.6308,R2=0.9962),根据标准曲线得到的样品中蛋白质量浓度的结果如图11所示。与对照组相比,蛋白质泄漏质量浓度随着ACC的增加而增加,呈浓度依赖性,且ACC大于等于30mg/L时,蛋白质泄漏质量浓度显著增加(P<0.05)。有研究表明酸性电解水可以通过增加细胞膜的渗透性导致细胞内成分的泄漏,从而抑制细菌生长,与本研究结果一致。Osafune等报道细胞质结构会被酸性电解水冲洗出细胞壁。因此,可以推测SAEW通过增加细胞膜的通透性,导致细胞质成分泄漏,从而杀灭空肠弯曲菌。