采集一头牛牧场未发霉、品质优良的揉丝玉米秸秆。试验所用的枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、米曲霉菌和葡萄糖氧化酶(2000μ/g)均，活菌数1.0X108CFU/mL。
1.2试验设计
试验采用单因素完全随机设计，设置未发酵玉米秸秆为对照组（CK），6个试验组，分别为3个复合菌组，即T1组（枯草芽孢杆菌50%、植物乳杆菌25%、假丝酵母菌25%）、T2组（地衣芽孢杆菌50%、植物乳杆菌25%、假丝酵母菌25%）、T3组（枯草芽孢杆菌50%、米曲霉菌25%、假丝酵母菌25%），3个复合菌酶组，即TG1组(T1+0.5%葡萄糖氧化酶)、TG2组(T2+0.5%葡萄糖氧化酶)、TG3组(T3+0.5%葡萄糖氧化酶)，每组3个重复。将揉丝玉米秸秆切短至4~5cm，按试验设计，干物质基础上将1kg玉米秸秆、0.5%尿素、2%硫酸钱、5%复合菌(菌液形式加入)、0.5葡萄糖氧化酶混合均匀，袋装抽真空封口发酵，发酵60d后开包分别取对照组和试验组样品，分析发酵玉米秸秆的常规营养成分、霉菌毒素、瘤胃发酵参数和体外消化率。
1.3测定指标与方法
1.3.1常规营养成分
采集对照组样品和试验组发酵好的玉米秸秆，根据试验需要量，称取样品并检测发酵后秸秆常规营养成分含量。采用烘干法测定干物质（DM）；凯氏定氮法测定粗蛋白(CP)；滤袋法测定粗纤维(CF)；灼烧法测定粗灰分(Ash)；洗涤纤维分析法测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维（ADF）；高锰酸钾法测定钙(Ca)；分光光度法测定磷(P)。
1.3.2霉菌毒素
称取适量对照组玉米秸秆和发酵后的样品，根据高效液相法操作步骤进行检测，霉菌毒素主要测定黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。
1.3.3瘤胃发酵参数
1.3.4体外消化率
干物质体外消化率(IVDMD)、粗蛋白体外消化率(IVCPD)、中性洗涤剂纤维体外消化率(IVNDFD)和酸性洗涤剂纤维体外消化率(IVADFD)通过活体外两阶段法测定。将纤维袋在65℃烘1h，未加样品的纤维袋做空白，称量2g样品，封口并放入培养瓶中，迅速将每个培养瓶中按照1:3的比例加入提前预热至39℃的瘤胃液和缓冲液，充分混合并充入CO2，盖上橡胶塞并密封。将培养瓶置于体外模拟培养箱中39℃恒温培养48h，培养完成后弃培养液，加入2L酸性胃蛋白酶溶液(1L0.lmol/LHCL中加入2g胃蛋白酶)继续培养48h，培养结束后，用冷水洗涤终止反应。在105℃烘箱中烘至恒重，准确称重测定DM含量，采用凯氏定氮法测CP含量，范氏洗涤纤维分析法测定NDF、ADF含量，IVDMD、IVCPD、IVNDFD及IVADFD计算公式如下:
IVDMD=样品DM含量-未消化DM含量)/样品DM含量×100%
IVCPD=(样品CP含量-未消化CP含量)/样品CP含量×100%
IVNDFD=(样品NDF含量-未消化NDF含量)/样品NDF含量×100%
IVADFD=(样品ADF含量-未消化ADF含量)/样品ADF含量×100%
1.4统计分析
试验数据采用Excel2010软件进行初步统计，再用SAS8.1软件进行单因素完全随机设计的方差分析，结果采用平均值士标准差表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2、试验结果
2.1菌酶协同处理玉米秸秆的常规营养成分
由表1可知，TG1组和TG2组DM和CP含量高于对照组（P<0.01）；复合菌酶组Ca含量高于复合菌组(P<0.01)；T1组P和Ash含量高于其他组(P<0.01)；T2组、T3组和复合菌酶组NDF含量低于对照组(P<0.01)，TG2组最低；6个试验组CF和ADF含量低于对照组(P<0.01)。
注:同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P
2.2菌酶协同处理玉米秸秆的霉菌毒素
由表2可知，TG2组和T2组黄曲霉毒素B1含量高于其他组(P<0.01)，但均在安全范围内（黄曲霉B1≤30μg/kg，玉米赤酶烯酮≤500μg/kg，脱氧雪腐镰刀菌烯醇≤1000μg/kg）；复合菌酶组玉米赤霉烯酮含量高于复合菌组(P<0.01)；T1组脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量低于除TG3组的其他组(P<0.01)。
2.3瘤胃发酵参数
由表3可知，试验组培养液pH低于对照组(P<0.01)，试验组间差异不显著，但TG2组最低；复合菌酶组6h和12h产气量高于对照组(P<0.05），TG2组最高；TG2组36h,48h和72h产气量高于T1组、T3组和对照组(P<0.05），但与TGl组、TG3组和T2组之间差异不显著；T2组6、12、36、48h和72h产气量与复合菌酶组差异不显著；T1组、T2组和复合菌酶组NH3-N含量高于对照组(P<0.01)；复合菌酶组MCP含量高于对照组(P<0.01)，复合菌组MCP含量与对照组差异不显著。
由表4可知，复合菌酶组和复合菌组乙酸、丙酸、丁酸含量均高于对照组(P>0.05)，TG1组和TG2组戊酸和总挥发性脂肪酸含量高于对照组(P<0.05)。
2.4体外消化率由表5可知，复合菌酶组IVDMD高于复合菌组和对照组(P<0.01),TG2组最高;复合菌酶组IVCPD高于T1组、T3组和对照组(P<0.01)，3个复合菌组间IVCPD差异不显著；TG2组IVNDFD高于其他组(P<0.01)；各处理组IVADFD均高于对照组(P<0.01)，但试验组间差异不显著。
3、讨论
3.1菌酶协同处理玉米秸秆对常规营养成分含量的影响
3.1.1ADF和NDF含量
我国玉米秸秆资源丰富，但其粗纤维含量高、粗蛋白含量低、适口性差，严重影响反刍动物采食量和消化吸收效率，NDF和ADF含量可反映饲料品质，NDF影响反刍动物的瘤胃充盈度和采食量，NDF含量与饲料能量呈反比，ADF含量与有机物消化率成反比。玉米秸秆的揉丝微生物发酵技术逐步兴起，经秸秆揉搓机操作，纵向拉丝揉搓，微生物发酵后可制成适口性好、营养价值高的饲料，本研究中，T2组、T3和复合菌酶组NDF含量低于对照组，6个试验组ADF含量低于对照组。说明菌酶制剂协同处理玉米秸秆可以降低NDF和ADF含量，可能由于早期地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵母菌和GOD协同作用改变玉米秸秆中纤维结构，提高乳酸含量，进而软化秸秆木质纤维，促进纤维素的释放和降解。采用菌种和酶制剂协同发酵玉米秸秆，可降解纤维素、半纤维素等，促进发酵，提高饲料利用率，研究表明，采用酶菌复合制剂处理玉米秸秆其NDF、ADF含量显著降低。
3.1.2DM和CP含量
3.2菌酶协同处理玉米秸秆对产气量的影响
秸秆中可发酵性碳水化合物能被发酵培养液中的瘤胃微生物利用，产生较多的挥发性脂肪酸、CH4和CO2等气体。体外产气法可快速评估饲料的营养价值，反映瘤胃中微生物的生物活性、饲料降解效率和发酵程度。产气量与可发酵性碳水化合物含量呈正比，饲料的营养价值越高，微生物活性越强，产气量也就越高。本试验中，TG2组48h产气量高于复合菌组和对照组，说明发酵过程中地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌协同效果较好，添加菌种可能与原有菌群相互促进，且在GOD作用下充分利用发酵底物，维持内环境稳定，进而提高酶活性和发酵效果，与研究结论一致。
3.3菌酶协同处理玉米秸秆对瘤胃发酵参数的影响
3.3.1pH
优质青贮饲料应具有较高的乳酸含量和较低的pH和丁酸水平。pH可反映发酵过程中酸碱平衡关系，由可吸收的营养成分决定。本研究中，试验组培养液pH显著低于对照组，且TG2组最低，pH降低可能因为加入地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌协同GOD促进营养物质吸收利用，产生乳酸及其他有机酸，且在体外试验中没有瘤胃壁不能吸收，造成挥发性脂肪酸积累，引起pH降低，这与研究结果相同。
3.3.2NH3-N和MCP含量
NH3-N是瘤胃中饲料含氮物质分解的最终产物，可促进微生物合成蛋白质，反映瘤胃内微生物氮的供应状况，瘤胃内微生物所需最佳浓度为6.30~27.50mg/dL。瘤胃内NH3-N浓度过低，限制纤维素的分解和微生物合成蛋白质，过高经机体代谢排出体外，造成浪费。MCP是反刍动物最主要的氮源，在充足的情况下，能量是MCP合成的第一限制性因素，主要取决于可发酵碳水化合物的发酵速率，与微生物生长效率成正比。本研究中，试验组NH3-N浓度是21.20~24.93mg/dL，均在最适范围内，T1组、T2组和复合菌酶组NH3-N含量高于对照组，复合菌酶组MCP含量高于对照组，说明复合菌与GOD处理玉米秸秆利于提高MCP和NH3-N含量，可能是发酵过程中GOD促进有益菌生长，提高消化酶活性，协同植物乳杆菌促进秸秆中纤维素分解，释放出的营养物质含量增加，枯草芽孢杆菌促进蛋白利用，地衣芽孢杆菌促进肠道吸收，地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌和GOD相互促进，进而MCP含量升高。服道菌酶协同处理玉米秸秆，NH3-N含量降低，与本试验结果相反，可能是由于发酵初期，TG2组复合菌协同GOD分解蛋白质效果较好，使NH3-N含量升高。
3.3.3VFA
VFA是反刍动物瘤胃中饲料的碳水化合物和蛋白质的最终分解产物，可为畜禽机体提供70%~80%的能量，可反映瘤胃内环境稳定性和瘤胃发酵状况。VFA的主要组分是乙酸、丙酸和丁酸，乙酸可促进提高畜禽体脂率，丙酸可促进机体转化和贮存葡萄糖，丁酸能为机体组织提供所需能量。本研究中，试验组总VFA含量高于对照组，表明复合菌及其与GOD协同处理玉米秸秆，均可促进营养物质的利用，进而提高VFA产量，且菌酶协同效果更佳。VFA含量升高可能是因为发酵过程中菌酶协同且分泌大量蛋白酶、消化酶等，充分利用秸秆中的营养物质，这与研究结果一致。
3.4体外消化率
体外消化率可反映养分被消化利用的难易程度与微生物对饲料的降解效果，影响干物质采食量和生产性能。本研究中，TG2组IVDMD、IVCPD、IVNDFD和IVADFD高于其他组，可能是GOD促进地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌合成丰富的消化酶，软化秸秆木质纤维，打破纤维结构的束缚，破坏细胞壁结构，促进细胞内容物的释放，研究结果一致。
4、结论
本试验结果显示，地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵母菌与GOD组DM、CP含量最高，NDF和ADF含量较低，各项霉菌毒素含量均在安全范围内；体外产气培养液pH最低，6、12、36、48h和72h产气量、VFA及MCP含量显著提高；营养物质体外消化率有所改善。因此，TG2组菌酶协同作用效果最好，以期为后续生产提供理论基础。
本产品符合饲料卫生标准
【生产许可证号】桂饲添（2021）H01001
【产品执行标准】Q/NNWR02-2021（饲用复合微生物添加剂Ⅰ）
【适用对象】畜禽、水产、环保
【原料组成】酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌等，复合酶制剂与载体等。
【产品成分分析保证值】酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌等合计≥100亿cfu/g，水分＜9.0%。
净重：200克/袋。
本产品是在活力99生酵剂的基础上的升级产品，升级了増香增甜等功能效果。
鉴别本产品真假与效果的简单方法：500毫升左右的矿泉水瓶子中放入约50克大米+300毫升35℃左右的温水，加入本产品5克，几个小时就会产生大量香醇气体，72小时内大米基本溶解为乳状。做试验时请切记要注意矿泉水瓶炸开的安全。
（一）制作加强型活性EM菌液
在非金属容器中将本品1包（200克）与1公斤红糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉类的饲料代替）放入约50公斤温水中，简单密封48小时后就变成了加强型活性EM菌液（每毫升活菌在100亿左右）。其使用方法如下：
1.在畜禽上的使用方法：根据不同动物与饲养周期按其饲料重量的0.1%-0.5%拌入饲料或饮水中后饲喂或饮用。
2.养殖场紧急除臭生物消毒：取加强型活性EM菌液兑水30倍清水，对产生臭味与异味的养殖区域、粪污水道、粪堆、污水池进行喷洒，以喷洒表面湿润为准，接待参观前1-3小时补喷一次效果更好。
3.制作青贮饲料：每吨青贮饲料中加入10公斤加强型活性EM菌液，简单喷洒在料上压实密封发酵15天以上。
4.养殖水产上的使用：每亩使用5公斤加强型活性EM菌液进行喷洒，晴天进行喷洒后注意增氧。
（二）制作各种发酵饲料
本品能够发酵木薯渣、豆渣、米粉面条加工下脚料、剩菜剩饭、米糠、统糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黄秸秆、牧草、红薯藤、轻度霉变饲料等各种廉价饲料（下脚料）、各种饲料原料与全价饲料等，每500公斤待发酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加强型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉类的饲料原料、1公斤食盐（含有足够食盐的原料就不添加），含水量调节到约60%，压实密封发酵2-7天左右有浓郁香味时即可使用。发酵后饲料的适口性、营养、消化率较未发酵前有明显提升。发酵后的饲料根据不同动物与不同饲养周期按照10%-50%与该动物其它全价饲料混合后饲喂（先少量饲喂适应后逐渐增加的原则），不可以单独饲喂或全部饲喂发酵饲料。
（三）发酵水产动物饲料成高浓度乳酸菌保健品
①部分发酵饲料运用：100公斤水产饲料、50公斤清水、本品1包密封发酵7天以上变成高浓度乳酸菌发酵饲料，以10%比例与水产动物饲料混合后饲喂，或者发酵饲料单独饲喂；②全部发酵饲料饲喂：也叫轻度发酵饲料技术，300公斤水产全价饲料、本品1包、水120公斤混合发酵24小时全部饲喂，这种预消化结合大量乳酸菌饲喂能够显著改善水产动物肠道健康、水质改善等优点。
（四）发酵部分禽粪做饲料
发酵鸡粪（鸽子粪、兔粪等）作猪、鱼等动物饲料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉类的饲料原料、500公斤鸡粪，加入适量麦麸或米糠调节含水量约为55%-60%，覆盖薄膜进行发酵，一周左右有浓郁香味时即可使用，可代替饲料20%左右，用于喂猪或鱼类等。
（五）发酵菜粕、棉粕、花生饼、茶枯脱毒
原料1000公斤，玉米面其它含淀粉类的饲料原料100公斤，食盐2公斤，含水量调节到55%左右，本品2包，简单地搅拌均匀，密封发酵15天以上成为高浓度乳酸菌小肽丰富的生物蛋白饲料，喂前摊开透气10分钟再作为蛋白质原料使用于自配饲料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的发酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。
（六）中草药及中药渣发酵方法
1.固态中草药发酵技术：将50公斤中草药粉碎，越细越好放入40公斤的35℃左右的温水中，加入玉米粉与豆粕各5公斤、本品1-2包、食盐100克，放入塑料容器内压实密封发酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照饲料比例的1%以上添加到饲料或饮水中使用。
2.液态中草药发酵技术：1公斤中草药+1包本品+1公斤红糖+20公斤清水混合在非金属容器中简单密封发酵72小时以上后使用。每吨饲料中添加10公斤或每吨饮水中添加5公斤。
（七）直接拌料或饮水、制粒饲喂、制作水料
根据不同动物在每吨饲料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2吨饮水中使用；本产品采用微生物多层包被技术，在每吨3包本品混合饲料中直接制粒，90℃下5分钟不会影响效果；动物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全价饲料、1000公斤清水混合后发酵6小时以上后饲喂（预消化的轻度发酵模式），24小时内饲喂完。
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