人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1及膀胱癌细胞株5637、J82、T24、TCCSUP、UMUC3均购于中国科学院细胞库。临床标本取自2013年1月至2016年1月我院114例行根治性膀胱切除术，纳入患者术前均未行放化疗及免疫治疗等治疗，均经组织病理学证实为膀胱尿路上皮癌及癌旁组织(癌旁组织选择距癌灶边缘5cm以上)，患者住院资料均完整。其中男性74例，女性40例，年龄35~77(62.5±8.3)岁；TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者69例，Ⅲ~Ⅳ期患者45例；高、中分化患者63例，低分化患者51例。所有的组织样本采集后均立即置于液氮中保存。本研究经我院伦理委员会批准(批件号：2012-0064)。
RPMI1640、DMEM、F12K培养液及PBS购自美国GIBCO公司；胎牛血清购于杭四季青公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；DEPC水购自武汉塞维尔生物技术有限公司；反转录及miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBRGreen)购自大连宝生物公司，miR-124原位杂交探针序列、miR-124模拟物(miR-124mimic)、miR-124抑制剂(miR-124inhibitor)及其阴性对照(miRNA-NC)均购自广州锐博生物公司；封闭液和预杂交液均购自福州迈新生物公司。脂质体Lipofectamine2000均购自美国Invitrogen公司。CCK-8细胞增殖试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；兔抗人PCNA、Ki-67、AKT、p-AKT和β-actin单克隆抗体以及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国CST公司。
SV-HUC-1细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的F12K培养基培养；J82细胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM培养；5637、T24、TCCSUP、UMUC-3细胞于含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的RPMI1640培养基中培养；细胞置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。
用TRIzolRNA提取试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，采用PTC-100/PTC-200型PCR仪按RT试剂盒说明反转录合成cDNA链；采用AppliedBiosystems7500RT-PCRsystem按说明进行PCR检测，设3个复孔，以看家基因GAPDH和U6作为内参，miR-124及U6引物序列为：miR-124上游引物序列为5′-ATGGCGGATGAAGTAATCGCG-3′，下游引物序列为5′-GAAACTCACAACTTGATCAGTTC-3′；U6上游引物序列为5′-ACAGCGTGCTAGATCATCAGC-3′；下游引物序列为5′-GGTCATGAGTCAGCCACGAT-3′。反应条件：95℃3min；95℃15s、60℃35s，循环40次；计算各组CT值，采用定量PCR中的相对定量法及2-△△Ct计算miRNA的表达水平。
将切除的新鲜标本尽快在4%多聚甲醛中固定4h，以免mRNA降解，制作石蜡切片并切厚度为4μm的连续切片；将石蜡切片行二甲苯脱蜡，水洗，3%H2O2室温作用10min，水洗2次；在切片上加入1mL3%柠檬酸和2滴胃蛋白酶，混匀37℃消化20min；PBS洗3次，每次5min，再水洗1次；湿盒底部加20%甘油保湿，每个蜡块20μL预杂交液，置于38℃恒温箱3h；每个蜡块20μL杂交液，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，在杂交仪中42℃杂交过夜；依次置于2×柠檬酸盐缓冲盐酸液(Salinesodiumcitratebuffer,SSC)液5min、0.5×SSC液15min、0.2×SSC液15min洗涤；滴加封闭液，37℃恒温孵育30min；滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃恒温孵育60min；PBS洗4次，每次5min；加DAB显色液，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明；最后中性树胶封片，显微镜观察。
根据组织阳性着色程度评分：无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分；根据组织中的阳性细胞数计分：0%~10%为1分；>10%~50%为2分；>50%~75%为3分；>75%为4分。两种评分方法乘积得到判定阳性结果：两者乘积<8为低表达，≥8为高表达。
经过处理的细胞铺种在6孔板中，待细胞生长良好吸去旧培养基，PBS冲洗细胞1~2次。加入含蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液，细胞刮刀将细胞刮下收集至EP管中，冰上裂解细胞30min，高速离心并收集上清，即为细胞的总蛋白，并置于-80℃冰箱保存；BCA法对蛋白进行定量，完成后加入上样缓冲液混匀，煮沸5min变性。配置的相应浓度的分离胶和浓缩胶，加样并进行电泳，后进行转膜操作，转膜完成后用10%脱脂牛奶封闭1h，TBST洗膜1~2次，裁剪条带后加入一抗4℃过夜孵育。第二日取出PVDF膜并用TBST洗涤3~5次，每次5min；随后加入二抗孵育1h，TBST洗涤3~5次，ECL发光试剂盒进行显影，化学发光仪检测并拍照。
采用SPSS20.0统计软件，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验；计数资料以百分数表示，采用χ2检验。使用Kaplan-Meier绘制生存曲线，采用Log-rank分析miR-124与膀胱癌患者临床预后的关系。