鉴于RTP是自然发生的，因此不需要实验训练来教动物玩耍。大鼠是研究RTP的一个特别好的模型物种，大鼠的RTP涉及竞争接近伙伴的颈背，如果接触，就用鼻子蹭。使用各种策略来攻击和防御颈背，包括在成功防御后发起反击。这种行为与严肃攻击不同，而且因为严肃攻击涉及攻击其他身体目标，即侧面和臀部，如果接触就会被咬伤。因此，当一场嬉戏的玩耍升级为严重的攻击时，可以很容易地辨别出来，因为侵略者从攻击颈背转向咬同伴的后背。由于超声波发声（USV）的使用对于竞争期间的交流至关重要，因此可以促进角色转换并避免升级为攻击（当大鼠进行嬉戏的互动时，它们会发出令人愉悦的50kHz超声波发声，其与RTP的关系可参考综述：DOI：10.1007/7854_2015_432）。
《动物模型构建与行为评估》pdf电子版V1.0
1．雄性和雌性幼年（4-5周龄）Sprague-Dawley大鼠
注意：
a．将动物保持在12：12小时的反向光照：黑暗循环中。
b．将每一只大鼠都与年龄、性别和给药处理相匹配的非兄弟姐妹同伴配对，这些“玩耍对”将在多天的测试中保持不变，以便每只动物每天都与同一个玩耍伙伴一起玩耍。实验包括来自至少两个独立窝别的大鼠。根据实验条件的数量，将测试至少两组玩耍对（2组配对的窝，或总共4窝）
c．出生时，通过剔除一定数量的幼崽，保持每窝的幼崽数为12-14只，以避免营养过剩/营养不足和产妇护理的混淆。每窝幼崽尽可能保持性别和药物处理平衡。并且由于产前睾酮在子宫内的潜在影响，不使用初始性别比（雄性：雌性或者雌性：雄性）大于>2：1的窝别。
2．测试药物
1．定制的有机玻璃测试场：49cmx37cm，高24cm（见图2A）。
2．配备红灯的行为测试房间。
3．一到两个带红色灯泡的灯架，用于照明测试场。
4．视频录制设备（或用手机）和三脚架支架。
5．锯末垫料，铺于测试场。
6．毛皮标记笔或永久性记号笔。
7．秒表或计时器。
8．清洁液。
测试后可以使用几种不同的清洁溶液对测试场进行消毒，但要保证测试时干燥无味。
图2．测试场和设置。A．单个行为测试场的图像。B．在三脚架前布置的四个测试场的图像，用于视频录制
1．在第一个测试日之前，设置行为测试房间。
a．确保红灯照明为视频录制提供适当的对比度。
b．如果一次测试多对动物，请布置所有测试场，以便记录设备可以充分记录它们。使用智能手机录制，能够同时记录4个测试场，并具有足够的细节和分辨率，见图2B。
c．在每个测试场中填充足够的新鲜垫料，以覆盖测试场的底部（约2-3cm深）。
2．在测试当天，将动物（在饲养笼中）从饲养室移入行为测试房间，让它们适应实验环境（测试前约20分钟和黑暗周期开始后至少1小时）。在黑暗期（大鼠的活跃期）进行测试对于正确的行为分析至关重要。
3．用毛皮标记笔（在头部或背部）或用永久性记号笔在尾巴上做标记，标记每对玩耍对中的一只动物。这有助于行为分析，因为更容易识别有标记或未标记的动物的特定行为。
4．一旦动物适应了，将一对动物放入测试场中，让动物适应测试场2分钟。
5．适应测试场后，记录行为10分钟。
6．测试结束后，停止录制。将动物从测试场中移出，并将它们放回笼子里。
7．根据需要多次重复步骤4-6，直到所有动物都经过测试。
8．在随后的几天中，重复步骤2-7。通常连续进行4天（P27-30）的测试，以捕捉峰值玩耍行为的性别差异；然而，在整个青少年时期（大约P26-35），可以每天重复测试。
（一）.数据收集
1．行为由对动物的性别和药物处理并不清楚的实验者离线评分。
3．为了评估粗暴的打闹行为，需要对以下行为进行评分（图1B）：
a．扑击：当一只动物向另一只动物的颈背或背部扑击时得分。这通常是一个剧烈的动作，并被将分数计给执行猛扑的动物。
动物可能会用力撞到对方或进行不那么猛烈的扑击。这些通常不计分，因为开始玩耍的意图比较模棱两可。
b．钉击：当一只猛扑的动物完全翻转到另一只动物的背上（四肢全部离开地面）时得分。扑击的动物通常也能得到钉击行为的得分，通常在猛扑后直接钉击另一只动物。
钉击通常是动物在继续比赛的时候被防守的结果。然而，这种动物可能会翻到自己的一边，保持它们脚上的重量。在这些情况下，不计入得分。
c．拳击：当两只动物用后腿站起来并用爪子互相攻击时得分。此时，两只动物都可以获得拳击分数。
拳击的频率远低于扑击或钉击，并且经常在追逐回合后观察到，即当被追逐的动物转身与追逐者对峙时。
相应行为的视频可以参考：DOI:10.21769/BioProtoc.3481.
4．以下行为也可以评分，但被认为是社交或运动玩耍行为：
a．追逐：当一只动物主动追逐另一只动物时得分。只有“追逐者”才能获得追逐的分数。
通常，追逐先于扑击或拳击行为。
b．弹跳步态：当一只动物在测试场上以一系列“跳跃”的方式移动时得分。
5．还可以对以下非玩耍社交行为进行评分：
a．肛门生殖器嗅探：当一只动物主动嗅探另一只动物的肛门生殖器区域时得分。
b．舔舐和梳理：当一只动物主动舔舐或梳理另一只动物的头部或肛门生殖器区域时得分。
c．蜷缩：当两只动物坐在非常近的地方/相互接触但不进行任何其他形式的社交行为（嗅闻/舔/梳理）时得分。两只动物都因蜷缩得分。
d．爬过：当一只动物从另一只动物身上或身下爬过时得分。
这通常发生在环境探索期间。
6．还可以对以下环境探索行为进行评分：
（二）.统计分析
1．如果年龄是感兴趣的实验因素，则可以将数据表示为每天的平均值，并使用重复测量方差分析进行分析（参见图3A）。
2．如果对年龄不感兴趣，则可以对单个动物的所有日子的数据进行平均，并根据实验组的数量使用t检验或方差分析进行分析（参见图3B-3E）。
图3．示例数据。A．样本数据显示P27-P30中雄性和雌性大鼠幼崽每天的总打闹（扑击、钉击和拳击）情况。B．样本数据显示A在所有四个测试日中的平均总打闹数据。C-E来自B的样本数据分解为扑击（C）、钉击（D）和拳击（E）的情况。数据表示为mean±SEM。蓝线和红线分别表示雄性和雌性。圆圈表示单个动物的值。*：P<0.05，**：P<0.01
1．在测试过程中，实验者应在窗帘后面或测试场的视线之外。此外，保持房间内安静，因为外部噪音可能会扰乱行为。
2．没有必要在试验之间清洁测试场或更换垫料。在每个测试日结束时，再清洁测试场并更换垫料，为第二天做准备。
3．请务必将红光强度保持在最低限度，以避免造成人为压力的测试环境。行为测试的照明通常小于50勒克斯。此外，SpragueDawley大鼠应使用红光，因为它们是白化品系，并且它们无法看到红光，使测试环境尽可能接近自然黑暗周期，以实现最佳行为测试。
3．虽然大鼠在打闹过程中会发出超声波发声，但这并不影响RTP的表达。
4．在第一个测试日之前，可以在旷场测试中测试动物的一般运动活动和探索行为，以排除组间活动差异的任何混淆。一般来说，雄性和雌性之间的基线活动没有差异，但实验操作可能会影响到这一点。
5．在测试场中填充过多的垫料会导致社交行为的减少和环境探索的增加，因为动物会开始在垫料下挖洞。
7．根据测试天数、动物年龄和药理学操作，动物可能在青春期开始时开始表现出性行为（约为P40）。在这种范式中，不建议将性行为视为一种社交行为，因为它很少发生；但是，如果实验中观察到它经常发生，则可以将其作为一组单独的行为进行分析，以确定青春期是否提前发生。
8．雄性和雌性玩耍行为是沿着从高到低的连续体表达的。虽然平均而言，雄性相对于雌性处于连续体的“高端”，但存在相当数量的自然个体变异。每组动物都可能有一些高水平打闹的雌性和低水平玩打闹的雄性。这种自然的行为变异性并不是将这些动物排除在分析之外的理由；相反，应设计具有足够样本量的实验来解决这一点。建议每种性别至少8只动物。
9．玩耍对应该是同样的性别，同样的实验处理。在给定的玩耍对中混合性别或实验处理可能会导致中间玩耍表型（即，更顽皮的伙伴会增加低玩耍大鼠的玩耍行为，反之亦然）。
1．优点
2．缺点
然而，二元范式实现的控制水平的缺点是大鼠失去了选择其玩耍伙伴的权力，因为选择同伴的是实验者。并非所有同伴都像玩伴一样有吸引力。当大鼠在有多个伙伴的小组中进行测试时，RTP不会均匀分布。相反，一些同伴比其他同伴更受青睐，这不仅仅是哪只动物最接近的结果，因为大鼠会离开场地一侧的动物陪伴，然后前往另一侧开始与特定同伴玩耍。也就是说，一些潜在的游戏伙伴比其他游戏伙伴更受欢迎。实验操作可能会改变大鼠区分玩伴的能力，这在标准的二元游戏范式中可能无法被发现，因为只能与一个同伴进行交互，可能导致错误的结论，即实验操作没有效果。因此，多动物范式可以来抵消从二元范式的缺点。事实上，更复杂的方法可用于连续记录和评分饲养笼中的RTP行为。二元测试，可以更好地控制特定大鼠如何与特定伴侣打交道，而饲养笼里的测试，或小组测试，允许动物控制与谁一起玩以及在哪里玩，两者结合将捕获这两种方法的优势，从而评估更深入的分析治疗对社交行为的影响。
参考文献
[1]VANRYZINJW,MARQUARDTAE,MCCARTHYMM.AssessingRough-and-tumblePlayBehaviorinJuvenileRats[J].BioProtoc,2020,10(1):e3481.
[2]PALAGIE,BURGHARDTGM,SMUTSB,etal.Rough-and-tumbleplayasawindowonanimalcommunication[J].BiolRevCambPhilosSoc,2016,91(2):311-27.
找实验方法，上脑声常谈
动物模型构建与行为评估交流群
扫码邀请入群
方法检索教程
往期实验方法，需要的老师可以按照以下操作进行查阅：进入公众号脑声常谈→底部菜单栏脑声助手方法检索→最上方搜索框输入实验名称，您找的实验方法就出来啦！