本发明涉及在多光子激光显微镜下使用的新型生物体染色剂及使用了该染色剂的细胞的观察方法，在多光子激光显微镜下使用的新型生物体染色剂的选择、评价方法，利用该方法选择的新型细胞染色剂，在多光子激光显微镜下使用的新型肿瘤细胞染色剂及使用了该染色剂的肿瘤细胞的检测方法，以及用于使用多光子吸收现象对患者的组织进行观察、同时选择性地破坏该组织的一部分的多光子激光诊断治疗装置。
背景技术：
在癌症诊断中使用各种诊断方法，近年来开发了使用内窥镜(包含纤维内窥镜等柔性镜和支气管窥镜等硬性镜这两者)对患部细胞进行观察，确认消化系统、呼吸系统、肾泌尿系统、子宫卵巢生殖系统及脑脊髓神经系统等的疾病、特别是肿瘤的肿瘤细胞是否存在的非侵袭性诊断方法。
由乳癌的研究可知，多数癌从发生开始至6年后会达到直径5毫米左右。采用目前的内窥镜极难检测到这种程度大小的癌。之后，在第7年成为直径达到10毫米的被称作早期癌症的状态，若能在这时检测到，则多可通过内科医生使用内窥镜的粘膜切除手术进行治疗。但是，由于该检测界限，采用内窥镜检查仅能发现在7年±半年的时期接受诊查的患者的早期癌症。
如此，可作为早期癌症被发现的时期有限。过了该时期而变成晚期癌症时将难以利用内窥镜进行治疗，2期、3期的晚期癌症将不得不依赖于外科医生进行癌切除开腹手术。当癌症进一步进展到4期时，癌远端转移至肝脏、肺、脑等消化道外的脏器的可能性高，变得需要内科医生进行化学疗法-放射线疗法。因此，可以说内窥镜的癌发现性能决定了早期癌症的发现率、甚至癌症的治疗可能性。
在消化器官的病理组织诊断中，能够直接观察病变的内窥镜检查发挥重要的作用。近年来，通过增强显示粘膜表层的毛细血管、粘膜微细结构形态的窄波成像技术(narrowbandimaging(nbi))(注册商标)内窥镜系统的开发，正在实现微细病变的早期发现。但是，即使是nbi也无法观察各个细胞，病变的准确诊断需要活检(活体组织切片)。
因此，活检组织诊断在胃癌等消化道疾病的诊断中仍发挥着重要的作用。活检组织诊断是通过病理医生对通过内窥镜检查采集的问题部位的组织进行苏木精-伊红染色(he染色)所制作的标本进行组织诊断来进行的。但是，活检不仅是侵袭性的处置，而且存在费用也高，至获得诊断结果需要花费10天左右的问题。
长期以来提出了对生物体细胞进行染色、由其细胞图像诊断疾病的尝试，但所使用的色素的安全性成为问题。特别是，为了开发新型色素，法律上也要求证明在候补色素给予时是否显示有害作用。该安全性证明操作中，为新型色素化合物时，每1种化合物需要花费最低10年的岁月和数十亿日元的成本。
作为对生物体组织的深部进行观察的方法，还提出了使用专利文献1～3中记载的多光子激光显微镜的诊断方法。多光子激光显微镜中，利用多光子激发现象将超短脉冲激光聚光至组织内部，在聚光位置处观察被超短脉冲激光激发而发出的荧光。多光子激光显微镜在原理上由于能够精确定点激发，因此通过一边使超短脉冲激光扫描一边检测荧光进行图像处理，可以获得高分辨率的荧光图像。
利用多光子激光显微镜的存在于细胞内的fad(黄素腺嘌呤二核苷酸)的可视化由于可以低侵袭性地对细胞或分子的行为进行分析，因此期待在内窥镜技术中的应用。通过多光子激光显微镜，由于在730nm左右的波长下、细胞内的核黄素被可视化，因此不需要对细胞进行染色即可获取自体荧光图像(rogart,j.n.,etal.,"multiphotonimagingcanbeusedformicroscopicexaminationofintacthumangastrointestinalmucosaexvivo",clingastroenterolhepatol2008january；6(1):95-101)。但是，在多光子激光显微镜下获得的图像是低对比度的。另外，通过多光子激光的照射，在生物体内产生紫外线，因此由于dna损伤的危险性，无法批准在人体上的应用。另外，细胞的自体荧光强度随着脏器不同而有很大差异，自体荧光强的大肠等消化道上皮细胞使用目前市售的多光子激光显微镜可对细胞图像进行可视化，但自体荧光弱的卵巢上皮细胞或膀胱上皮细胞使用目前市售的多光子激光显微镜难以进行细胞图像的可视化(cruz,j.,etal.biomedicalopticusexpress1,5,1320-1330,2010年)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-186424号公报
专利文献2：日本特开2008-286883号公报
专利文献3：日本特开2010-8082号公报
非专利文献
非专利文献1：rogart,j.n.,etal.,clingastroenterolhepatol2008january；6(1):95-101
非专利文献2：cruz,j.,etal.biomedicalopticusexpress2010,1,5,1320-1330
非专利文献3:：hogan,c.,etal.,nat.cellbiol.,2009,11(4),460-467
技术实现要素：
发明欲解决的课题
为了利用内窥镜(包括如纤维内窥镜的柔性镜和如支气管窥镜的硬性镜这两者)检查进行消化系统、呼吸系统、肾泌尿系统、子宫卵巢生殖系统及脑脊髓神经系统等的疾病的早期发现，甚至早期地实现抑制社会性当务之急的癌症死亡患者数量，本发明的第一观点是提供在多光子激光显微镜下使用的新型生物体染色剂及使用了该染色剂的细胞的观察方法，第二观点是提供在多光子激光显微镜下使用的新型生物体染色剂的评价方法，第三观点是提供在多光子激光显微镜下使用的新型肿瘤细胞染色剂及使用了该染色剂的肿瘤细胞的检测方法。
另外，利用多光子激光显微镜可以获得高分辨率的荧光图像，可以发现早期癌症阶段的小的癌细胞。但是，即使是通过多光子激光显微镜发现了癌细胞或癌组织也无法进行治疗，治疗需要利用其他装置或进行外科处置，在早期癌症的轻微状态下，在治疗时仍有花费功夫来确定癌细胞或癌组织的位置的可能性。
因此，本发明的另一个目的是解决现有技术中存在的问题，提供容易发现生物体内的小的癌组织且还可将所发现的癌组织除去的诊断治疗装置。
因此，本发明的第四观点是提供用于使用多光子吸收现象对患者的组织进行观察、同时将该组织的一部分选择性地破坏的多光子激光诊断治疗装置。
用于解决课题的方法
本发明的生物体染色剂可以对管腔的上皮细胞-腺细胞系和/或结缔组织-毛细血管系的细胞、优选癌细胞进行染色。色素化合物被700nm以上、优选800nm以上的长波长的多光子激光激发。
第二方式中，本发明提供一种方法，其为使用上述生物体染色剂对受试者体内及取出至受试者体外的细胞或培养细胞进行观察的方法，其包含：1)将该生物体染色剂应用于该细胞、2)在多光子激光显微镜下对该细胞进行观察。根据方式不同，本发明的观察方法进一步包含3)根据所述细胞之间的染色性差异识别正常细胞和癌细胞。
第二观点中，本发明者们以提供对具有优先地对癌细胞或者优先地对正常细胞或者两者同等程度地进行染色的细胞染色特性的染色剂进行高效地评价、选择的方法为课题进行了深入研究，结果完成了这种染色剂的评价、选择方法。此外，利用该评价、选择方法，从1200多种的大量食用染色剂中发现了具有上述细胞染色特性的染色剂。
第一方式中，本发明提供一种方法，其为利用多光子激光显微镜下的观察评价生物体染色剂的细胞染色特性的方法，其包含a)将癌细胞和正常细胞混在，b)培养所述混在物至达到汇合或半汇合的状态，c)将待评价的染色剂应用于所述培养物，d)确定所述染色剂i)是否特异性地对癌细胞进行染色、ii)是否特异性地对正常细胞进行染色、或iii)是否对癌细胞和正常细胞均进行染色。优选所述工序b)中，在癌细胞优先增殖的条件下对所述混合物进行培养直至达到汇合或半汇合的状态。优选所述方法中，所述癌细胞是表达rasv12的狗肾脏肾小管上皮细胞(mdck-rasv12)，通过添加四环素以使该癌细胞优先地增殖。为了评价癌细胞是否被特异性地染色，优选上述方法包含利用报告基因对癌细胞进行标记、将报告基因的表达和利用染色剂的染色进行对比的步骤。优选所述报告基因是gfp基因。
第二方式中，本发明提供一种细胞染色剂，其为用于在多光子激光显微镜下进行观察的、相比较于正常细胞更特异性地对癌细胞进行染色的染色剂，其为含有选自磺基水杨酸甲氯环素、盐酸甲烯土霉素、红汞、固绿fcf、红色3号(赤藓红)及红色104号中的1种或多种色素化合物而成。
此外，本发明还提供一种细胞染色剂，其为用于在多光子激光显微镜下进行观察的、相比较于癌细胞更特异性地对正常细胞进行染色的染色剂，其为含有选自米托蒽醌二盐酸盐及阿霉素盐酸盐中的1种或多种色素化合物而成。
此外，本发明还提供一种细胞染色剂，其为用于在多光子激光显微镜下进行观察的、对正常细胞和癌细胞同等地进行染色的染色剂，其为含有选自恩波吡维铵、芝加哥天蓝6b、玫瑰红钠盐、酸性红及高红v80(紫芋色素)中的1种或多种色素化合物而成。
此外，本发明还提供一种细胞染色剂，其含有用于在多光子激光显微镜下进行观察的下述细胞染色剂的混合物而成：作为相比较于正常细胞更特异性地对癌细胞进行染色的染色剂且含有选自磺基水杨酸甲氯环素、盐酸甲烯土霉素、红汞、固绿fcf、红色3号(赤藓红)及红色104号中的1种或多种色素化合物而成的细胞染色剂；和作为同等地对正常细胞和癌细胞进行染色的染色剂且含有选自恩波吡维铵、芝加哥天蓝6b，玫瑰红钠盐、酸性红及高红v80(紫芋色素)中的1种或多种色素化合物而成的细胞染色剂。
优选所述细胞染色剂在染色剂的总浓度中以0.1μm～10μm的浓度使用。优选上述细胞染色剂进一步含有等渗剂、ph调节剂、稳定剂、增粘剂、防腐剂、香料和/或粘合剂。优选所述细胞是管腔的上皮细胞-腺细胞系和/或结缔组织-毛细血管系的细胞。优选所述色素化合物被700nm以上的多光子激光激发。
第三方式中，本发明提供一种方法，其为使用上述细胞染色剂对由受试者获得的细胞或培养细胞中的癌进行检测的方法，其包含1)将该癌细胞染色剂应用于该癌细胞、2)在多光子激光显微镜下根据染色性的差异对正常细胞和癌细胞进行识别。所述方法优选进一步包含3)通过多光子激光照射将所述肿瘤细胞排除。
因此，第一方式中，本发明提供一种肿瘤细胞染色剂，其为用于在多光子激光显微镜下进行观察的肿瘤细胞染色剂，其含有选自姜黄色素、硫黄菊素、赤藓红、表没食子儿茶素没食子酸酯及酸性红中的1种或多种色素化合物而成。本发明的染色剂可以对管腔的上皮细胞-腺细胞系和/或结缔组织-毛细血管系的细胞进行染色。上述色素化合物被700nm以上、优选800nm以上的长波长的多光子激光激发。
第二方式中，本发明提供一种方法，其为使用上述肿瘤细胞染色剂对受试者体内及取出至受试者体外的细胞或培养细胞中的肿瘤进行检测的方法，其包含1)将该肿瘤细胞染色剂应用于该细胞、2)在多光子激光显微镜下、根据染色性的差异识别正常细胞和肿瘤细胞。根据方式不同，本发明的检测方法进一步包含3)利用多光子激光照射将肿瘤细胞排除。
通过多光子激光显微镜可以获取高分辨率的荧光图像、可以发现早期癌症阶段的小的癌细胞。但是，即使是通过多光子激光显微镜发现了癌细胞或癌组织，也无法进行治疗，治疗需要利用其他的装置或进行外科处置，在早期癌症的轻微状态下，在治疗时仍有要花费功夫确定癌细胞或癌组织的位置的可能性。因此，期待提供解决现有技术中存在的问题、易于发现生物体内的小的癌组织且能够将所发现的癌组织除去的诊断治疗装置。
所述屏蔽构件还可进一步具备用于向所述空间内供给液体及进行排液的给液口及排液口，其中，该给液口及排液口可以是相同的也可以是不同的，此外该给液口及排液口还可兼为所述吸气口及排气口。优选所述液体是包含用于对组织进行染色的染色剂的染色液及用于对该染色液进行洗涤的洗涤液。
所述组织是通过在表面上涂布染色剂而被染色的组织，所述荧光图像生成装置优选基于来自所述经染色的组织的荧光来生成荧光图像。
另外，所述聚光位置变位装置优选包含在正交于所述脉冲激光的光轴的二轴方向上扫描所述脉冲激光的二维扫描部、和用于调节所述组织的所述激光的聚光位置的深度的聚光深度调节部。
此外，所述脉冲强度设定部优选包含设定用于进行诊断的脉冲激光强度的诊断用脉冲强度设定部、和设定用于治疗的脉冲激光强度的治疗用脉冲强度设定部。此时，由所述诊断用脉冲强度设定部设定的脉冲激光强度优选是由治疗用脉冲强度设定部设定的强度的1/10以下。
所述光学系统优选含有用于将所述脉冲激光聚光至聚光位置的物镜、该物镜的开口数为1.0以上。
所述光学系统和所述聚光位置变位装置设定在激光照射头内，多光子激光诊断治疗装置还可以进一步具备用于固定所述患者的患者固定台、和使所述患者固定台和所述激光照射头在3轴方向上相对移动的移动装置，所述光学系统还可以设置在内窥镜内、通过所述内窥镜从所述激光光源将脉冲激光照射至所述组织。
发明效果
关于多光子激光荧光发生活性和细胞染色性，在对多个可经口摄入的化合物进行分析的过程中发现，各色素在正常细胞和/或癌细胞中的染色样式因数个染色特异性的不同而被分类。因此，根据本发明，可以利用癌和正常细胞的染色性差异、迅速地找到病变部，由细胞形态确定粘膜病变的本质(病名)。
利用本发明的生物体染色剂进行的染色法与现有的自体荧光观察法相比，由于能够将为摄入足以进行图像诊断的画质的细胞图像所需的激光照射量抑制至30分之1左右(使用砷化镓高感度光电倍增管时为100分之1左右)、大幅度地降低粘膜细胞的光损伤、另外由于能够将激光激发波长设定在长波长侧(800nm以上)，因此可以抑制组织内的紫外线发生、减少粘膜细胞的dna损伤。另外，由本发明的生物体染色剂进行了可视化的图像与通过荧光色素的静脉内全身给予获得的共聚焦激光显微镜图像或通过无染色自体荧光获得的多光子激光显微镜图像相比，是足够高的画质。
附图说明
图1是本发明的多光子激光诊断治疗装置的概略构成图。
图2是表示本发明第1实施方式的多光子激光诊断治疗装置的整体构成图。
图3是表示本发明第2实施方式的多光子激光诊断治疗装置的整体构成图。
图4表示本发明多光子激光诊断治疗装置的光学系统被屏蔽构件包围的状态。
图5表示光学系统被屏蔽构件包围的内窥镜。
图6a是表示提供高对比度的多光子激光图像的色素化合物的染色样式的显微镜照片。
图6b是表示提供高对比度的多光子激光图像的色素化合物的染色样式的显微镜照片。
图6c是表示提供高对比度的多光子激光图像的色素化合物的染色样式的显微镜照片。
图6d是表示提供高对比度的多光子激光图像的色素化合物的染色样式的显微镜照片。
图7a是表示姜黄色素优先地对上皮细胞-腺细胞系进行了染色的显微镜照片。
图7b是表示硫黄菊素优先地对上皮细胞-腺细胞系进行了染色的显微镜照片。
图8a是表示胭脂树红优先地对结缔组织-毛细血管系进行了染色的显微镜照片。
图8b是表示胭脂树红及槲皮素优先地对结缔组织-毛细血管系进行了染色的显微镜照片。
图9a是表示红色106号优先地对上皮细胞-腺细胞系和结缔组织-毛细血管系两者进行了染色的显微镜照片。
图9b是表示绿色3号优先地对上皮细胞-腺细胞系和结缔组织-毛细血管系两者进行了染色的显微镜照片。
图10表示磺基水杨酸甲氯环素特异性地对癌细胞进行染色。gfp-rasv12阳性细胞优先地被染色。gfp-rasv12阳性细胞从最小1个到数个的细胞集团均被染色。
图11表示盐酸甲烯土霉素特异性地对癌细胞进行染色。gfp-rasv12阳性细胞优先地被染色。gfp-rasv12阳性细胞从最小1个到数个的细胞集团均被染色。
图12表示红汞特异性地对癌细胞进行染色。gfp-rasv12阳性细胞优先地被染色。gfp-rasv12阳性细胞从最小1个到数个的细胞集团均被染色。
图13表示米托蒽醌二盐酸盐相比较于癌细胞更特异性地对正常细胞进行染色。gfp-rasv12细胞未被特异性地染色而正常细胞染色了。
图14表示阿霉素盐酸盐相比较于癌细胞更特异性地对正常细胞进行染色。gfp-rasv12细胞未被特异性地染色而正常细胞染色了。
图15表示恩波吡维铵对正常细胞和癌细胞同等地进行染色。
图16表示芝加哥天蓝6b对正常细胞和癌细胞同等地进行染色。白色箭头：gfp-rasv12阳性细胞的细胞黏附部位被芝加哥天蓝6b(chicagoskyblue6b)染色。gfp-rasv12阳性细胞的一部分是细胞质被染色。
图17表示固绿fcf将癌细胞特异性地染色。
图18表示红色3号(赤藓红)将癌细胞特异性地染色。gfp-rasv12阳性细胞优先地被染色。gfp-rasv12阳性细胞从最小1个到数个的细胞集团均被染色。少数的正常细胞也被红色104号染色。
图19表示红色104号(荧光桃红，phloxine)将癌胞特异性地染色。白色粗箭头：全部的gfp-rasv12阳性细胞被红色104号染色。gfp-rasv12阳性细胞从最小1个到数个的细胞集团均被红色104号染色。癌细胞染色强度是正常细胞染色强度的6.7倍。白色细箭头：少数的正常细胞也被红色104号染色。
图20表示玫瑰红钠盐将正常细胞和癌细胞同等地染色。
图21表示酸性红将正常细胞和癌细胞同等地染色。
图22a表示高红v80(紫芋色素)将正常细胞和癌细胞同等地染色。
图22b表示高红v80的构成成分花青色素烷酰葡萄糖(cyanidinsialicglycoside，花青色素唾液酸苷？)。
图22c表示高红v80的构成成分芍药花素烷酰葡萄糖。
图23表示被姜黄色素染色的正常大肠粘膜(a)和大肠癌肿瘤部(b)的多光子激光显微镜照片。
图24是在用1％链霉蛋白酶进行处理后被姜黄色素染色的正常大肠粘膜(a)和大肠癌肿瘤部(b)的多光子激光显微镜照片。
图25是表示被姜黄色素染色的大肠癌的结构异型性(a)及细胞异型性(b)的多光子激光显微镜照片。
图26是利用姜黄色素染色及硫黄菊素染色获得的高对比度的多光子激光显微镜图像。
图27a是被姜黄色素优先地染色的上皮细胞-腺细胞系的多光子激光显微镜照片。
图27b是被硫黄菊素优先地染色的上皮细胞-腺细胞系的多光子激光显微镜照片。
图30是小鼠膀胱上皮细胞的多光子激光显微镜照片，(a)是以82％的激光功率拍摄未被姜黄色素染色的细胞的照片(自体荧光)、(b)是以3％的激光功率拍摄经姜黄色素染色的细胞的照片。
图31是小鼠气管上皮细胞的多光子激光显微镜照片，(a)是以82％的激光功率拍摄未被姜黄色素染色的细胞的照片(自体荧光)、(b)是以3％的激光功率拍摄经姜黄色素染色的细胞的照片。
图32是对经外科手术切除的新鲜胃粘膜的正常胃粘膜部位(a)或胃癌部位(b)进行姜黄色素染色、使激光功率为1％进行拍摄的多光子激光显微镜照片。
图33是色素化合物的染色性评价步骤的说明图。
具体实施方式
＜新型的生物体染色剂＞
本发明的生物体染色剂作为食品添加物等已得到认可、包含可食用的天然(动物性或植物性)或合成的色素化合物。在本说明书中使用时，“可食用”并非是指对象化合物的用途本来是食用的，而是确保有能够添加在食品等中的安全性、可应用于人体等具有管腔脏器的动物。本发明的可食用色素化合物例如选自包含焦油系色素、特别是食用焦油系色素、环烯醚萜系色素、类胡萝卜素系色素、黄酮系色素(例如儿茶素类；花青素类、特别是花色素类；查耳酮类；姜黄色素类)、醌系色素、甜菜红碱系色素的荧光色素化合物组。本发明的色素化合物根据结构可如下进行分类。
1.焦油系色素
作为焦油系色素的例子，可举出以下的化合物：
红色3号(赤藓红)、红色104号(荧光桃红)、红色105号、红色106号(酸性红)、绿色3号(固绿fcf)、红色2号、红色102号、蓝色2号(靛蓝胭脂红)、黄色4号(柠檬黄)、黄色5号(日落黄fcf)等。
2.环烯醚萜系色素
作为环烯醚萜系色素的例子，可举出以下的化合物：highmelonp-2(栀子蓝：栀子苷)、高蓝at(栀子蓝色素：栀子苷)等。
3.类胡萝卜素系色素
作为类胡萝卜素系色素的例子，可举出以下的化合物：
highmelonp-2(黄色素：藏红花素)、胭脂树红(胭脂树n2r25、红木果实：胭脂素、降胭脂树素)、highmelonp-2(栀子蓝：栀子苷)、藏红花素g150(栀子黄色素)、藏红花素l(栀子黄色素)、β胡萝卜素、胭脂树wa-20(胭脂树红色素红木的种子：降胭脂树素)等。
4.黄酮系色素
作为黄酮系色素的例子，有花青素类、特别是花色素类、儿茶素类、查耳酮类、姜黄色素类等。
作为花青素类的例子，可举出以下的化合物：
高红g150(葡萄皮色素、花青素)、高红ra200(红萝卜色素：天竺葵色素苷)、高红v80(紫芋色素：矢车菊素葡萄糖苷及芍药素葡萄糖苷)、芹菜定(高粱色素)、花青色素、花翠素(茄子色素)、菲瑟定(黑荆色素)、锦葵色素(蓝色的香豌豆色素)、花葵素、刺槐定(刺槐木色素)、tricetinidin(红茶色素)、甲花翠素(红莓色素)、辣椒红(辣椒色素)等。
作为儿茶素类的例子，有表没食子儿茶素没食子酸酯、绿茶等。
作为查耳酮类的例子，有红花y1500(红花色素、羟基红花黄色素a+b)等。
作为姜黄色素类的例子，有姜黄色素等。
作为其他黄酮系色素的例子，可举出以下的化合物：
硫黄菊素、杨梅酮(葡萄、洋葱色素)、槲皮黄酮(洋葱、柑橘类色素)等。
5.醌系色素
作为醌系色素的例子，可举出以下的化合物：
胭脂虫(胭脂虫红al、胭脂红酸)、高红s(紫胶红色素-虫胶酸)等。
6.甜菜红碱系色素
作为甜菜红碱系色素的例子，可举出高红bl(红甜菜色素：甜菜苷、异甜菜苷)等。
作为其他荧光色素化合物的例子，可举出吲哚菁绿、姜辣素(生姜辛辣成分)等。
本发明中使用的色素化合物具有各自不同的染色性，从对正常细胞的染色性出发，可如下进行分类。
1)被多光子激光强烈地激发、提供明亮的生物体细胞图像的色素
2)优先地将构成消化道等管腔脏器的特定的细胞结构强烈染色的色素
消化道粘膜的细胞构成可以如下分类：由覆盖食物通过的粘膜表面的上皮细胞和上皮细胞陷入成疣状并分泌粘液的腺细胞构成的细胞组(第一系列)；由包埋上皮细胞、腺细胞周围的毛细血管、结缔组织细胞构成的细胞组(第二系列)。当自粘膜表面拉近物镜，在其聚焦聚焦在粘膜表面时、主要观察到上皮细胞，在聚焦聚焦在深部时、则观察到腺细胞和结缔组织-毛细血管。
2-1)优先地对第一系列的细胞组进行染色的色素
姜黄色素(色素编号1号)、硫黄菊素(色素编号2号)、表没食子儿茶素没食子酸酯(色素编号3号)、红色3号(赤藓红)(色素编号4号)、红色104号(荧光桃红)(色素编号9号)、吲哚菁绿(色素编号15号)、锦葵色素(色素编号27号)、β胡萝卜素(色素编号28号)、高红bl(色素编号32号)、6-姜辣素(色素编号33号)、杨梅酮(色素编号35号)、トリセニジン(色素编号36号)及甲花翠素(色素编号37号)。
这些色素中，姜黄色素和硫黄菊素的染色性高，优选。
2-2)优先地对第二系列的细胞组进行染色的色素
胭脂树红(色素编号14号)、槲皮素(色素编号34号)、蓝色2号(色素编号10号)、栀子黄色素(色素编号16号)、藏红花素g-150(色素编号17号)、羟基红花黄色素(色素编号18号)、刺槐定(色素编号24号)、高红v80(色素编号31号)及色素编号34号的槲皮素(色素编号34号)。
这些色素中，胭脂树红和槲皮素的染色性高，优选。
2-3)对第一系列及第二系列这两者的细胞组进行染色的色素
红色106号(色素编号5号)对上皮细胞-腺细胞的细胞膜和结缔组织-毛细血管系强烈地进行染色。另外，绿色3号(色素编号6号)对一部分的腺细胞和结缔组织-毛细血管系强烈地进行染色。
本发明的生物体染色剂不仅是正常细胞、癌细胞也可染色。例如姜黄色素、硫黄菊素、红色3号(赤藓红)等多种色素相比较于正常粘膜更浓地对癌病变部进行染色。通过利用这种染色特异性，可以迅速地探索病变部。其中，在通过荧光色素的静脈注射进行给予的、使用共聚焦激光显微镜的消化道粘膜细胞的图像化中，癌细胞比正常细胞更浓地被染色这一认识在本发明以前是没有的。
此外，病变部是癌细胞时，癌细胞具有与正常细胞不同的形态特征，因此根据形态差异，可以区别正常细胞和癌细胞。具体而言，异型性分类为结构型(细胞集团未在基底膜上规整地排列、未形成腺结构等)及细胞异型(各个细胞的大小不同、核大、其位置不均一、极性不均一等)这两种。目前的内窥镜难以对直径5毫米左右的癌进行检测，但在细胞形态可图像化的多光子激光显微镜下使用本发明的生物体染色剂时，则根据形态差异，即使不进行活检、也可通过目视早期地检测到直径1毫米左右的癌。检测到癌时，还可以通过多光子激光照射将其烧灼、排除。
生物体染色中使用的色素化合物适当选自上述化合物组。本发明的生物体染色剂可以单独含有或含有多种所选择的色素化合物。通过组合不同的色素化合物，则可获得不同的染色样式。各色素化合物的配合量只要是色素化合物在生物体染色剂中不沉淀并可获取病理诊断所需的图像，则无特别限定。此外，考虑对受试者造成的毒性来决定色素化合物的浓度。此外，色素化合物的浓度按照在生物体染色剂中不发生沉淀的方式适当进行调节，例如色素化合物可以在生物体染色剂中配合约0.01mg/ml～5mg/ml的范围、例如约1mg/ml。优选上述色素化合物可以以0.1μm～10μm的浓度(摩尔浓度)进行使用。另外，除了上述色素化合物，还可以含有在内窥镜检查等中一直使用的碘等公知的色素。色素化合物在常用的溶剂、例如pbs、乙醇/甘油、dmso等溶解。
上述色素化合物具有固有的荧光发生活性，但均被700nm以上、优选800nm以上的长波长的多光子激光激发。激发光的观察在多光子激光显微镜下进行，在本说明书中进行使用时，“多光子激光显微镜”是指利用多光子激发过程的荧光显微镜。以激发光为双光子的情况为例进行说明时，多光子激发过程是与单光子激发相比，1个荧光分子将2个波长约为2倍、即能量为1/2的光子同时吸收，从而变为激发状态的非线形光学现象。此外，从由此激发状态返回至能量低的稳定状态时，能量作为荧光被释放，测定其荧光强度，构建高对比度的图像。这种多光子激发通过作为光源使用脉冲宽为飞秒级、且峰值功率大的脉冲激光强制地进行。本发明的生物体染色剂不仅在双光子、在三光子等多光子激发过程中也可利用，所使用的多光子激光显微镜只要是具备产生长波长的激光的功能，则无特别限定。
本发明的生物体染色剂可以对管腔、优选消化器官的上皮细胞-腺细胞系和/或结缔组织-毛细血管系的细胞进行染色。此外，本发明的生物体染色剂在体外的细胞观察中也可使用，例如可以是由受试者通过活检获得的细胞或者培养细胞(例如单层培养细胞)。本说明书中进行使用时，用语“培养细胞”包含各种干细胞、例如人工多能干细胞(ips细胞)、胚胎干细胞(es细胞)、muse细胞、组织干细胞等培养物。通过本发明的观察方法，也可对在将这些细胞应用于再生医疗时在培养过程中产生的癌化细胞或未分化细胞进行检测。
生物体染色剂的给予方法并无特别限定，例如可以将生物体染色剂直接应用于或粘膜下给予到管腔中，或者也可以经口、经静脉或给予至腹腔内。生物体染色剂的染色性弱时，通过用链霉蛋白酶处理粘膜表面，将粘液除去，细胞结构的识别性提高。当将染色剂直接应用于管腔内壁(例如涂布或喷雾)时，剂型优选是液体，也可以以颗粒、片剂等形态进行使用。另外，也可根据剂型等，适当地将所需的追加成分、例如等渗剂、ph调节剂、稳定剂、增粘剂、防腐剂、香料或粘合剂等添加物配合在生物体染色剂中。例如，可以在本发明的生物体染色剂中预先配合链霉蛋白酶。链霉蛋白酶是作为粘膜除去剂使用的具体例子。作为所述等渗剂的具体例子，有氯化钠或甘油等，作为食品添加物使用的ph调节剂的具体例子，有柠檬酸、葡糖酸、琥珀酸、碳酸钾、乳酸等，作为稳定剂或增粘剂的具体例子，有角叉菜胶、羧甲基纤维素钠、黄原胶、瓜尔豆胶、果胶等，作为防腐剂(保存料)的具体例子，有苯甲酸等，作为粘合剂的具体例子，有明胶、淀粉、酪蛋白等，只要是对生物体细胞可以安全地使用的物质，则并不限定于此。
本发明的细胞观察方法包含将生物体染色剂应用于自受试者获得的细胞或培养细胞，在多光子激光显微镜下对染色细胞进行观察。其他方式中，本发明的观察方法还包含根据所染色的细胞之间的染色性差异、检测癌病变。
＜新型生物体染色剂的细胞染色特性的评价方法＞
上述评价方法中，优选利用报告基因对癌细胞进行标记，从而可以对报告基因的表达和利用染色剂的染色进行对比，可以确认癌细胞是否被该染色剂特异性地染色。作为报告基因，只要是编码作为检测标记物可发挥功能的报告蛋白的基因，则无特别限定，优选可举出编码gfp、萤火虫荧光素酶、β-半乳糖苷酶、海肾荧光素酶、碱性磷酸酶等蛋白质的基因。这些报告基因中，编码gfp的基因由于可通过有无荧光的简单方法进行鉴定、检测，因此在本发明中优选。
优选将上述报告基因以能够发挥作用的方式连接在上述癌基因的启动子上，与上述癌基因的表达联动地表达。
本发明者们通过上述评价方法进行了1200多种生物体染色剂的评价，结果发现了如下的细胞染色特性：
在多光子激光显微镜观察下，与正常细胞相比更特异性地对癌细胞进行染色的染色剂：
磺基水杨酸甲氯环素
盐酸甲烯土霉素
红汞
固绿fcf
红色3号(赤藓红)
红色104号(荧光桃红)
在多光子激光显微镜观察下，与癌细胞相比更特异性地对正常细胞进行染色的染色剂：
米托蒽醌二盐酸盐
阿霉素盐酸盐
在多光子激光显微镜观察下，同等地对正常细胞和癌细胞进行染色的染色剂：
恩波吡维铵
芝加哥天蓝6b
玫瑰红钠盐
酸性红
高红v80(紫芋色素)
在多光子激光显微镜观察下，与正常细胞相比更特异性地对癌细胞进行染色的染色剂在与正常粘膜的比较中，更浓地对癌病变部进行染色。通过利用这种染色特异性，可以迅速地探索病变部。特别是，由于癌细胞具有不同于正常细胞的形态特征，因此根据形态差异，可以区别正常细胞和癌细胞。具体而言，异型性分为结构异型(细胞集团未在基底膜上规整地排列、未形成腺结构等)及细胞异型(各个细胞的大小不同、核大、其位置不均一、极性不均一等)这两种。目前的内窥镜难以对直径5毫米左右的癌进行检测，但通过在细胞形态可图像化的多光子激光显微镜下使用本发明的生物体染色剂，即使不进行活体组织检查、也可通过目视根据形态差异早期地检测到直径1毫米左右的癌。正常细胞和癌细胞的区分不仅医生可以进行、细胞检查技师等也可进行。
在多光子激光显微镜观察下，与癌细胞相比更特异性地对正常细胞进行染色的染色剂在与癌病变部的比较中，更浓地对正常粘膜进行染色。通过利用这种染色特异性，可以确认观察部位是否是病变部。
在多光子激光显微镜观察下，同等地对正常细胞和癌细胞进行染色的染色剂例如通过在多光子激光显微镜观察下、与相比较于正常细胞更特异性地对癌细胞进行染色的染色剂组合使用，可以进一步确认病变部位。仅使用对癌细胞特异性染色的染色剂时，有时难以判断所染色的部位是否是真正患癌的部位。当将与正常细胞相比更特异性地对癌细胞进行染色的染色剂和同等地对正常细胞与癌细胞进行染色的染色剂并用时，可以防止假阴性的判断，是有利的。
因此，本发明还提供一种细胞染色剂的混合物(cocktail)，该混合物含有下述细胞染色剂：用于在多光子激光显微镜下进行观察的、与正常细胞相比更特异性地对癌细胞进行染色的染色剂，包含选自磺基水杨酸甲氯环素、盐酸甲烯土霉素、红汞、固绿fcf、红色3号(赤藓红)及红色104号中的1种或多种色素化合物而成的细胞染色剂；和同等地对正常细胞和癌细胞进行染色的染色剂，包含选自恩波吡维铵、芝加哥天蓝6b，玫瑰红钠盐、酸性红及高红v80(紫芋色素)中的1种或多种色素化合物而成的细胞染色剂。
当蒸散癌细胞时，若并非是照射至细胞整体，而是限定多光子激光的扫描范围地对细胞膜的一部分进行激光照射，则能够以更少量的光量将细胞破坏。
利用本发明的染色剂进行了可视化的图像的质量是相比较于利用荧光色素的静脉内全身给予获得的共聚焦激光显微镜图像或者利用无染色自体荧光获得的多光子激光显微镜图像相比，是足够高的画质。
本发明的色素化合物均可使用市售品。细胞染色剂中的色素化合物的配合量并无特别限定，例如可以在染色剂中配合0.01mg/ml～1mg/ml。优选上述色素化合物能够以0.1μm～10μm的浓度进行使用。另外，除了上述色素化合物之外，还可含有在内窥镜检查等中以往使用的碘等公知的色素。
本发明的色素化合物具有固有的荧光发生活性，均被700nm以上、优选800nm以上的长波长的多光子激光激发。激发光的观察在多光子激光显微镜下进行，通过在多光子激光显微镜下进行观察，能够实时地进行组织诊断。所使用的多光子激光只要是能够产生长波长的激光，则无特别限定。
染色剂的给予方法并无特别限定，例如可以将本发明的染色剂直接应用于内腔或者进行粘膜下给予，或者还可经口、经静脉或给予至腹腔内。染色剂的染色性弱时，通过用链霉蛋白酶处理粘膜表面，将粘液除去、细胞结构的识别性提高。当将染色剂直接应用于管腔内壁(例如涂布或喷雾)时，剂型优选是液体，也可以以颗粒、片剂等形态进行使用。另外，也可根据剂型等，适当地将必要的追加成分、例如等渗剂、ph调节剂、稳定剂、增粘剂、防腐剂、香料或粘合剂等添加物配合在染色剂中。例如，可以在本发明的染色剂中预先配合链霉蛋白酶。
＜肿瘤细胞染色剂＞
本发明中作为色素化合物使用的姜黄色素、硫黄菊素及表没食子儿茶素没食子酸酯是黄酮的一种。赤藓红(红色3号)及酸性红(红色106号)作为焦油系色素已知。各个色素化合物均可经口给予。这些色素化合物均被多光子激光强烈地激发、可以提供明亮的生物体细胞图像。另外，这些色素化合物具有优先地对构成消化道等管腔脏器的特定的细胞结构强烈染色的性质。
这里，消化道粘膜的细胞构成可以如下分类：由覆盖食物通过的粘膜表面的上皮细胞和上皮细胞陷入成疣状并分泌粘液的腺细胞构成的细胞组(第一系列)；由包埋上皮细胞、腺细胞周围的毛细血管或结缔组织细胞构成的细胞组(第二系列)。姜黄色素、硫黄菊素、表没食子儿茶素没食子酸酯及赤藓红可以优先地对第一系列的细胞组进行染色。酸性红可以对第一系列及第二系列这两细胞组进行染色。另外，显微镜下观察的消化道粘膜的细胞排列根据聚焦面的不同而不同。具体而言，自粘膜表面拉近物镜时，在其焦点聚焦在粘膜表面时、主要观察到上皮细胞，在焦点聚焦在深部时、则观察到腺细胞和结缔组织-毛细血管。
此外，上述色素化合物在与正常粘膜的比较中，更浓地对癌病变部进行染色。通过利用这种染色特异性，可以迅速地探索病变部。特别是，由于肿瘤细胞具有不同于正常细胞的形态特征，因此根据形态差异，可以区别正常细胞和肿瘤细胞。具体而言，异型性分为结构异型(细胞集团未在基底膜上规整地排列、未形成腺结构等)及细胞异型(各个细胞的大小不同、核大、其位置不均一、极性不均一等)这两种。目前的内窥镜难以对直径5毫米左右的癌进行检测，但通过在细胞形态可图像化的多光子激光显微镜下使用本发明的染色剂，即使不进行活检，也可通过目视根据形态差异早期地检测到直径1毫米左右的癌。正常细胞和癌细胞的区分不仅是医生可以进行、细胞检查技师等也可进行。
当排除癌细胞时，若并非是照射至细胞整体，而是对细胞膜的一部分进行激光照射，则能够以更少量的光的量将细胞破坏。
利用本发明的染色剂进行了可视化的图像的质量与利用荧光色素的静脉内全身给予获得的共聚焦激光显微镜图像或者利用无染色自体荧光获得的多光子激光显微镜图像相比，是足够高的画质。
本发明的色素化合物均可使用市售品。例如可以使用化学合成的纯的姜黄色素、含有姜黄色素的姜黄提取物。或者，还可根据公知的方法从姜黄等中提取。姜黄色素和硫黄菊素可分别单独使用，但为了获得不同的染色样式，也可组合使用。配合量并无特别限定，例如可以在染色剂中配合0.01mg/ml～1mg/ml。优选上述色素化合物能够以0.1μm～10μm的浓度进行使用。另外，除了上述色素化合物之外，还可含有在内窥镜检查等中一直使用的碘等公知的色素。
本发明的染色剂在体外的细胞观察中也可使用，例如可以是由受试者通过活检获得的细胞或者培养细胞(例如单层培养细胞)。在本说明书中进行使用时，用语“培养细胞”包括各种干细胞、例如人工多能干细胞(ips细胞)、muse细胞、胚胎干细胞(es细胞)、组织干细胞等培养物。本发明的检测方法还可应用于在对细胞或es细胞进行分化诱导、制作组织移植细胞时有可能产生的未分化细胞或癌化细胞的检测和排除。
染色剂的给予方法并无特别限定，例如可以将本发明的染色剂直接应用于内腔或者进行粘膜下给予，或者还可经口、经静脉或给予至腹腔内。染色剂的染色性弱时，通过用链霉蛋白酶处理粘膜表面，将粘液除去，细胞结构的识别性提高。当将染色剂直接应用于管腔内壁(例如涂布或喷雾)时，剂型优选是液体，也可以以颗粒、片剂等形态进行使用。另外，也可根据剂型等，适当地将必要的追加成分、例如等渗剂、ph调节剂、稳定剂、增粘剂、防腐剂、香料或粘合剂等添加物配合在染色剂中。例如，可以在本发明的染色剂中预先配合链霉蛋白酶。
＜多光子激光诊断治疗装置＞
接着，参照附图说明本发明的多光子激光诊断治疗装置的实施方式。
首先参照图1说明本发明的多光子激光诊断治疗装置的整体构成。多光子激光诊断治疗装置11具备激光振荡器13、光束直径调节器15、二维扫描器17、分色镜19、物镜21、聚光深度调节器23、光检测器25、荧光图像生成装置27、监视器29和控制装置31。
激光振荡器13可以射出超短脉冲激光(以下仅记载为脉冲激光)、调整脉冲激光的强度。作为激光振荡器13，使用能够在脉冲宽度度为数十～数百飞秒、脉冲的反复频率为数十～数百mhz的范围调节脉冲激光的功率的激光振荡器。另外，激光振荡器13只要是例如在波长800nm下能够输出3.2w的脉冲激光即可。此外，脉冲激光例如优选是能够输出波长680～1100nm的范围者。其中，多光子吸收现象中，产生具有所入射的光子的波长一半波长的光子，为了防止产生对人体有害的紫外线域(波长小于400nm)的光子，则优选使用800nm以上波长的脉冲激光。
光束直径调节器15按照根据来自控制装置31的光束直径调节信号来改变脉冲激光的光束直径的方式构成。作为光束直径调节器15，例如可以使用光束扩展器。
二维扫描器17根据来自控制装置31的驱动信号使对患者对象部位的超短脉冲激光的聚光位置沿垂直于光轴的2轴方向变化。二维扫描器15例如由2张电流计镜(galvanometermirror)构成，根据驱动信号在相互直行的2根光轴周围摇动，从而进行二维扫描。
分色镜19是用于对通过脉冲激光的照射而在患者的组织中产生的荧光进行分离而设置的。这里，使用具有以下特性者：对与照射于患者组织的脉冲激光的波长相同的光进行反射、而使其他波长的光透过的特性。因此，从二维扫描器17送出的脉冲激光通过分色镜19向物镜21反射，而在组织中产生的荧光则透过分色镜19。如此，在组织中产生的荧光被分色镜19分离。
物镜21将由二维扫描器17导入、被分色镜19反射的脉冲激光聚光至患者组织的聚光位置，另一方面利用多光子吸收现象将在患者组织中产生的荧光聚光、导向分色镜19的方向。其中，物镜21可根据控制信号、通过聚光深度调节器23向光轴方向移动，可以调节聚光位置。分色镜19及物镜21还包含其间的光路而构成光学系统。另外，二维扫描器17及聚光深度调节器23构成了聚光位置变位装置。
为了在组织中引起多光子吸收，需要提高光子密度至多个光子同时冲撞于对象物的程度。因此，即使是低强度的脉冲激光，也易于制成高光子密度的状态，因此物镜21优选使用开口数大者。另外，由于仅在聚光位置产生引起多光子吸收现象的程度的光子密度高的状态，因此多光子吸收现象仅在聚光位置发生、在其他区域内不会发生。使用开口数大的物镜21时，可以极度地减小多光子吸收现象发生的范围，因此能够以细胞单位选择性地进行破坏。物镜21的开口数优选为0.6以上、为了能够进行细胞单位的破坏，更优选为1.0以上。
光检测器25对组织中产生的荧光进行检测，变换成对应荧光强度的电信号。作为光检测器25，可以使用光电子倍增管(pmt)等。
二维扫描器17的扫描状态及聚光深度调节器23的调节位置(深度方向的位置)成为表示聚光位置的坐标的参数，荧光图像生成装置27将表示这些坐标的参数和由光检测器25发出的电信号(即荧光强度)相对应地进行记忆，对这些数据进行处理，生成荧光图像。将所生成的荧光图像显示在监视器29上。
本发明的多光子激光诊断治疗装置11可以以多种形态实现。例如，如图2所示，在激光照射头43内设置光束直径调节器15、二维扫描器17、由分色镜19、物镜21和其间的光路所构成的光学系统、以及聚光深度调节器23，同时设置用于载置患者的患者固定台45和移动装置47，利用移动装置47使激光照射头43与患者固定台45相对地移动。如此，只要是能够使激光照射头43和患者固定台45在独立的3轴方向上相对移动，则激光对患者患部附近的照射变得容易。另外，如图3所示，可以用内窥镜49将分色镜19与物镜21之间的光路的一部分替换，同时在内窥镜49的前端配置物镜21及聚光深度调节器23。为这种构成时，能够通过低侵袭的内窥镜手术进行体内部位的癌诊断及治疗、可减轻患者身体的负担。
图4表示上述图1中包含物镜21的光学系统的详细内容。图4显示物镜50的周围被筒状的屏蔽构件51覆盖，该屏蔽构件通过与待观察的组织52的周边进行压接、形成将该光学系统密封的空间53。此外，该屏蔽构件具备用于调节该空间内压力的通气口54、55。通气口54、55例如连接于真空泵等吸引手段上，通过使上述空间内为负压，提高该屏蔽构件与组织的密合性，其结果即使是患者的微小的动作、也可保持物镜与观察组织的相对位置关系，防止图像的偏移等。在图像拍摄或手术结束后，通过释放通气口54、55，所述空间内的负压状态恢复至常压、可以使光学系统50从组织上脱离。通气口54、55可以是1个或多个，为多个时，使1个持久地连接在吸引手段上、通过开关其他的通气口容易地调节空间内的空气压。
优选该屏蔽构件进一步具备用于向所述空间内供给及排液含有用于对组织进行染色的染色剂的染色液及用于洗涤该染色液的洗涤液的给液口56及排液口57。该给液口56及排液口57可以相同也可不同，而且该给液口56及排液口57还可兼为所述通气口54、55。优选方式中，染色液介由给液口56导入到所述空间中对组织进行染色，之后介由排液口57对该染色液进行排液，若需要，则介由与上文相同或不同的给液口56将洗涤液导入至所述空间中，由与上文相同或不同的排液口57进行排液，从而对组织进行洗涤。
密封构件的材质并无特别限定，可以是合成橡胶、天然橡胶、氟橡胶、氨基甲酸酯橡胶、有机硅橡胶、环氧树脂、有机硅树脂、酚醛树脂、蜜胺树脂、尿素树脂、聚酰胺树脂、聚酰亚胺树脂、聚氨酯树脂、聚苯硫醚树脂、聚对苯二甲酸丁二醇酯树脂、聚酰胺酰亚胺树脂等。优选是提高屏蔽构件与组织的密合性的合成橡胶、天然橡胶、氟橡胶、氨基甲酸酯橡胶、有机硅橡胶等弹性弹性体。图4中，物镜50固定显示在屏蔽构件51的上表面，可电磁性地进行调整。为了电磁性地进行调整，利用橡胶或弹簧等弹性构件支撑屏蔽构件的物镜固定部与物镜之间，将使用了磁铁和线圈的往复运动气缸设置在x轴(正交于光轴的水平1方向)、y轴(正交于光轴、水平1的水平2方向)、z轴(光轴方向)这3轴方向上，从而得以实现。如此通过追加往复运动气缸，可以利用来自外部的电流进行控制，能够以更高精度、大范围地进行检查、分析、蒸散的操作。图3中的二维扫描器17可作为物镜的位置变更用使用、上述往复运动气缸可作为屏蔽构件内的扫描调整用使用。上述往复运动气缸也可以并非是3轴，只要至少具有1轴则有效。
接着，对图1所示的多光子激光诊断治疗装置11的动作进行说明。
首先，在诊断时以控制装置31的诊断用脉冲强度设定部35所设定的脉冲激光强度从激光振荡器13输出脉冲激光，根据来自控制装置31的动作控制部33的动作指令，通过光束直径调节器15调节至规定的光束直径。调节至规定的光束直径的脉冲激光根据来自控制装置31的动作控制部33的动作指令，通过二维扫描器17按照进行二维扫描的方式控制规定范围、同时被导入至分色镜19并向物镜21反射。通过物镜21聚光的脉冲激光在聚光位置为患者组织内的规定深度的2维平面上进行扫描。其中，脉冲激光的聚光位置根据来自控制装置31的动作控制部33的指令，在患者的组织中调节至预先规定的深度。
在患者的组织中，在聚光位置发生多光子吸收现象、将荧光激发。还可以将患者的细胞所含的核黄素激发、发出荧光，但所得荧光的强度弱、荧光图像的对比度会降低。因此，为了提高所得荧光图像的对比度，优选预先利用染色剂对组织的表面进行染色、使染色的色素激发、发出荧光。另外，当在患者的患部组织表面涂布染色剂、进行染色之后，利用多光子吸收现象获得荧光图像时，由于因多光子吸收现象自染色剂的色素分子发出的荧光强度比因多光子吸收现象自细胞内的核黄素发出的荧光强度还高，因此，使用小强度的脉冲激光即可获得更为鲜明的图像。因而，可以将诊断用脉冲激光强度设定得较低。具体而言，在组织的表面涂布染色剂之后获得荧光图像时，可以在不涂布染色剂的情况下，以获得荧光图像时的脉冲激光强度的1/10以下的脉冲激光强度获得同水平的荧光图像。由此，能够将脉冲激光对患者组织造成的不良影响也抑制在最小限。
作为染色剂，可以使用荧光素、吲哚菁绿(icg)、靛蓝胭脂红等已被认可的荧光剂，优选使用对人体的安全性高的食用色素等。特别是，作为发明者发现获得了鲜明的图像的色素，例如可举出赤藓红、姜黄色素、表没食子儿茶素没食子酸酯、硫黄菊素、酸性红等。
另一方面，在治疗时以控制装置31的治疗用脉冲强度设定部37所设定的脉冲激光强度、从激光振荡器13输出脉冲激光，根据来自控制装置31的动作控制部33的动作指令，通过光束直径调节器15调节至所需的光束直径。其中，治疗用脉冲激光强度在脉冲激光的聚光位置的组织中，对于发生因多光子吸收现象导致的破坏具有足够的高度，相比较于诊断用脉冲激光强度、更高地进行设定。调节至规定的光束直径的脉冲激光按照对控制装置31的照射范围设定部39所设定的照射范围进行扫描的方式，根据来自控制装置31的动作控制部33的动作指令，一边由二维扫描器17进行控制、一边导入至分色镜19中向物镜21反射。由物镜21聚光的脉冲激光在聚光位置为患者组织内的规定深度的二维平面上、对由照射范围设定部39所设定的照射范围进行扫描。聚光位置可以通过由控制装置31的动作控制部33控制的聚光深度调节器23来控制。如此，通过对所期望的照射范围照射脉冲激光，将照射范围的组织的细胞破坏、将癌细胞排除。
这里，利用多光子吸收现象将组织或细胞破坏的原因在于，由于多光子吸收现象，细胞内的分子发生离子化而产生等离子体，从而将细胞的细胞膜破坏。
下面，对使用利用了波长800nm下的峰值功率为3.2w的激光振荡器13和开口数为1.05的物镜21的多光子激光诊断治疗装置11进行癌症诊断及治疗的顺序进行说明。
优选预先对患者的诊断对象组织的表面涂布染色剂。通过在组织表面涂布染色剂，发生癌病变的组织相比较于正常组织被色素强烈染色、正常组织与癌病变组织的荧光差异增大，从而易于发现癌病变部位。认为其原因在于在正常组织中，细胞黏附强、细胞间的间隙几乎没有，而在癌病变部中，细胞之间的黏附弱、在细胞间多有间隙，染色剂易于滞留在其间隙中。作为染色剂，优选使用对人体的安全性高的食用色素等，特别是作为增大正常组织与癌病变组织的荧光差异的染色剂，例如优选使用赤藓红、姜黄色素、表没食子儿茶素没食子酸酯、硫黄菊素、酸性红等。
接着，以控制装置31的诊断用脉冲强度设定部35所设定的脉冲激光强度、利用物镜21将由激光振荡器13输出的脉冲激光聚光至患者的患部组织内的聚光位置，利用二维扫描器17使聚光位置在垂直于光轴的二维平面上扫描。组织内的聚光位置通过利用控制装置31的动作控制部33控制聚光深度调节器23的动作，可以调节至各种深度。如此，利用光检测器25检测通过对患者的组织照射脉冲激光、引起多光子吸收现象所获得的荧光，将所检测的荧光强度与由二维扫描器17及聚光位置深度调节器23的状态获得的表示聚光位置的参数(即坐标)关联地进行处理，从而可以获得荧光图像，将所得荧光图像显示在监视器29上。
医生可以基于癌细胞与正常细胞的荧光图像的形态差异、根据监视器29上的荧光图像判断是否是癌细胞或组织来进行诊断。本发明者发现在组织的表面涂布染色剂、将组织染色从而获得荧光图像的情况下，发生癌病变的组织比正常组织被更浓地染色、可获得更强的荧光。认为其原因在于，在正常组织中细胞黏附强、几乎没有细胞间的间隙，而在癌病变部中细胞之间的黏附弱、细胞间多有间隙，染色剂易于滞留在该间隙中。利用这种现象，癌病变组织相比较于正常组织发出更强的荧光，根据荧光强度的对比易于发现正常组织与癌病变组织的差异，诊断变得容易。另外，染色剂的色素分子与细胞内核黄素相比，通过多光子吸收现象、发出了更高强度的荧光，因此若使用染色剂，则与未使用染色剂的情况相比，使用低强度的脉冲激光即可获得鲜明的荧光图像。因此，可以将诊断用的脉冲激光强度设定得较低。
具体而言，在组织的表面涂布染色剂以获得荧光图像时，可以在不涂布染色剂的情况下，以获得荧光图像时的脉冲激光强度的1/10以下的脉冲激光强度获得同水平的荧光图像。例如，当使用功率为3.2w的激光振荡器13和开口数为1.05的物镜21进行荧光图像诊断及治疗时，治疗用脉冲激光强度的设定值无论是未进行利用染色剂的色素染色还是进行利用染色剂的色素染色，均是最高功率的50％，但为了获得同程度的荧光图像，诊断用脉冲激光强度的设定值在未进行色素染色时为20％，而进行色素染色时则为3％以下(1％左右)就足够了。
此外，当欲检测来自细胞内核黄素的荧光时，所照射的脉冲激光的波长需要是735nm前后，因此所产生的荧光的波长约为370nm、发出紫外线，有导致细胞的dna损伤的可能。与其相对，利用染色剂进行染色时，以800nm以上波长的脉冲激光即可产生荧光，还具有可抑制紫外线发生的优点。
通过利用物镜21将比诊断用脉冲激光强度还高的治疗用脉冲激光强度的脉冲激光聚光在聚光位置上，在聚光位置的组织中，利用多光子吸收现象将组织或细胞破坏。另外，通过对在诊断时所用荧光图像上确定的范围照射治疗用脉冲激光强度的脉冲激光，将该范围的组织或细胞破坏，因此能够将指定范围内的癌病变部位准确地破坏。此外，若使用开口数大的物镜21时，则能够以单位细胞以下的尺寸范围进行脉冲激光的照射，因此可以破坏细胞单位。
优选在治疗后，通过再次在治疗部位的组织表面涂布染色剂，然后以诊断用脉冲强度设定部35所设定的脉冲激光强度将脉冲激光照射至治疗部位的组织，检测所发生的荧光，从而生成荧光图像，通过所生成的荧光图像，确认已将癌病变部位破坏、排除。
当未利用染色剂进行组织的染色时，诊断用脉冲激光强度需要是脉冲激光的最高功率的20％以上，与治疗用脉冲激光强度(最高功率的50％左右)的差异小，当在诊断时和确认时的2次均进行脉冲激光的照射时，则对于癌病变部位周围的正常细胞、脉冲激光的照射量也增多，正常细胞也发生光损伤的可能性提高。与其相对，利用染色剂进行组织的染色时，由于可以将诊断用脉冲激光强度设为脉冲激光的最高功率的3％以下，因此可以大幅度降低正常细胞的光损伤发生的可能性。
本发明的多光子激光诊断治疗装置11所提供的能够破坏组织中的数个肿瘤细胞的功能在针对ips细胞、es细胞、组织干细胞的再生医疗应用的培养过程中，也可利用于通过癌化细胞或未分化细胞的检测及排除的移植细胞的品质管理。
以下举出具体例子更为具体地说明本发明。需要说明的是，本发明并不限定于此。
实施例1
1.色素化合物的染色性评价
对8周龄的c57b6小鼠(雄性、约20g)给予含2％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dss)的饮水7日。将5％水合氯醛0.2ml腹腔内注射以实施麻醉，然后将小鼠的腹壁纵向切开约1cm，将消化道在腹壁上提起约1cm。这里，流向消化道的血流由流入肠系膜附着部的血管维持。将消化道在肠系膜附着部的相反侧包含肌层和粘膜地纵向切开约1cm。切开肠系膜附着部的相反侧是为了防止血管的切断/损伤、使出血达到最小限。将消化道的切开部位上下打开时，在内部可看到作为食物通路的消化道粘膜面。这里，有食物消化物时，用纸巾擦去。
为了进一步清楚地观察消化道粘膜面，在粘膜面上滴加1％链霉蛋白酶溶液、静置15分钟。通过该链霉蛋白酶处理将粘膜表面的粘液除去、细胞结构变得易于观察。接着，从粘膜表面上将链霉蛋白酶除去、用生理盐水(pbs)进行洗涤。
将金属环(外形为16毫米、内径为6毫米)放在实验台上，在单侧面整周地涂布瞬间粘合剂(aronalpha)。使用小镊子保持以使涂布有瞬间粘合剂的金属环低于粘合剂涂布面，静置在经过链霉蛋白酶处理的粘膜面上。利用瞬间粘合剂将金属环固定在粘膜上约5分钟，利用pbs对应用色素化合物的区域进行洗涤。
按照粘膜表面不干燥的方式，在经过链霉蛋白酶处理的粘膜面上一滴滴地滴加用生理盐水(pbs)稀释了姜黄色素储备溶液或硫黄菊素储备溶液所获得的溶液(稀释倍率参照表1～3)，静置1分钟，用pbs洗涤3次，在金属环上载置盖玻片，从盖玻片上方拉近多光子激光显微镜(奥林巴斯公司制fv1000mpe)的物镜，观察图像。
评价色素化合物中使用的条件等及评价结果示于下表。
◎：具有对图像诊断而言为理想的亮度和对比度的图像；○：具有对图像诊断而言为充分的亮度和对比度的图像；×：具有对图像诊断而言为不充分的亮度和对比度的图像；△为○与×的中间状态
令人吃惊的是，与有无粘膜表面的链霉蛋白酶处理无关，姜黄色素、硫黄菊素、红色3号(赤藓红)等多种色素相比较于正常粘膜、更为显著地将癌病变部强烈染色。并非是为了在理论上进行限定，作为将癌病变部强烈染色的理由，可举出由于相对于细胞黏附强、几乎没有细胞间的间隙的正常粘膜，在癌病变部中细胞之间的黏附弱、细胞间多有空隙，因此色素易于残留在其间隙中。作为第二可能性，考虑细胞分裂早的癌细胞的细胞外亲油性物质(多数色素具有良好地溶于油的性质)的摄入活性比正常细胞高。
2.强烈被激发而提供明亮的生物体细胞图像的色素
在上述色素化合物中，当将特定的化合物涂布在小鼠大肠的粘膜表面时，被多光子激光被强烈地激发而提供明亮的图像。特别是对于获得明亮图像的色素化合物，将荧光图像名单示于图6。从色素化合物的给予到进行观察的顺序如上述染色性评价的项目所记载的那样进行(以下同样)。另外，色素在粘膜表面的给予浓度仅在色素编号1号的姜黄色素时为5mg/ml、其他色素全部为1mg/ml。
3.优先地对上皮细胞-腺细胞系进行染色的色素
确认优选地对上皮细胞-腺细胞系进行染色的各种色素，作为代表例将色素编号1号的姜黄色素或色素编号2号的硫黄菊素的染色样式示于图7。这些色素将上皮细胞-腺细胞系强烈染色，将结缔组织-毛细血管系淡淡地染色。另外，色素编号3号的表没食子儿茶素没食子酸酯、色素编号4号的红色3号(赤藓红)、色素编号9号的红色104号(荧光桃红)、色素编号15号的吲哚菁绿、色素编号27号的锦葵色素、色素编号28号的β胡萝卜素、色素编号32号的高红bl、色素编号33号的6-姜辣素、色素编号35号的杨梅酮、色素编号36号的トリセニジン、色素编号37号的甲花翠素也将上皮细胞-腺细胞系优先地染色(结果未示出)。
4.优先地对结缔组织-毛细血管系进行染色的色素
确认了优先地对结缔组织-毛细血管系进行染色的各种色素，作为代表例，将色素编号14号的胭脂树红和色素编号34号的槲皮素的染色样式示于图8。这些色素将结缔组织-毛细血管系强烈染色，将上皮细胞-腺细胞系淡淡地染色。另外，色素编号10号的蓝色2号、色素编号16号的栀子黄色素、色素编号17号的藏红花素g-150、色素编号18号的羟基红花黄色素、色素编号24号的刺槐定、色素编号31号的高红v80、色素编号34号的槲皮素也对结缔组织-毛细血管系优先地进行染色。
5.对上皮细胞-腺细胞系和结缔组织-毛细血管系这两者进行染色的色素
还确认对上皮细胞-腺细胞系和结缔组织-毛细血管系这两者进行染色的色素，作为代表例，将色素编号5号的红色106号或色素编号6号的绿色3号的染色样式示于图9。为色素编号5号的红色106号时，将上皮细胞-腺细胞的细胞膜和结缔组织-毛细血管系强烈地染色。为色素编号6号的绿色3号时，将一部分腺细胞和结缔组织-毛细血管系强烈地染色。
实施例2
作为超早期癌模型的mdck-rasv12癌化细胞小集团体外分析系统
(材料)
·表达使属于绿色荧光蛋白的gfp与恒常活化的癌基因产物rasv12融合而成的gfp-rasv12的mdck-gfp-rasv12细胞(rasv12是ras的第12号氨基酸残基甘氨酸替换成缬氨酸而成的、大肠癌中30～40％可见突变)。
·带酚红dmem(高糖)(和光纯药)
·无酚红dmem(高糖)(和光纯药)
·四环素系统专用胎牛血清(clontech)
·青霉素/链霉素(x100)(nacalaitesque)
·glutamax(x100)(invitrogen)
·胰蛋白酶(0.25％)(无酚红、invitrogen)+edta(3mm)(nacalaitesque)
·博来霉素(100mg/ml、invivogen)
·杀稻瘟素(blasticidin)(10mg/ml、invivogen)
·四环素(sigma)/100％ethanol(100mg/ml)
·10cm培养皿(bdfalcon)
·6cm培养皿(bdfalcon)
·96-孔培养皿(lumox(注册商标)multiwell96、sarstedt)
·dmso(nacalaitesque)
·美国fda(foodanddrugadministration)已认可的化合物prestwickhemicallibrary(1200种)
·日本厚生劳动省已认可的食品添加物(30种)
·多光子激光显微镜(fv1000mpe、olympus)
(方法)
(结果)
即，作为相比较于正常细胞更浓地对gfp-rasv12阳性的癌化细胞小集团进行标记的化合物，鉴定了磺基水杨酸甲氯环素、盐酸甲烯土霉素、红汞、固绿fcf、赤藓红以及荧光桃红这6种，作为相比较于癌化细胞小集团更浓地对mdck正常细胞进行标记的化合物，鉴定了米托蒽醌二盐酸盐、以及阿霉素盐酸盐这2种，作为对癌化细胞小集团和正常细胞这两者进行标记的化合物，鉴定了恩波吡维铵、芝加哥天蓝6b、玫瑰红钠盐、酸性红以及高红v80(紫芋色素)这5种。
从fda已认可的化合物1200种的prestwickchemicallibrary中鉴定的化合物全部以1μm浓度的染色剂将细胞染色。另外，从厚生劳动省已认可的食品添加物中鉴定的食品添加物全部以1mg/ml的浓度将细胞染色。如上所述，通过将发出对癌细胞、正常细胞的任一个特异性地染色的荧光的物质与将两者染色的物质混合使用，可提高检测精度，易于发现两组织的边界附近。如此，通过将边界附近的正常细胞也消除等，可以防止假阴性的判断、在防止复发策略方面可有效地应用。这里所使用的报告基因“gfp”作为对肿瘤细胞浓浓地进行标记的物质来利用，但也可使用对正常细胞浓浓地进行标记的报告基因进行同样的评价。
【实施例3】
对8周龄的c57b6小鼠(雄性、约20g)给予含2％(w/v)葡聚糖硫酸钠(dss)的饮水7日。将5％水合氯醛0.2ml进行腹腔内注射以实施麻醉，然后将小鼠的腹壁纵向切开约1cm，将消化道在腹壁上提起约1cm。这里，流向消化道的血流由流入肠系膜附着部的血管维持。将消化道在肠系膜附着部的相反侧包含肌层和粘膜地纵向切开约1cm。切开肠系膜附着部的相反侧是为了防止血管的切断/损伤并使出血达到最小限。将消化道的切开部位上下打开时，在内部可看到作为食物通路的消化道粘膜面。这里，有食物消化物时用纸巾擦去。
为了进一步清楚地观察消化道粘膜面，在粘膜面上滴加1％链霉蛋白酶溶液、静置15分钟。通过该链霉蛋白酶处理将粘膜表面的粘液除去、细胞结构变得易于观察。接着，从粘膜表面上将链霉蛋白酶除去、利用生理盐水(pbs)进行洗涤。
将金属环(外形为16毫米、内径为6毫米)放在实验台上，在单侧面上整周地涂布瞬间粘合剂(aronalpha)。使用小镊子进行保持，使得涂布有瞬间粘合剂的金属环低于粘合剂涂布面，静置在经过链霉蛋白酶处理的粘膜面上。利用瞬间粘合剂将金属环固定在粘膜中约5分钟，利用pbs对应用色素化合物的区域进行洗涤。
按照粘膜表面不干燥的方式，在经过链霉蛋白酶处理的粘膜面上一滴滴地滴加用生理盐水(pbs)稀释了姜黄色素储备溶液或硫黄菊素储备溶液所获得的溶液(稀释倍率参照表1)，静置1分钟，用pbs洗涤3次，在金属环上载置盖玻片，从盖玻片上方拉近多光子激光显微镜(奥林巴斯公司制fv1000mpe)的物镜，观察图像。作为与上述色素化合物的染色性评价步骤说明相对应的图，示出图33。
评价色素化合物中使用的条件等及评价结果示于以下表中。
在利用多光子激光显微镜进行的观察中，关于获得用姜黄色素、硫黄菊素涂布粘膜表面时的荧光图像所需的光子量，在无染色情况下分别为3％、4％即足够了(结果未示出)。
2.正常部与癌肿瘤部的染色样式的比较
接着，对在大肠粘膜面上确认了直径为2～4毫米的蘑菇状隆起(癌)的小鼠的大肠进行染色(无链霉蛋白酶处理)，结果相比较于正常粘膜，姜黄色素和硫黄菊素均显著地将癌病变部强烈染色。将被姜黄色素染色的结果示于图23(物镜为10倍；z-stack图像)。
此外，将用1％链霉蛋白酶ms处理15分钟时的姜黄色素的染色样式示于图24(强放大、物镜为25倍)。令人意外的是，与有无粘膜表面的链霉蛋白酶处理无关，姜黄色素相比较于正常粘膜均可显著地对癌病变部强烈染色。硫黄菊素也是同样的(结果未示出)。其中，每张染色照片均是正常部及癌肿瘤部在相同条件下拍摄。
并非是为了在理论上进行限制，作为对癌病变部浓浓地进行染色的理由，可举出以下原因：相对于细胞黏附强、几乎没有细胞间的间隙的正常粘膜，在癌病变部中细胞之间的黏附弱、细胞间多有间隙，因此色素易于残留在该间隙。作为第二个可能性，考虑细胞分裂快的癌细胞对细胞外的亲油性物质(多数色素具有良好地溶于油的性质)的摄入活性比正常细胞高。另外，虽未显示结果，但即使是单层培养细胞也可确认通过色素在粘膜上皮表面涂布、癌细胞比正常细胞更浓地染色的性质。
此外，还通过获取小鼠大肠癌的多光子激光显微镜图像确认了作为该癌形态特征的异型性。将使用姜黄色素的结果示于图25。由此结果可以确认癌的检测所需的结构异型性和细胞异型性。图25(a)中，由于细胞集团未在基底膜上规整地排列、并且未形成腺结构，因此确认了结构异型。另一方面，在图3(b)中确认了细胞异型、例如各个细胞的大小不同、大核、不均一的位置、极性不均一及细胞黏附的解离。
3.其他染色性的探讨
此外，姜黄色素和硫黄菊素在被涂布于小鼠大肠的粘膜表面时，被多光子激光强烈地激发而提供明亮的图像。将结果示于图26。从色素化合物的给予到进行观察的顺序如上述染色性评价的项目中记载的那样进行(以下同样)。另外，色素在粘膜表面的给予浓度是姜黄色素为5mg/ml、硫黄菊素为1mg/ml。
此外，确认了姜黄色素和硫黄菊素对上皮细胞-腺细胞系优先地进行染色的特性。将结果示于图27a及b。这些色素对上皮细胞-腺细胞系浓浓地进行染色、对结缔组织-毛细血管系淡淡地进行染色。
4.利用激光照射排除癌细胞
在不对小鼠膀胱上皮细胞进行姜黄色素染色、而是通过细胞的自体荧光并使激光功率为82％而拍摄的多光子激光显微镜照片(图30a)中，图像暗、对比度也低、是对于诊断而言不充分的细胞图像，但在对小鼠膀胱上皮细胞进行姜黄色素染色并使激光功率为3％而拍摄的多光子激光显微镜照片(图30b)中，获得了对于诊断而言充分的亮度和对比度的图像。
在不对小鼠膀气管上皮细胞进行姜黄色素染色、而是通过细胞的自体荧光并使激光功率为82％而拍摄的多光子激光显微镜照片(图31(a))中，图像暗、对比度也低、是对于诊断而言不充分的细胞图像，但在对小鼠气管上皮细胞进行姜黄色素染色并使激光功率为3％而拍摄的多光子激光显微镜照片(图31(b))中，获得对于诊断而言充分的亮度和对比度的图像。
对于经外科手术切除的人的新鲜胃粘膜也同样地进行染色。将对人正常胃粘膜部位进行姜黄色素染色并使激光功率为1％而拍摄的多光子激光显微镜照片示于图32(a)中。该图中，排列成圆形的正常上皮细胞被染色、形成几乎均一大小的圆形结构。圆形结构的中心是胃底腺的出口。如此，可以确认就大小而言没有大小不同的上皮细胞排列成圆形的正常组织的特征。另一方面，将对同样获得的新鲜的人胃粘膜中的胃癌部位进行姜黄色素染色并使激光功率为1％而拍摄的多光子激光显微镜照片示于图32(b)中。该图中，肿瘤细胞被染色、细胞大小的大小不同明显、细胞的排列也不规则。在各细胞中，黑色空心的椭圆形位置是核。如此，可以确认就大小而言大小不同明显的细胞不规则地排列的癌组织的特征。
产业上的实用性
利用本发明的生物体染色剂，与以往的多光子激光显微镜下的自体荧光观察相比，可以显著地抑制紫外线对细胞导致的基因缺陷或热量所导致的缺陷等光损伤等，另外可以以高对比度将细胞组织形态图像化。因此，本发明的生物体染色剂可以优选地在包含消化器官的上皮细胞-腺细胞系、结缔组织-毛细血管系细胞等的其他病理组织诊断等中广泛地使用。