主管：中华人民共和国教育部主办：四川大学华西医院主编：严律南刊期：月刊ISSN：1007-9424CN：51-1505/R
引用本文：乜茹,刘川川,李文登,庞明泉,尹凤娇,冶赓博,王志鑫,樊海宁.小鼠肝多房棘球蚴感染模型中细胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路的初步研究.中国普外基础与临床杂志,2023,30(6):666-673.doi:10.7507/1007-9424.202302007复制
6～8周龄SPF级健康BALB/c雄性小鼠25只购自江苏华创信诺医药科技有限公司［生产许可证编号：SCXK（苏）2020-0009；实验小鼠质量合格证编号：NO.202142287］，体质量16～18g。实验小鼠符合动物伦理学标准，按随机数字表将实验小鼠分为对照组（n=5）和感染组（n=20），感染组再分为感染1、2、3和5个月4个亚组，各亚组n=5。用于Em保种的蒙古长爪沙鼠来自于青海省包虫病研究重点实验室。本研究方案通过了青海大学附属医院科研伦理委员会的审批（批文编号：P-SL-2019054），符合伦理原则。
试剂：Caspase-1、NLRP3、GSDMD一抗和IL-1βELISA试剂盒均购自美国Thermo公司。抗兔β-actin、辣根过氧化物酶（horseradishperoxidas，HRP）抗兔IgG和HRP抗鼠IgG二抗均购自美国ProteinTech公司。仪器：生物倒置显微镜系统（DP27）购自日本OLYMPUS公司，透射电子显微镜（JEM-1400FLASH）购自日本电子JEOL公司，超净台购自苏州净化设备有限公司，超低温冰箱购自美国Thermo公司。
将蒙古长爪沙鼠按实验要求处死，浸泡于75%的乙醇中。生物安全柜操作：将处死的小鼠腹部常规备皮消毒，取腹部正中切口逐层进腹，解剖出腹腔AE病灶。用剪刀将泡球蚴组织剪碎后加入适量PBS后进行研磨，制备出细小均匀的组织浆液。用80目的滤网进行过滤，PBS洗涤并自然沉淀3次，最后用PBS进行重悬原头节，计数后制备原头节混悬液（含原头节15000个/mL）。
感染组：将BALB/c小鼠称重后用1%戊巴比妥钠按照每只50mg/kg的剂量进行腹腔内注射，待麻醉满意后将小鼠仰卧位固定于操作台上。常规备皮及消毒，采用切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺法，取上腹部剑突下偏左0.3cm处取长约0.8cm纵行切口切开皮肤，经腹壁肌层透视确认肝左叶范围后，用1mL注射器以30°角斜行刺入肝脏约3mm深，回抽无气体、血液后，注入制备好的原头节悬液0.2mL（含原头节3000个），退针后穿刺点用无菌纱布压迫止血，间断缝皮。麻醉苏醒后常规饲养。对照组小鼠未予特殊处理，常规饲养。
根据实验要求分别处死对照组及各时相感染亚组小鼠，完整摘取肝脏，进行以下检测。
观察肝脏的大体形态，然后对照组取肝组织，各时相感染亚组取肝脏棘球蚴病灶周围肝组织，将所取组织样品置于10%多聚甲醛溶液固定24h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡及包埋，5mm厚度连续切片。苏木精-伊红染色后脱水封片，在光学显微镜下观察肝组织病理学变化。另外，将所取组织样品经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，脱水剂和Epon812包埋剂，最后Ep812包埋，制备60～90nm超薄切片，先用醋酸铀染色10～15min，再用柠檬酸铅染色1～2min，室温下染色。于透射电镜下观察并采集图片，观察超微结构病理改变。
①采用免疫组织化学法检测各组小鼠肝组织内Caspase-1和NLRP3的表达情况：所取组织标本经固定、包埋、切片、脱水处理，先后加一抗、二抗孵育，DAB显色、复染细胞核、脱水封片；ImageJ作图，GraphPadPrism8.0.2分析结果。免疫组化结果判定标准如下：细胞浆内呈现出由淡黄色至棕褐色颗粒为表达阳性，每张切片随机选取3处作为观察点，计算每高倍镜视野下阳性细胞比率，据此做统计学分析。②采用免疫印迹法检测细胞焦亡关键蛋白的相对表达水平：取对照组小鼠肝脏及各时相感染亚组小鼠病灶周围肝脏组织，充分研磨。加入蛋白裂解液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。制备5%分离胶、10%浓缩胶进行电泳，电泳开始时设置电压80V，进入分离胶后调整为120V。用湿转法将凝胶上蛋白样品转印到PVDF膜上并分别加入GSDMD、NLRP3和Caspase-1一抗封闭过夜，次日二抗孵育，TBST洗脱，继以曝光液反应后显影并拍照。结果以待测蛋白与内参照蛋白β-actin灰度值的比值表示。
将各组小鼠肝脏组织制备成匀浆液，3000r/min（离心半径13.5cm）离心10min，收集上清液于–80℃冰箱冻存备用。采用ELISA法检测，按试剂盒说明书操作，用酶标扫描仪测450nm处吸光度值（A值），根据标准品的浓度和A值做标准曲线，然后根据标准曲线方程计算出样本浓度，分析数据。
使用GraphPadPrism8.0.2统计软件分析数据，所有实验至少重复3次。正态性检验采用K-S检验，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示；组间较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Dunnett-t检验。检验水准α=0.05。
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；各时相感染亚组间比较，aP＜0.05
a：免疫印迹法检测的电泳图；b：Caspase-1蛋白的相对表达量；c：GSDMD蛋白的相对表达量；d：NLRP3蛋白的相对表达量；与对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；各时相感染亚组间比较，aP＜0.05
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引用本文：乜茹,刘川川,李文登,庞明泉,尹凤娇,冶赓博,王志鑫,樊海宁.小鼠肝多房棘球蚴感染模型中细胞焦亡NLRP3/Caspase-1通路的初步研究.中国普外基础与临床杂志,2023,30(6):666-673.doi:10.7507/1007-9424.202302007