综上所述,我们结合两种材料的优势,用聚赖氨酸修饰丝素蛋白膜,并以NSCs作为种子细胞,观察其在聚赖氨酸修饰的丝素蛋白膜上的生长和和分化情况,寻找适合中枢神经组织工程的支架材料,为中枢神经损伤后的再生和修复提供实验基础和依据。
桑蚕茧(BombyxmorisilkwormCocoon),购自南宁东桑西移丝绸有限公司;碳酸钠、乙酸乙酯、碳酸氢钠、无水硫酸镁、溴化钾、四氢呋喃均为分析纯,购自广州化学试剂厂;Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸(Nε-Carbobenzoxy-L-lysine),二(三氯甲基)碳酸酯(三光气),二甲基亚砜(99.7%,ExtraDry,withmolecularsieves,Water≤50ppm),均购自萨恩化学技术(上海)有限公司;除四氢呋喃使用前经金属钠回流除水外,其余均直接使用。
1HNMR测试:端基为N-Boc-苯胺的聚赖氨酸苄酯(B-Aniline-PLL)溶于氘代三氟乙酸(CF3COOD)和氘代氯仿(CDCl3)混合溶剂(V(CF3COOD):V(CDCl3)=15:85),浓度为10mg/mL。脱保护的带苯胺端基的聚赖氨酸(Aniline-PIL)、丝素蛋白(Silk)和丝素蛋白-聚赖氨酸接枝物(Silk-PIL)冻干样品溶于重水,样品浓度为10mg/mL,利用400M超导核磁共振谱仪BrukerAVANCE400(BrukerCo.,Switzerland)对样品结构进行1HNMR表征。
UV-vis测试:用紫外-可见双光束分光光度计(TU-1901,北京普析通用)测量再生丝素蛋白水溶液与接枝聚赖氨酸丝素溶液的UV-vis吸收光谱,扫描范围:300-600nm。
GPC测试:利用凝胶渗透色谱仪WatersBreezeGPC(WatersCo.,USA)测量分子量以及分子量分布系数。实验条件:选用Watersultrastyragel色谱柱和2417型示差检测器,流动相为色谱纯级DMF(含0.01mol/LLiBr),柱温为50℃,流速为1mL/min。
扫面电镜(SEM)观察:用扫面电镜(OXFORD,Quanta400F)检测制备的丝蛋白膜表面结构。
按浴比1:50将蚕茧加入0.02mol/L的碳酸钠溶液中,煮沸30min,用去离子水漂洗,上述步骤重复两遍,然后用温水漂洗两次,拧干扯松,鼓风干燥箱60℃干燥。按15%(W/V)的比例将丝素蛋白溶于9.3mol/L的LiBr溶液,60℃溶解1h,装入截留分子量为3500Da的纤维素透析袋,25℃透析3d,每6h换一次水,然后置于pH为9的硼酸缓冲液透析1d,4℃保存。
将5.0gNε-苄氧羰基-L-赖氨酸分散于50mL经NaH除水处理的四氢呋喃,氩气保护下,加热至55℃,加入3.5g三光气,反应1h,旋蒸除去溶剂,加入100mL乙酸乙酯溶解,用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次,分离出有机相,用无水硫酸镁干燥24h,过滤后旋蒸除去乙酸乙酯,得到Nε-苄氧羰基赖氨酸-N-羧基环内酸酐(zLL-NCA)。
取2mL1.1.5制备的聚赖氨酸修饰丝素蛋白水溶液加入24孔板,40℃鼓风干燥箱干燥12h,加入80%的乙醇水溶液,放置20min诱导丝素蛋白构象变化,去掉溶剂,自然干燥,得到稳定不水溶的聚赖氨酸修饰的丝素蛋白膜,用于后续细胞实验。
实验中采取孕16-18d胚胎SD大鼠脑组织(中山大学实验动物中心,广州,中国)在Hanks平衡盐溶液中机械切割和分离脑组织,并将细胞悬液以1000r/min离心5min。弃上清,细胞沉淀稀释成单细胞悬液。将细胞接种于培养瓶(Corning)中,用DMEM/F12培养基(含有2%B27(Gibco),1%青霉素/链霉素,1%L-谷氨酰胺(Gibco),20ng/mL成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)(Peprotech)和20ng/mL表皮生长因子(EGF)(Peprotech))在37℃、5%CO2中培养。用Accutase酶(Millipore)每周消化传代。这项研究中均使用第3代NSC进行实验,实验之前用免疫荧光进行神经干细胞鉴定。
第2代神经干细胞球用Accutase酶消化分解为单个细胞,并种植于预先用丝素蛋白膜(Silk)、聚赖氨酸修饰丝素蛋白膜(Silk-PIL)和多聚赖氨酸(PLL)包被好的24孔板(Corning)中,每孔的细胞密度为1×105cells/mL,每孔总体积为1mL,在37℃、5%CO2中培养。分别在1、3、5、7d时加入10μLCCK8试剂(JangsuKeyGENBioTECHCorp.,Ltd),37℃避光孵育3h,之后将上清液吸入至96孔板中在450nm波长下进行吸光度(OD)值测定,使用空白对照孔调零,OD值相对于空白对照组越高表明细胞活力越好,反之则越差。实验重复3次。
第2代神经干细胞球用Accutase酶消化分解为单个细胞,并种植于预先用丝素蛋白膜(Silk)、多聚赖氨酸(PLL)和聚赖氨酸修饰丝素蛋白膜(Silk-PIL)包被好的24孔板(Corning,Acton,MA)中,每孔的细胞密度为1×105cells/mL,每孔总体积为1mL,在37℃、5%CO2中培养。24h之后,将原来培养基吸出,换分化培养基(无EGF和FGF)培养1周。
诱导NSCs分化1周后,将24孔板中的细胞(n=3)上清液吸去,用PBS洗3遍,每次5min,之后加入4%多聚甲醛固定30min,用PBS洗3遍,每次5min。分别以0.3%TritonX-100透膜和10%山羊血清封闭30min,去除血清,以适当浓度一抗孵育,4℃过夜。次日将标本复温,PBS洗3次,每次5min,用荧光二抗于常温下避光孵育1h。去除荧光二抗,PBS洗2次,以DAPI(ThermoFisher)染核15min。PBS洗2次,将标本置于荧光显微镜下观察。所用一抗如下:神经干细胞标志物Nestin(1:200,CST)、SOX2(1:200,CST)、新生神经元标志物β3-tubulin(1:200,CST)、成熟神经元标志物MAP2(1:200,CST)。所用二抗如下:FTIC标记羊抗兔或羊抗小鼠抗体(1:200)。
神经干细胞分别在不同处理组上培养7d后进行蛋白提取(n=3)。用RIPA(SantaCruz)进行裂解,提出的蛋白用BCA(Beyotime)法测其浓度,统一蛋白上样量为20μg,蛋白样品利用SDS-PAGE(10%Bis-TrisGel)进行电泳分离,并转移至PVDF膜,以5%BSA进行封闭,一抗4℃过夜,对应二抗37℃孵育1h,最后以加强化学发光法显影(ECLsystem,Millipore)。所用一抗如下:Bax(1:1000,CST)、Bcl-2(1:1000,CST)、GAPDH(1:1000,CST)。各蛋白水平以GAPDH作为参照。
采用TUNEL染色法(Roche,Basel,Swiss)检测NSCs在不同处理组上培养7d的细胞凋亡情况。先用4%多聚甲醛在室温下固定10min,用PBS洗两次,每次10min,接着用0.2%TritonX-100进行透膜30min,用PBS洗2次,加TUNEL试剂避光37℃孵育1h,之后用PBS再洗2次,加DAPI染核15min。荧光显微镜下观察,凋亡细胞分布区域随机选取5个不重叠视野,计数阳性细胞数(显红色荧光)。
脑源性神经营养因子(Brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)是神经干细胞分泌的一种营养因子,对神经细胞的增殖、分化、存活有重要的影响。神经干细胞分别在不同处理组上培养7d后,用RT-PCR技术检测两组神经干细胞BDNFmRNA水平,具体操作见RNA提取试剂盒(TaKaRa)、PrimeScriptRTReagentKit和SYBRGreenPCRMasterMix(TaKaRa)说明书,引物序列见表2。
所有的统计数据用SPSS16.0和GraphPadPrism6进行统计分析和制图,结果用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni检验。*P<0.05为显著,**P<0.01为极显著。