大家好，我是你们的实验小助手小翌，上一期我们讲到了细胞凋亡检测的各种手段。这一期我们主要讲TUNEL检测细胞凋亡实验——分析实验中TUNEL染色结果失败的原因。首先要先了解一下TUNEL染色步骤，如下图所示。
图1.TUNEL染色操作步骤（注：细胞核染色步骤可选）
用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡过程中，需要用到蛋白酶K、荧光素-dUTP、TdT酶等各种试剂。除此以外，还要设置阳性和阴性对照组，面对染色步骤繁琐，许多人表示疑惑，下面我们就一一解答。
01
TUNEL试剂盒主要成分及功能
1）Equilibration缓冲液：用于维持一定的反应条件，缓冲液中的Mg2+降低背景，Mn2+增强染色效果。
2）蛋白酶K（ProteinaseK）：通透细胞膜和核膜，保证TUNEL探针进入细胞中，保证染色充分。
02
阳性组、阴性组、实验组
2）阴性组：不加TdT酶，其余操作和实验组相同。每种切片样本各需要做一个阴性对照。比如有5个老鼠的肺组织切片样本，那么就需要做5个阴性组。
3）实验组：除了阳性组和阴性组，所有的样本均是实验组。
03
为什么设置阳性组、阴性组
1）阳性组：用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题。
2）阴性组：a.排除细胞自身凋亡以及操作过程等原因导致的非特异性染色；b.调整拍摄曝光强度。
04
荧光信号弱或没有荧光信号
4.1样本处理不当
1）样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点，便于染色。2）脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60oC20min，再使用二甲苯两次5-10min；而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。
4）ProteinaseK浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20μg/mL。
4.2染色操作不当
7）TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。
9）样本干燥。加上TUNEL反应液后，请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行，保证样本均匀染色，又可防止反应液干燥。
4.3荧光检测操作不当
10）操作未避光。由于荧光易碎灭，建议标记与检测样本时，载玻片要避光，观察时要尽量快。
05
非特异性染色（假阳性高）
若已知细胞或者组织样本依然处于活细胞状态，但是用TUNEL试剂盒检测，出现了非特异性染色，和处理过的荧光信号一样强，甚至比阳性对照组荧光信号还要强。
5.1样本处理不当
1）使用酸性或碱性固定液，导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。
2）固定液浓度过高，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。
5）蛋白酶K浓度过大，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当调整蛋白酶K溶液浓度，一般工作液浓度为20μg/mL。
5.2染色操作不当
7）未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片的非特异性染色。
06
荧光背景强
6.1染色操作不当
2）TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数，优化浓度。
3)使用试剂盒提供的二价阳离子优化反应，试剂盒中的Mg2+可降低背景，Mn2+可增强染色效果。
4）PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片样本中残留的染料。