如果分组在3张图里面体现不出来，实际上后续差异分析是有风险的。这个时候需要根据你自己不合格的3张图，仔细探索哪些样本是离群点，自行查询中间过程可能的问题所在，或者检查是否有其它混杂因素，都是会影响我们的差异分析结果的生物学解释。
如果不能确认你的组内差异是小于组间差异的，那么常规的差异分析通常是有问题的。但是随着数据挖掘技术的流行，越来越多人喜欢强行找差异了，尤其是喜欢使用TMB分组，或者免疫浸润情况分组（包括CIBERSOFT计算的LM22比例分组，以及ESTIMATE计算得到的immunescores,stromalscoresandESTIMATEscores），实际上风险很大，因为它们这些指标并不能比较好的区分肿瘤病人。
文献里面的介绍是:PCAshowedthatgenderwasresponsibleformostofthevariance(PC1).Inaddition,astrikinggenotypeeffectwasseeninPCA,withtheeffectofSIRT6substantiallygreaterinmalesthanfemales(Fig.4a).
可以看到第一主成分可以完美的区分性别，而且可解释度高达63%，然后呢，第二个主成分确实是可以区分处理与否，但是在左边的male组内可以更好的区分。
现在，你知道如何描述你的主成分分析结果了吗？
然后呢，两个性别内部都有处理前后的分组，各自都可以差异分析，然后gsea分析，希望可以得到下面的两次差异分析对比结果！
UsingGeneSetEnrichmentAnalysis(GSEA),wefoundthatinflammatorypathwaysweresignificantlyinhibitedinSIRT6-tgmales,whereasasimilarbutmildereffectwasseeninfemales(Fig.4bandSupplementaryTable6).
结论是，在雌雄性别小鼠里面，都看到了SIRT6up-regulatedproteinswereenrichedformetabolic-relatedpathways,whereasdown-regulatedproteinsincludedimmune-relatedpathways
很多人拿到了我代码，喜欢问一个很“幼稚”的问题，为什么同样的代码同样的数据分析结果不一样！经过沟通后我让他说出来不一样的地方，对方又是支支吾吾，哑口无言，答非所问！