本申请要求于2016年4月7日提交的no.62/319，704和于2017年3月7日提交的no.62/468，071号美国专利申请的权益，上述二者均通过引用整体合并于此。
背景技术：
为应对此挑战，代谢工程师常用可诱导系统来控制工程代谢途径中的基因表达，并将细胞生长和产品生产分离开来。目前代谢工程的可诱导系统多为化学诱导剂或抑制剂。酿酒酵母的某些启动子便受碳源调控，如pgal1、ggal10和padh2，这些启动子则以葡萄糖为代谢的抑制剂，分别以半乳糖和乙醇为代谢诱导剂。有些启动子则通过营养物质来调节代谢，例如pmet3，在含蛋氨酸培养基中其表达受到抑制，在不含蛋氨酸培养基中表达则受到诱导。其他启动子则以某些特定的配体为诱导剂，如铜、四环素/强力霉素或β-雌二醇。尽管这些系统中的某些系统，可严格控制基因表达，但化学物质的使用必然会限制培养基成分。总之，化学诱导剂和抑制剂的调节作用相对粗糙和持久，以致其对代谢的影响程度很难把控，一旦形成在实际操作中便几乎不可能逆转。
附图说明
图1是描述了本发明的五个基本组成部分的示意图。
图2描述了酵母中异丁醇和乙醇代谢途径。
图3描述了一种vp16-el222光诱导基因表达系统。
图4和图5是包含optoexp系统的一个是实施例的菌株gfp表达水平图。
图6描述了gal4p、gal80p和gal1启动子之间的相互作用。
图7a、图7b、图7c以及图7d描述了利用optoinvrt回路的实施例激活和抑制基因的方法。
图8a、图8b以及图8c是包含optoinvrt回路的实施例的菌株的gfp表达水平图解。
图9a描述了甘油板上的酵母菌株的复制板。
图9b描述了在暗环境中生长在葡萄糖板上酵母菌株的复制板。
图9c描述了在光照环境下生长的葡萄糖平板上酵母菌株的复制版。
图10是用optoexp回路来控制pdc1的实施例的情况下，光依赖性生长菌株的生长曲线图。
图11是光照周期与酵母最大生长率的关系图。
图12描绘了酵母的乳酸和乙醇代谢途径。
图13a、图13c以及图13e分别为于不同od时移入黑暗环境中，含optoinvrt1、optoinvrt2、optoinvrt3菌株的乳酸和乙醇体现滴度曲线图。
图13b、图13d以及图13f分别为在不同od时移入黑暗环境中，含optoinvrt1、optoinvrt2、optoinvrt3不同菌株的乳酸与乙醇产量比的曲线图。
图14是不同od时移入黑暗环境中含有一个optoinvrt1的菌株的乳酸与乙醇产量比的曲线图。
图15是不同od时移入黑暗环境中含有一个optoinvrt2的菌株的乳酸与乙醇产量比的曲线图。
图16描述了酵母的乙醇、异丁醇和缬氨酸代谢途径。
图17a是optoexp(pdc1)系统中含乙醇途径的异丁醇代谢途径，及不同的od时5移入黑暗环境的optoinvrt1回路菌株的异丁醇的代谢途径的图解。
图18是在optoexp控制的系统中含乙醇途径(pdc1)的异丁醇和2-甲基-1-丁醇代谢途径，及受optoinvrt1回路控制的菌株，以开15秒/关65秒为工作负载循环，曝光时长30分钟的异丁醇代谢途径。
图19是不同光照工作负载循环下，optoexp系统下含pdc1基因的菌株生长曲线图。
图20是与pdci控制下的野生型菌株和固有的异丁醇代谢途径(yzy335)相对比，optoexp(pdc1)系统中含乙醇途径的菌系及optoinvrt1(yez167-4)含异丁醇代谢途径的菌系生长的示意图。
图21是示出了在optoinvrt1回路，optoinvrt2回路，optoinvrt3回路的控制下含gfp的菌株的光-暗动力学示意图。
图22是用h1s3整合载体对酵母进行回路克隆的图示。
图23是用delta整合载体对酵母进行回路克隆的图示。
图24和图25是控制酵母基因表达的方法流程图。
图26是异丁醇(yez167-4)生产时批补料发酵的加工时序的发酵数据。
具体实施方式
在此，本发明公开了一种用光来控制基因表达来生物合成希望的和有价值产品的系统和方法。
所公开的系统和方法可应用于多种生物体，包括但不限于酵母、细菌和霉菌。
本发明实例利用了酵母细胞中存在一种受至少一种波长的光线双向控制的复合基因的特点，因此，我们一般所说的酵母细胞应包含两个或两个以上能够用光双向控制的基因。当这些基因暴露于某一波长光线时，其一个基因从关到开(当置于无光或不同波长环境时，则由开到关)，另一个基因从开到关(当置于无光或不同波长环境时，则由关到开)。在优选实例中，第一基因和第二基因均是一种代谢酶，而在更优化的示例中，这些代谢酶竞争至少一种资源，包括但不限于代谢物、蛋白质或营养素。在某些实例中，选择代谢酶以便促使细胞过量生产所需化学物质，而野生型菌株不产生这些化学物质。在一些实例中，过度生产化学物质对酵母细胞是有毒性的，如乳酸、异丁醇、异戊醇(3-甲基-1-)丁醇)或2-甲基-1-丁醇。在一些实施例中，一个或多个酶是对细胞生长至关重要。尽管其他种类的酵母也被尝试过，但优选的酵母细胞来自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。在更优选的实施例中酵母细胞的改造中，第一基因包含gal80或pdc1，第二基因包括ilv2或ldh。
参考图1，公开了一种广义系统(10)。在该系统(10)中，给出了5个蛋白质结构或序列(20、30、40、50、60)。
第一序列(20)包含启动子(22)和编码光激活转录因子基因序列(由多个蛋白质序列融合而成)，当置于某一特定波长时，与启动子序列和基因转录序列相结合并被激发(24)。第一序列(20)也包括终止子(26)。在优选的启动子实例中，启动子可在某些特殊底物上生长时得到表达，如葡萄糖。在更优选的实施中则用构建的启动子tef1(ptef1)为启动子。转录因子用融合了至少一个光氧电压(lov)结构域的cry2、cib、郁金香(tulip)或光敏色素b(phyb)和pif3结合域。在一种更优选实例使用el222。其他实例则使用与转录因子相结合的附加结构域，如使用vp16转录激活域和核定位信号序列(nls)。这些额外结构域可加在转录因子的n端或c端。在终止子选择上(26)，尽管理论上可以选择任意终止子，但优先实例中终止子(26)则多使用cyc1(tcyc1)、act1(tact1)或adh1(tadh1)。
第二序列(30)可以用于用光调节生长必需的酶来控制生长。例如，在酵母菌株有三重pdc缺失(pdc1-δ、pdc5-δ和pdc6-δ)，其中关闭pdc1可以阻止其在含葡萄糖培养基中的生长。因此，第二序列(30)包括启动子(32)和编码代谢酶的基因(34)，其中代谢酶(34)倾向是生长必需酶，如pdc1，是有三重pdc缺失的酵母菌株在含葡萄糖培养基中生长所必需的。启动子部分(32)优选序列为可结合转录因子融合物(24)的序列，如pc120。
此外，第二序列(30)也可与可选的降解决定子结合域融合(36)，也可包含终止子(38)。可选降解决定子结合域(36)的选择优选光敏降解决定子(psd)结构域，化学诱导降解决定子结构域，或固有的活化降解决定子结构域。
对于终止子(38)，可以利用任何适当的终止子都，然而实例中优选终止子(38)多用cyc1(tcyc1)、act1(tact1)或adh1(tadh1)。
第三序列(40)包含一个启动子(42)，该启动子可由第一序列编码的基因激活，并且第三序列(40)还可以包括编码抑制剂的序列(44)。启动子(42)优选能与结合转录因子的序列融合的启动子(24)，如pc120。如下所述，抑制剂常可用于控制第四序列(50)；在缺失内源性gal80抑制剂的菌株中，则多选gal80为抑制剂。与第二序列(30)相似，第三序列(40)也可包含可选降解决定子结构域(46)或终止子(48)。降解决定子(36)优选光敏降解决定子(psd)结构域，化学诱导降解决定子结构域，或基本活化降解决定子结构域。终止子(48)选择上可使用任何终止子，但优选实例中常用cyc1(tcyc1)、act1(tact1)、adh1(tadh1)。
第四序列(50)包括启动子(52)和诱导表达代谢酶(54)的基因部分。启动子(52)可被第三序列编码的抑制剂抑制，被第五序列编码(60)的基因激活，或两者都有。在更优选的实例中，启动子为gal1启动子(pgal1)；一个强启动子通常是由gal4p激活的，如果不是为了抑制子gal80p。
第四序列(50)部分序列可诱导一个或多个代谢酶或蛋白质(54)表达，通常是用于让酵母过量生产所需的化学物质。例如，表达代谢酶可是用于控制酵母菌产生乳酸(如：ldh酶)、异丁醇、2-甲基-1-丁醇，和/或异戊醇(3-甲基-1-丁醇)(如：ilv2p酶)的生产途径的酶。第四序列也可用于设计诱导蛋白质表达，例如，gfp。与第二序列(30)和第三序列(40)类似，第四序列(50)也可由可选的降解决定子域(56)，也可包括终止子(58)。降解决定子(56)倾向用光敏降解决定子(psd)域，化学诱导降解决定子结构域，或固有活化的降解决定子结构域。终止子(58)选择上可使用任何终止子，但优选实例中常用cyc1(tcyc1)、act1(tact1)、adh1(tadh1)。
简要参考图2，酵母的代谢途径(100)始于葡萄糖(105)而止于理想目标产物，异丁醇(140)，或至于无用产物物，乙醇(130)。实例中，第四序列(50)可诱导至少一个表达一种代谢酶的基因，以促使所期望的从丙酮酸酯到异丁醇的代谢途径完成：如ilv2(120)、ilv5(122)、ilv3(124)、kdc(126)和抗利尿激素adh(128)。如图2举例所示，此序列可正向调节ilv2基因(120)。例如，ilv2基因可与控制某一特定营养素的启动子相融合，该启动子包括但不限于半乳糖调节启动子，如pga1或pgal10。因gal4p可激活pgal1，所以常与gal4p-ilv2相融合以达到gal4p正向调控ilv2基因表达的目的。
如上所述，如果使用了第五序列(60)，那么就应该使启动子序列(62)编码表达内源或外源活化剂(64)，启动子可选择固有启动子、诱导启动子、或基因回路。与电子回路类似，基因回路是生物学的一种应用形式，是将生物元素按特定路线设计后使其具有逻辑功能。逻辑函数变化很大，但可诱导化学物质的产生或添加一个可直观检测的元素，例如，gfp。在某些实例中，激活剂为gal4p。在其他实例中，第五序列还可采用下列启动子，tef1(ptef1)、act1(pact1)、adh1(padh1)，pgk1(ppgk1)，或tdh1(ptdh1)。与第二序列(30)、第三序列(40)和第四序列(50)类似，第五序列(60)也可由可选降解决定子结构域(66)并可包含一个终止子(68)。在降解决定子选择实例中，降解决定子(36)优选光敏降解决定子(psd)结构域、化学诱导降解决定子域、或基本活化降解决定子结构域。终止子(68)选择上可使用任何合适的终止子，但优选实例中常用cyc1(tcyc1)、act1(tact1)或adh1(tadh1)。
dna结构组装
为了便于简单操作和生成多基因质粒，常将启动子-基因-终止子序列克隆到标准化系列载体中(pjla载体，avalos等，2013)。为方便基因插入到pjla载体，我们给所有基因的5'端和3'端均分别设计了nhei和xhol的限制酶切位点。在每个启动子-基因-终止子结构的5'端两侧设计上xmal和agel限制酶切位点，3'端设计上mrel，ascl和bspei位点，这么做的也是为达到如上所述，方便多基因质粒的重组的目的(pjla载体，(avalos等人，2013)(见附表1)。
如图22所示，将单拷贝重组质粒pnh603(hyunyouk和wendella.lim2014)进行改造，使其与pjla载体相容后再将基因片段导入到his3基因位点上。先将pnh603的ascl位点移除，再用含有xmal限制酶切位点的片段将ptsl与sacl之间的tadh1序列替换。随后，在xmal(含被替换的tadh1序列)和kpnl限制酶切位点之间，引入克隆组合序列xmai(2410)、asci(2412)、mrei(2414)和bspei(2416)，生成pyz12-b重组质粒。所得到的pyz12-b重组质粒可与pjla载体相容，且易于从pjla2μ质粒实现基因盒的转移。pyz12-b的基因构图是用线性质粒和pmel一并整合到h1s3位点中的(2420，2422)。用prsii416引入单拷贝体同位异质粒(cen)基因；用xmal和mrel从pjla载体中分离出构建好的基因，并将启动子(2440)-基因(2442)-终止子(2444)基因盒插入到prsii416的xmal位点上。
所有载体在转化酵母菌前均用sanger测序法进行测序确认。
酵母转基因
酵母转基因采用标准醋酸锂方法进行，最终所得菌株见附表2。分别将pyz12-b和pyz23中的基因结构整合到h1s3位点和δ位点上，用含pmei线性化质粒载体，依qiagenpcr纯化试剂盒操作流程纯化。用同源重组方法进行基因删除。dna片段是侧翼序列含lox-p位点的抗生素抗性基因盒，是用pcr法从pag26(含潮霉素抗性基因hygb-phosphotransferase)，pug6(含g4l8抗性基因kanmx)，或pag36(含诺尔丝菌素抗性基因nati)中扩增获得，引物用含40bp同源基因的启动子和终止子区域引物完成基因删除。通过表达cre重组酶(guldeneru、heinischj、kohlergj、vossd、hegemannjh、nucleicacidsresearch2002；30，e23)将抗生素抗性标记从psh62(af298785)载体中去除。细胞转染后，将细胞铺于依赖于自身结构的自养恢复状态的完全合成的敲出培养基(sc)上。在抗生素选择的情况下，将细胞铺于非选择性的ypd钢板上16小时，然后将复制盘也铺于ypd上，并加300ug/ml潮霉素(购自invitrogen公司)，200ug/ml诺尔丝菌素(购买自sigma)，或200ug/mlg418(购买自gibcobylifetechnologies)。用800-1200ug/mlzeocin(购买自热费希尔科学)选择δ-组装。
所有基因组整合或基因删除的菌珠均用pcr进行基因分型以确保其精确度。
酵母细胞培养生长、分离及光学测定
除阐述的特殊情况外，酵母细胞一般于24孔板培养，添加ypd或2％葡萄糖的sc-dropout(sc-缺失)培养基，在30℃下，转速为200rpm摇床培养。细胞在光照下生长时，于培养物上方40cm处放置蓝色led面板(hqrpnewsquare12英寸长，浅蓝色led14w)。用一个近波多功能无限循环可编程数字定时器调节nearpowled面板以控制光照工作周期。
用tecan平板阅读器(infinitem200pro)测取荧光和光密度(od600)，分别测取485nm处激发波长和535nm发射波长来荧光检测gfp，所有测量数据都使用最大收率。先从数值中减去介质的背景荧光，然后，从每个gfp样本的荧光值(gfp/od600)被减去来不含gfp的细胞的gfp/od600比值，以校对培养基和细胞内容物的衍生色。以培养基(暴露于同样条件)为空白对照，在600nm处测光密度。
使用带24孔板适配器的转子来将细胞培养物在台式离心机中进行离心。除另有说明之外，在1000rpm下离心10分钟。
optoexp系统构建
如图3所示，vp16-el222光诱导基因表达系统，适用于构建酿酒酵母s.cerevisiae.光诱导基因表达系统(optoexp)。该系统之前在哺乳动物细胞(motta-mena2014)、斑马鱼和大肠杆菌(jayaraman2016，nashpnas2011，rivera-cancelbiochem2012)中都也得到了应用。
为实现此目的，基因盒子包含强连续tef1启动子(ptef1)下的vp-el222转录因子，和pc120下的绿色荧光蛋白(gfp)，其中pc120启动子可由vp-el222在光刺激下激活，随后整合在cenpk2-1c酵母菌株的his3位点，最终构成菌株yez139。
我们购买的一个g-block(idt)试剂盒含酵母vp16-el222密码子最佳优化序列，且两翼序列中有nhei和xhoi限制位点，这两个限制位点常用于将基因插入pyz12-b的质粒(允许在his3位点进行单个整合)中的ptef1启动子和tcyc1终止子之间，从面构建成ez_ll58质粒。此外，c120和最小启动子序列(tagagggtataatggaagctcgacttccag)，又被称为pc120，pc120于biobasic的基因合成公司合成，用pc120启动子分别与adhl终止子或acti终止子搭配后，构建成pjlalxl0803载体和pjlalxl0802载体(见附表1)。
将gfp置于pc120转录控制下，用含ura3标记的cen/ars质粒构建ez_l83质粒(pjla111-gfp0803)。常用ez_105将单拷贝ptef1-el222-vp16-tcyc1结构整合到cenpk2-1c的h1s3位点上，从sc-his+2％葡萄糖培养板中选出菌株yez24。随后，用ez_l83转化yez24，从sc-ura+2％葡萄糖培养基板中选出菌株yez32。为对ptef1-el222-vp16-tcyc1组合和被称为optoexp系统的单个拷贝整合pc120进行校准，常将他们与多个固有启动子表达gfp的产量进行比较。为实现此目的，设计pjla111-gfp构造时(带ura3标记的cen/ars质粒)常包含pcyc1(ez_l64)、padhl(ez_l63)、ppgkl(ez_l67)、pgpdl(ez_l65)以及ptefl(ez_l66)，这些质粒常与prsii416(空质粒对照)一起用来转化yez24构建yez28(ez_l64)、yez28(ez_l63)、yez2(ez_l67)、yez3o(ez_l65)、yez3l(ez_l66)及yez32c(prsii416)。
为检测这些菌株，将细胞置于锡箔纸下使其避光过夜生长，每个转化菌株均检测四个不同克隆。过夜生长后，将培养物的0d600稀释至0.1后，取每个细胞培养液lml加入到24孔板的单个小孔中。准备五个相同的盘子，其中的一个用锡泊包裹，将这5个盘子置于恒定蓝光或蓝光下，光照循环参数设置为开5s/关75s，开8s/关72和开1s/关69s。利用光照工作循环代替光照强度，以便更好地控制光密度和重复性。如上所述，以yez24作无gfp生产对照，细胞培养在蓝光面板下培养8小时。误差条表示4个生物复制盘的一个标准差值(n＝4)。
据曝光量测定yez139中gfp表达水平，通过光照循环控制调整pc120表达水平。图4所示，比较避光或全蓝光环境下生长的yez139的gfp荧光情况，及光的中间占空比。发现从无光到有光环境下gfp的表达量最大提高了43倍，且可通过光照工作循环来对其调节控制。
图5示出了与酵母菌代谢工程中常用的强本构启动子的gfp表达量相比，本文构建的(pc120-gfp)的表达量最高。optoexp系统的最大激活水平可与醇脱氢酶adhi启动子组成系统的激活水平相提并论，adhi启动子组成系统在代谢工程应用中常位于本构启动子强度的低端。可通过整合多拷贝pc120-gfp来克服这种相对表达水平较弱的现象。
optoinvrt回路的构建
虽然从原理上讲，optoexp足可以将发酵过程的生长阶段和生产阶段分开，但第二个转录过程可通过用光遗传回路对光的转化应答反应来同时进行，这个原理类似于许多数字处理所需的非逻辑门。因此，我们开发了一种光遗传回路，下文称optoinvrt，其置于蓝光时可抑制基因表达，避光时则诱导基因表达。
为构建optoinvrt回路的示例，我们利用酵母半乳糖(gal)代谢的基因调控机制原理。通过光调节gal1启动子(pgal1)上的转录因子gal4p和抑制剂gal80p的活跃度及之间的互作用，来达到控制这些回路并使其工作。如图6所示，pgal1(510)是由gal4p(520)激活的强启动子，其可在不含抑制剂gal80p(530)的葡萄糖环境中持续保持活性(570)。在野生型菌株中，则用gal3p与半乳糖(诱导剂)结合，去除了gal80p的抑制性。在gal80-δ菌株中，gal80放置在pc120下方，在固有gal4情况下表达，pgal1光依赖性抑制可以被诱导。
从菌株yez44构造开始，删除gal80和gal4，引入包含ptef1-vp-el22、pgal1-gfp、padh1-gal4及双拷贝的pc120-gal80的基因盒子。该基因回路被称为optoinvrti，将其一并整合在yez44的his3位点上，以生成yez100(见附表2)
图7a至图7d示出了常规概念上的操作模式。为了达到用光控制gal80表达的目的，我们在yez44菌株的pc120下引入了双拷贝的gal80，在强连续启动子ptef1下整合了el222。并用pgal1(620)控制gfp(622)报告分子，去表征optoinvrt1电路的强度和光感度。如图7a和图7b所示，当进行光(605)激活时，生产gal80p，gfp(622)的gal4p转录减弱。而图7c和图7d所示，关灯(607)时，gal80p停止生产，gfp(620)的gal4p转录被激活。
我们还设想了其他不同的optoinvrt回路，这些变化可能对于不同方面的代谢工程应用有所帮助。例如，改变启动子位置，使gal4换到强连续ppgk1启动子上，称为optoinvrt2。此外，我们还将光敏降解决定子结构域(psd)(usherenko2014)融合到gal4p的c端，使其在光刺激下诱导蛋白降解。还联合表达ppgkl的gal4-psd，此称为optoinvrt3。在yez44的his3位点中分别整合上optoinvrt2和optoinvrt3，使其各自分别成为yez101和yez102，以pgal1-gfp为报告分子，记录三种回路之间的显著差异(见附表2和附表4)。
这些optoinvrt回路最初是在两种酵母菌株背景下中被开发和鉴定的：第一种菌株是yez44，该菌株是含gal80-δ、gal4-δ缺失的cenpk.2-1c。第二种菌株是y202，其是y200，by4741衍生物，含gal80-δ缺失。(见附表2)
为预防回路从光到暗的倒转，我们将电路转换成yez44(yez100，101，102)和y202(yez115，116，117)对其进行了测试，这对于将这项技术作为一个代谢开关应用到代谢工程中至关重要。同时也对optoexp系统的设计也做了相同测试。光脉冲只开8s/关72s以确定gal80p处于低感应电路时的有效性。
见图8a，当yez100避光生长时，optoinvrt1回路呈gfp高表达现出，相当于ptef1水平的70％。然而，在蓝光下生长时，我们观察到gfp信号下降了45.7倍，表明optoinvrt1回路是一种高效的光抑制转换因子。
如预期所料，从光照到避光环境时，相比optoinvrt1或optoinvr2，optoinvrt3的gfp表达量(大于70倍)显著增加，可能是因光诱导的gal80表达和gal4p抑制之间的协同作用导致的。然而，这些变化是以避光时降低最高gfp表达量为前提的，约仅点ptefl的21％，这可能是因gal4p-psd融合蛋白稳定性或活性降低所致。我们呈现的这些电路在光灵敏度方面也表现出了广泛的差异性。其中optoinvrt3的光灵敏度最高(只有于10％光剂量就会有90％的最大抑制)，optoinvrt2的光敏度(10％光剂量仅有12％抑制率)。
这些回路在随后用其控制不同背景的菌株代谢时表现出类似的光响应，如y202，是从s288c-衍生菌株(见图8b)中删除了三个内源性丙酮酸脱羧酶(pdc1，pdc5、pdc6)和gal80而得来的。结果表明，该平台能实现大范围表达水平、光敏感性，倍数差异的要求，并灵活结合到多代谢工程应用中。
同样，随gal4p的不同，三个示例电路的稳定性和活性也有所不同。较强的本构启动子(ppgk1)可促进optoinvrt2中的gal4表达。与optoinvrt1(padh1)相比，携带optoinvrt2的细胞能产生较高水平gal4组分。这就导致，相比于optoinvrt1，于避光环境下optoinvrt2基因控制的gfp表达量略高于最大表达量(占ptef1的85％)，且其在全光下也有较高的背景表达量(见图8a)。
正因为这个差异，尽管两种电路的最大表达水平相似，但使用optoinvrt1(40)倍可以实现的基因诱导折叠要比使用optoinvrt2(10倍)高。此外，携带optoinvrt1的细胞中较低水平的gal4p使该电路对光更敏感，仅在10％的光照下(8/80秒占空比)就能将gfp抑制50％。另一方面，optoinvrt2在相同的光剂量下只有12％的抑制作用。optoinvrt3使用与optoinvrt2(ppgk1)同样的强启动子来驱动gal4的表达，但是基因产物gal4p被融合到一个光敏降解决定子区域，这会降低gal4p在蓝光下的稳定性。这使得optoinvrt3电路有最高的基因诱导倍数(70倍)。它还使optoinvrt3成为最敏感的电路，只需10％的光照就能达到90％的基因抑制。然而，如图8a和8b所示，使用optoinvrt3实现的最大基因表达量仅为另外两个电路(20％ptefl)的四分之一左右，这可能是由于黑暗中gal4p的不稳定性增加(由于光激活降解决定子的泄漏)、gal4p-psd融合的活性降低，或者两者都有。
因此，如果特定的应用需要最大限度的基因表达，或者需要一个即使短暂光照射下(例如无意的光泄漏)也能保持基因诱导的反射回路，那么在三个示例回路中，optoinvrt2可能是最好的选择。如果应用程序需要在全光条件下进行更严格的基因抑制，但仍然需要高水平的最大基因表达，或者需要一个更敏感的电路，可以通过短光脉冲显著抑制基因，那么optoinvrt1是最可取的。最后，如果应用程序需要非常低的背景基因表达，或者只需要短脉冲光就能强烈抑制基因，那么optoinvrt3可能是首选的回路。
预计还会有其他的optolnvrt回路的变体。例如，在一些实施例中，gal80可能有一个附加在其上的降解序列，以便电路在黑暗中更快地打开。为此设想了许多降解域，其中可能包括但不限于pest生物序列，例如具有该序列的cln2pest生物序列——
asnlnisrkltistpscsfensnstsipspasssqshtpmrnmsslsdnsvfsrnmeqsspitpsmyqfgqqqsnsicgstvsvnslvntnnkqriyeqitgpnsnnatndyidllnlnesnkenqnpatahylnggppktsfinhgmfpsptgtinsgksssasslisfgmgntqvi；具有acknwfsslsafvial序列的cl1突变标记；或者是一个鸟氨酸脱羧酶(odc)衍生序列，例如一个odc突变标记，其序列为:fppeveeqddgtlpmscaqesgmdrhpascperaacasarinv。在一些实施例中，启动子也被修改，这可能包括但不限于修改。gal1启动子(pgali)通过删除一个mig1p-binding位点和/或添加额外的gal4p-binding位点。这些pgal1突变体的示例可以在以下序列中看到:
(1)agctggagctcaccggtatacccgggcggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggttggtaaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttattttagtagtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaactatagcggccgctaaaatcatggc；
和
(2)agctcaccggtatacccgggcggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggatgatttttgatctattaacagatatataaatataaatgcaaaaacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggttggtaaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttattttagtagtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaactatagcggccgctaaaatc，其中，第一序列删除了一个mig1p-binding位点，而第二序列删除了一个mig1p-binding位点和额外的gal4p-binding位点。
图8c比较gfp的表达yez31(890)(ptefl驱动gfp表达)和optoinvrt电路使用ppgkl驾驶gal4表达式，gal80融合到degron域(在这个示例中，一个odc突变标记)和pgall的mig1p-binding位点删除(870)，或者一个mig1p-binding位点删除和额外gal4p-binding位点(880)。图8c展示了折叠变化响应的差异，在不同的代谢工程应用中提供了灵活性。
optoexp-pdc菌株的形成
在s.cerevisiae酿酒酵母的葡萄糖发酵过程中，乙醇的生成直接与丙酮酸、乙醛或乙酰辅酶a的任何衍生产物竞争。丙酮酸脱羧，在三种丙酮酸脱羧酶(pdc1、pdc5、pdc6)的催化下，大部分丙酮酸转向乙醇的形成。然而，这些基因的三重缺失使酵母无法在葡萄糖上生长，因为它们在nad+循环糖酵解过程中起着至关重要的作用。optoexp回路可用于构建代谢阀来调节pdc1的表达。这种阀门可以在光线下“打开”，通过正常的发酵和乙醇生产，使细胞处于强健的生长阶段，然后在黑暗中“关闭”，以减少乙醇与其他丙酮酸衍生产品在生产阶段的竞争。
optoexp-pdc菌株的光依赖性生长
如图9a、图9b和图9c所示。野生型菌株by4741(910，920，930)、yez61-23(912，922，932)、yez61c(914，924，934)和yez50c(916，926，936)的细胞在一个ypge培养皿的条带上，并培养成菌落。然后将该板复制在一个ypge板(图9a)和两个ypd板上。其中一个ypd板包裹锡箔纸(图9b)，另一个在恒定的蓝光下照射(图9c)，而ypge置于周围光照下(图9a)。进行了培养板复制，首先复制了包裹锡箔的ypd板，然后是暴露在恒定蓝光下的ypd板，最后是ypge板。所有的板子都在30℃下孵化48h。图9a表示所有菌株都可以在甘油的存在下生长，而图9b表示只有野生型菌株可以在没有光照时在葡萄糖平板中生长。由图9b和图9c对比可知，菌株yez61-23(912，922，932)只能在葡萄糖平板上并且有光照时生长。
这些观察结果与酵母菌在有葡萄糖存在并且缺乏pdc酶时不能生长的预期一致；事实上，无论是三重pdc敲除还是暗培养的yez61细胞都没有观察到生长。与之相反，光刺激能够引起yez61菌株的生长，与yez61在光刺激时表达pdc1一致，yez61在光诱导下表达的pdc1可以在含有葡萄糖的液体培养基中观察到，在不同的光刺激下，生长速率被量化。如图10所示，在完全黑暗(1010)下，生长速率接近于零，工作周期为0s/80s。它随着光剂量的增加而增加。图示为12.5％的工作周期(1020)(10s/80)和全光(1030)(80s/80s)。在全光时，比生长速率约等于野生型菌株(by4741)(1040)的比生长速率。
产生生产化学物质的菌株
在代谢工程中，一种化合物的生物合成途径经常与其他途径竞争，这些途径不能缺失，因为它们对细胞生长至关重要。s.cerevisiae酿酒酵母中常见的一种情况是发酵过程中的乙醇生成，它直接与任何丙酮酸、乙醛或乙酰辅酶a的衍生产物竞争。在丙酮酸的情况下，由pdc1、pdc5和pdc6编码的酵母丙酮酸脱羧酶的三种同工酶使大量的这种关键代谢物形成乙醇。由于丙酮酸脱羧酶(pdc)的产物乙醛是电子受体，它能恢复大部分nad+用于糖酵解，因此三基因突变会导致菌株不能通过发酵在葡萄糖上生长；由于葡萄糖介导的抑制，它也不能通过呼吸作用生长。
optoexp和optoinvrt可以用来控制发酵的生长和生产阶段，将酵母的代谢从乙醇转化为一种可替代的发酵产物。可以说，最简单的乙醇替代品是乳酸，如图12所示，它是由电子从nadh转移到丙酮酸(乳酸脱氢酶(ldh)催化的反应)产生的。乳酸是一种有价值的产品，用于食品、药品和化妆品行业，以及生产聚乳酸，一种生物可降解的生物塑料。它是由乳酸脱氢酶(ldh)催化的丙酮酸酯还原产物，直接与乙醇的形成竞争。本发明平台可以同时控制optoexp表达pdc1，optoinvrt表达ldh，切换细胞在蓝光下发酵乙醇到在黑暗中发酵乳酸。
为开发光依赖性乳酸菌株，将ez_l259、ez_l260、ez_l266(optoinvrt1、optoinvrt2、optoinvrt3)分别线性化后转染进y202(pmei)，分别产生yez115、yez116和yez117。此外，多个副本的基因盒(ez_l235、附表1)包含pc120pdc1和pgall驱动乳酸脱氢酶(ldh)pelodiscussinensis(三星研究中心李博士所提供的)被整合进-δ位点，产生yez144(optoinvrt1)yez145(optoinvrt2)和yez146(optoinvrt3)(附表2)。这些菌株在光照条件下表达pdc1并抑制ldh，在黑暗的情况下正好相反。
optoexp和optoinvrt也可以用来控制乳酸以外的化合物发酵的生长和生产阶段。异丁醇的毒性明显高于乳酸，如图2和图16所示，异丁醇的生物合成通路较长，可分为上游(1610)和下游(1620)的2个通路阶段。上游通路(1610)由支链氨基酸生物合成的三种第一酶组成，它们包含在线粒体中:乙酰乳酸合成酶(ilv2编码)、酮醇酸还原酶(ilv5编码)和二羟酸脱水酶(ilv3编码)。下游通路(1620)为ehrlich氨基酸降解通路，它由两种胞质酶组成:a-酮酸脱羧酶(由pdcs编码的kdcs，但也有aroi0，不作用于丙酮酸)和醇脱氢酶(由adhs编码)。
optoexp和optoinvrt电路可以用于光能控制酵母生产异丁醇。异丁醇是一种先进的生物燃料，毒性远远高于乳酸。一种方法是光遗传学上仅控制异丁醇途径中的第一酶，即乙酰乳酸合成酶(ilv2编码)，留下随后的酶组成表达，这将使光控制通路通量而不积累潜在的不良中间体。
为了开发这些光依赖性异丁醇产生菌株，将三个光依赖性异丁醇电路集成到y202的his3位点中，并将含有pgau-ilv2和pc120-pdc1的盒式磁带多拷贝到delta-integration位点，形成菌株yez131、yez149和yez133。然后每种用ezl310转染(附表1)，2μ质粒包含一个完整的线粒体异丁醇生物合成途径，下游的酶(1620)针对线粒体使用coxivp线粒体定位信号。该质粒内的所有基因均以强固有启动子表达，但ilv2表达于pgall，pgall受光陷性回路控制。这些转化分别导致yez159、yez156和hpy6菌株分别为optoinvrt1、optoinvrt2和optoinvrt3菌株。
筛选高乳酸和异丁醇生产菌株
我们进行了测试，以确定yez144、yez145或yez146是否能经过依靠光的变化代谢，从乙醇变为乳酸；yez159、yez156和hpy6是否能经过依靠光的变化代谢，从乙醇变为异丁醇。
从每个转化板(在葡萄糖和蓝光下培养)中筛选出12个菌落，用于乳酸或异丁醇的生产。每个菌落分别接种在24孔板里的培养基上，每孔lmlsc-his+2％培养基(用于产乳酸菌株)或sc-ura+2％葡萄糖培养基(用于产异丁醇菌株)，在30℃下，以200rpm在蓝光下培养过夜。第二天早上，用新鲜培养基将每种培养基稀释到od600为0.1(生产异丁醇菌株od600为0.15)，培养16小时(用于乳酸生产)或18小时(用于异丁醇生产)，同样是在30℃、200rmp和蓝光下培养。在孵育期后，培养物od600值达到5(乳酸菌株)，并且培养物od600值达到5(异丁醇菌株)和8(异丁醇菌株)；这时，转移到黑暗中，乳酸菌株培养6小时，异丁醇菌株培养3小时。然后将培养基以1000转/分钟的速度旋转5分钟，在新鲜的培养基中重新悬浮，然后用nunc密封带(thermoscientific)密封，开始发酵。这些孔板在30摄氏度的黑暗中孵育，在发酵过程中以200转/分钟的速度摇动48小时。随后，在1000转/分钟离心10分钟，收集上清进行hplc分析。
对于产异丁醇的菌株，含有optoinvrt1的yez159菌落中，含有4％的葡萄糖的培养基产生了最高的异丁醇滴度。与含有optoinvrt2或optoinvrt3的菌落相比，含有optoinvrt1的yez159菌落能从4％的葡萄糖中在od600为8时从光向暗产生最大量的异丁醇。在od600为5时，细胞从光向暗移动的趋势也一样，其中含有optoinvrt1的菌落比含有optoinvrt2或optoinvrt3的菌落能更有效地产生异丁醇。
为了进一步提高异丁醇生产，从yez131中删除争夺a-酮异戊酸前体的线粒体支链氨基酸转氨酶和bat1，产生yez158，再用质粒将ez_l310转入产生yez167(附表1和附表2)。yez167筛选七个菌落后，如上所述，认为yez167-4能生产含量最高的异丁醇。
发酵优化
暗孵育期优化。为了优化发酵前的暗孵育期，以2％葡萄糖的sc-ura培养基，在蓝光下培养出最好的异丁醇产生菌株yez167-4。然后，用新鲜培养基将过夜的培养基稀释成7份0d600为0.1，每个样品4个重复。然后将培养物培养到od6008.5(在之前的实验中发现这是最理想的od600)。在那个时候，为了确保完全的黑暗，那些盘子被锡纸挡住了；每隔一小时离心一个培养皿，细胞悬浮在新鲜的sc-ura培养基中，用20.8g/l葡萄糖培养基在黑暗中发酵48小时。
更进一步，这个高异丁醇产量和滴度的示例是用一个非最优遗传背景的菌株实现的。除了线粒体异丁醇生物合成途径和光遗传学控制外，yez167-4唯一的遗传改良是缺失batl-△，这已被证明可以提高异丁醇的产量。然而，还有其他一些可能进一步增加异丁醇产量的基因修饰，如过表达的线粒体苹果酶(maei，matsudamicrobialcellfactories(matsuda微生物细胞工厂)2013)，或线粒体丙酮酸载体(mpcs，parkappliedgeneticsandmolecularbiotechnology(帕克应用遗传学与分子生物技术)2016)；或敲除乙酰辅酶a合成(lpdi，parkappliedgeneticsandmolecularbiotechnology(帕克应用遗传学与分子生物技术)2016)或醛脱氢酶(ald6，parkappliedgeneticsandmolecularbiotechnology(帕克应用遗传学与分子生物技术)2016)。
此外，本例中使用的异丁醇通路(见图16)使用nadph依赖的kari(ilv3)(1630)，它只能恢复糖酵解(通过adh活性)消耗的nad+的一半。然而，设想其他提高异丁醇产量的方法，包括但不限于修改异丁醇途径以包括nadph依赖的kari，或者利用转氢酶，异丁醇的形成能够循环所有糖酵解所需的nad+(brinkmann-chenpnas，2013)。线粒体异丁醇通路也能显著增加异戊醇和2-甲基-1-丁醇(avalos等人，2013)的生成。因此，也测量了2-甲基-1-丁醇的生成。由于样本菌株的leu2营养缺陷标记(它阻碍了亮氨酸的生物合成，从而阻碍了异戊醇的产生)，预期不会产生异戊醇。预计，yez167-4会增加2-methyl-1-butanol产生(图18)，它也对发酵过程中的蓝色光脉冲敏感，在每隔10小时30分钟的蓝光照射下，最大产量达到433.0±69.2mg/l，与异丁醇的最大产量相同。
异丁醇生产菌株的规模化发酵和生长
为了测试是否有足够的蓝光可以通过更大容量的高细胞密度发酵来控制工程代谢，我们在2l发酵罐中测试了yez167-4能够长到高od600读值的能力。以yez167-4为对照，将其生长情况与yzy335进行比较，yzy335是一株构成异丁醇的菌株，其原生pdc1、pdc5、pdc6三个菌株均完好无损(使该菌株的生长和异丁醇生产不受光影响)。
为了测试在2l发酵罐中yez167-4的生长情况，使用单个菌落在光照下接种5mlsc-ura+2％葡萄糖培养基过夜。第二天早上，将培养基稀释在sc-ura+15％葡萄糖培养基中，在2升玻璃生物反应器中稀释至od6000.1，该反应器由3块蓝光面板包围，放置于反应器玻璃墙1厘米处。该培养基也被用搅拌棒搅拌并吹空气气泡。对照菌株yzy335在相同条件下培养。每12小时采集一次样本，测量细胞培养的od600。如图20所示，yez167-4(2220)能够达到与pdc+对照菌株yzy335(2210)相同的光密度(od600＝17)，而在野生型中略有延迟，估计是由于相对于ppdc1，yez167-4中驱动pdc1表达的pc120启动子相对较弱。
流加式发酵
小分子分析
采用agilent1260infinity(agilenttechnologies(安捷伦科技、美国加州圣克拉拉)高压液相色谱法(hplc)测定葡萄糖、乳酸、乙醇和异丁醇的浓度。样本离心去除细胞和其他固体垃圾，分析使用一个hpx-87h离子交换柱(bio-rad、美国加州里士满、)。柱子的流动相选择了5mm硫酸，柱温55℃，流速0.6毫升/分钟。用折射率检测器(rid)检测葡萄糖、乳酸、乙醇和异丁醇。使用各自标准溶液进行定量比较，计算测量各个峰面积以确定各物质浓度。
流式细胞仪测量
为验证孔板读数的结果，在optoexp系统采用流式细胞术。为了做到这一点，cen.pk-2c通过pyz12-b(一个空向量)、ez_ll36和ez_l350对pk-2c分别进行转换，得到yez140(cen.pk-2c与他的营养缺陷恢复型)、yez139(cen.pk-2c与optoexp驱动gfp)、yez186(cen.pk-2c与his::ptef1_gfp_tact1)。这些菌株在黑暗中在sc-his+2％葡萄糖培养基中过夜培养。这些培养基中的20ul被980ul的新鲜培养基稀释，放入两个24孔的培养板中。一个培养板放在0.4米深的蓝光面板下，另一个包裹锡箔纸，放在黑暗中。培养板在200rpm、30℃下震摇8个小时。然后将5ul培养物加入995ul磷酸盐缓冲盐溶液中稀释，用于流式细胞术。过夜后从三种不同的培养物中分离出样本，每组三个重复样本。使用bdlsrii流式细胞仪(bd生物科学，美国加州圣何塞市)，以488nm的激发波长和530nm的发射波长对gfp的表达进行定量。从20000个细胞中测定平均荧光值。数据分析使用version10分析软件(treestar，ashland，or，usa)。
附表1.使用的质粒
附表2.使用的酵母菌株
附表3.optoinvrt回路组分的示例
附表4.示例性回路的表现
图24显示了一种控制基因表达的通用方法，例如，酵母，目的是为了生产一个想要的，有价值的最终产品。第一步是提供一种经过改良的酵母菌(2610)。
一般来说，酵母细胞应该由多个基因组成，这些基因可以通过光的双向控制，其中一个基因在暴露在光下时从关闭变为打开(当光关闭时相反)，另一个基因在光下时从打开变为关闭(当光关闭时相反)。
接下来发酵酵母细胞，如果需要的话，通常使用适当的培养基筛选。发酵阶段(2620)的特征是光剂量的改变(2625)酵母以某种方式暴露，诸如通过改变峰值波长，强度，工作周期，或与一个或多个光源的距离。这样一来，一种化学物质(2628)的产量就超过了它在野生型菌株里的产量。
图25展示了一个更复杂的方法的示例。第一步仍然需要提供一种改良的酵母菌(2710)。然而，发酵阶段(2620)现在至少分为两个独立的阶段，一个是生长阶段(2720)，一个是生产阶段(2730)。
生长阶段(2720)的特征是控制光照，从而诱导生长必需基因，抑制有毒产物的基因(2725)。例如，在一些实施例中，我们诱导了pdc1和gal80，其中至少pdc1是酵母生长的必要基因，而gal4p激活基因在光照下由于gal80p对gal4p的抑制而受到抑制。
在一些实施例中，当从生长阶段切换到生产阶段(2732)时，生长液被更改或更新。生产阶段(2730)通常需要控制光线，从本质上逆转生长阶段:抑制生长必需的基因，诱导有毒产品的基因(2736)。这通常是通过停止辐照或改变峰值波长，使其落在诱导必需基因的波长范围之外来实现的。例如，蓝光可以被关掉，黄色或红外光可以被打开。
在优选实施例中，该方法还包括将化学物质的生产与生物传感器或蛋白质梯度系统耦合(2740)，该生物传感器或蛋白质梯度系统对化学物质的存在产生可视结果。由于各种原因，可以测量或检测这些可视结果，包括但不限于监测化学物质的生产、向控制器提供反馈或至少部分发酵过程的自动化。在优选实施例中，控制器自动或调整发酵阶段的光程或其他各种工艺参数，包括温度或搅拌速度，以进一步增加所需化学物质的过量生产。
光遗传学和代谢工程的结合并非没有挑战。通常与微生物发酵有关的高细胞密度可能会严重限制光的穿透或阻止对光的均匀反应。然而，公开的方法解决了这两个问题。饱和光输入只需要在培养密度不受限制的初始“生长阶段”应用。在“生产阶段”，光诱导回路的反向响应在黑暗中诱导同行代谢通路，这种代谢通路是均匀的，不受细胞密度的影响。此外，使用vp-el222这样的高光敏序列，快速激活光(<10秒)，激活状态的半衰期相对较长(29秒)，避免了对细胞持续光照的需要，在相对较高的细胞密度下，提供了有效的光刺激，没有高光毒性光的强烈。这一点可以通过yez167-4在2升反应器中的光依赖性生长得到证明，该反应器达到与野生型菌株控制相同的光密度，并通过光脉冲在补料分批发酵过程中产生异丁醇和2-甲基-1-丁醇的效果来证明。
公开的基因工程代谢通路的光基因调控系统为在支链乙醇生产中乙醇竞争的挑战提供了解决方案。公开的光控代谢阀提供了一种有效的替代方案，可用于基因删除与同行通路竞争的必要通路基因(如pdc1、pdc5和pdc6的联合缺失)。经优化，该体系可生产总支链醇至少10.5g/l(异丁醇8.2g/l，2-甲基-1-丁醇2.3g/l)。
因此，已经公开了用于代谢途径调节和诱导启动子级联的代谢酶的光激活基因转录的具体组成、系统和方法。然而，对于那些精通这门技术的人来说，很明显，除了已经描述过的那些之外，还有更多的修改是可能的，而这里无需背离这里的创造性概念。因此，从创新考虑，除了公开精神外，发明的标的物不受限制。此外，在解释报告时，所有术语都应以与上下文一致的尽可能广泛的方式进行解释。特别地，术语“包含”和“组成”应解释为以非排他性的方式引用元素、组件或步骤，表明所引用的元素、组件或步骤可能存在、使用或与其他未明确引用的元素、组件或步骤组合。
此外，本文中所列的参考文献以及所附材料也是应用程序的一部分，它们作为参考文献被完整地整合在一起，完整性就像本文中充分阐述的那样。