导读：mRNA是一种新型的疫苗技术，mRNA的制备、质量检测和活性评估手段在近三年获得了飞速发展。
01
mRNA关键元件的设计
研究人员描述了一种由脂质纳米颗粒（LNP）包封的mRNA疫苗，其mRNA序列包括5'非翻译区（5’UTR）、编码序列（5种抗原和1个报告基因）、3’UTR和多聚腺苷酸化（PolyA）尾。此外，他们在5’UTR的上游设计了一个腺嘌呤(A)核苷酸，以便于使用CleanCapAG帽类似物实现共转录加帽。
1.1UTR序列设计
5’UTR和3’UTR序列对于mRNA的稳定性和翻译至关重要。在mRNA疫苗的设计过程中，5’UTR和3’UTR序列通常来自目标物种体内高表达基因的UTR，以促进有效翻译，如α-珠蛋白基因；或者通过指数富集（SELEX）的方式来实现5’UTR的系统演化。
例如，BNT162b2直接选取了人alpha珠蛋白基因的5’UTR，同时针对Kozak序列进行了优化，具体为使用GCCACCAUG替换了ACCAUG。BNT162b2的3’UTR由两个片段组成，分别来自人类线粒体12SrRNA（mtRNR1）和人AES/TLE5基因。
而Moderna基于SELEX方法全新设计了mRNA-1273的5’UTR序列，序列中包括公认最优的Kozak序列GCCACCAUG。mRNA-1273采用了人源alpha珠蛋白的3’UTR。
不同的5’UTR序列可能适用于不同的编码序列、不同的物种、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可随时联系菌菌：13380332910。
1.2Poly(A)序列
Poly(A)尾巴同样促进mRNA的稳定性和翻译效率，poly(A)可以在DNA模板中编码或在体外转录（IVT）后添加。Poly(A)长度通常在120nt左右，可以是纯腺苷（A）序列或者分段式序列。
在该Protocol中，作者采用了分段式尾巴，包括一个30个A、10个非纯A序列（GCATATGACT），最后是70个A。
耀海内部研究数据显示，使用DNA模板添加polyA可以更加精确地控制mRNA的长度。经过工艺优化，我们目前能够将polyA尾控制在目标长度±5nt。
1.3编码序列（CDS）
在克隆到mRNA编码质粒之前，研究人员使用GENEWIZ生物信息学软件工具对抗原编码序列进行了密码子优化。
02
其他元件的设计
2.1启动子序列
体外转录（IVT）是一种基于模板的过程，RNA聚合酶（RNAP）通过识别模板序列中的噬菌体启动子序列后，启动RNA转录本的生成。
可选的RNA聚合酶包括T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶，与之对应的，模板序列需具备T7启动子和SP6启动子。该Protocol中使用了最为广泛使用的T7启动子。
2.2限制性酶切位点
为保证生成预期长度和序列的mRNA转录本，应考虑在质粒模板中设计独特的限制性内切酶位点，用于在mRNA编码序列的下游（即polyA/T下游）实现质粒DNA的线性化。
在这篇Protocol中，作者整合了一个IIS型限制性内切酶识别位点（BsPQI），该位点在polyA尾的3'末端进行切割。
IIS型限制酶是理想的mRNA质粒模板线性化酶，这类酶可以在识别位点的下游特定距离处切割DNA双链，也就是说IIS型限制酶对切割位点的序列没有要求，有利于保证mRNA序列的完整性。
参考文献
[1]KarekarN,ReidCahnA,Morla-FolchJ,SaffonA,WardRW,AnanthanarayananA,TeunissenAJP,BhardwajN,VabretN.ProtocolforthedevelopmentofmRNAlipidnanoparticlevaccinesandanalysisofimmunizationefficiencyinmice.STARProtoc.2024Jun21;5(2):103087.doi:10.1016/j.xpro.2024.103087.
[2]BrouzeA,KrawczykPS,DziembowskiA,MroczekS.Measuringthetail:Methodsforpoly(A)tailprofiling.WileyInterdiscipRevRNA.2023Jan;14(1):e1737.doi:10.1002/wrna.1737.