本发明涉及一种基因序列的改造方法，特别涉及一种基于密码子同义突变的基因序列改造方法，还涉及由该改造方法得到的基因序列及其在疫苗制备中的应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
核酸序列中，连续的3个核苷酸残基为一个密码子。标准的遗传密码是由64个密码子组成的，几乎所有的生物都使用同样的遗传密码。即使是非细胞结构的病毒，它们也是使用标准遗传密码，64种密码子及其编码的氨基酸如图1所示。
在64个密码子中，除了3个终止密码子(taa、tag、tga)以外，其余61个密码子代表20种氨基酸。除了甲硫氨酸、色氨酸各有1个密码子外，其它18种氨基酸均有2个或多个密码子。对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子。
同义密码子的几个密码子中，第一、二位碱基大多是相同的，多数是第三位碱基不同。例如：acu、acc、aca、acg都是苏氨酸的密码子，ugu、ugc、uga、ugg都是缬氨酸的密码子。这样如果密码子第三位碱基出现了点突变，并不影响所翻译出的氨基酸种类。同义密码子中核苷酸可以是不同的，但编码的氨基酸是相同的，这称为密码子的简并性。
密码子简并性具有重要的生物学意义，它可以减少有害突变。若每种氨基酸只有一个密码子，61个密码子中只有20个是有意义的，各对应于一种氨基酸。剩下41个密码子都无氨基酸所对应，将导致肽链合成终止。由基因突变而引起肽链合成终止的概率也会大大增加。简并性使得那些即使密码子中碱基被改变，仍然能编码原来氨基酸的可能性大为提高。
三联体遗传密码中，某个碱基被另外一个碱基替代或者变异后，改变了密码子，但由于密码子简并性，在原来的某种氨基酸的位置仍译成同一种氨基酸，即氨基酸的序列未发生变化，此现象称同义突变。
目前，预防传染病主要依靠免疫接种疫苗。目前市场上使用的疫苗，根据其制备工艺的不同，可以大致分为三类：灭活疫苗、减毒活疫苗(又称弱毒疫苗)、基因工程疫苗。
灭活疫苗，即人们在获得病毒以后，通过对其进行一定的处理，使病毒完全丧失活性，从而得到被杀死的病原微生物，进而制成灭活疫苗。它其实就是一种被杀死的病毒，将其注射入人体，既不会使人染病，又可以促使人体产生抗体，抵御病毒的入侵。如百日咳疫苗等。
基因工程疫苗是使用dna重组技术，把天然的或人工合成的dna定向插入到载体中，再导入细菌、酵母或哺乳动物细胞，表达出该dna编码的蛋白，经蛋白纯化后制得的疫苗。如把编码乙型肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因组，经表达和纯化后，制成重组乙型肝炎疫苗。
甲型肝炎减毒活疫苗也存在这种现象。将甲型肝炎减毒活疫苗(hz株)在猴子体内做连续5次传代试验，大剂量注射疫苗后，发现经2次传代病毒依旧保持减毒性能，但3～4代时有毒力回升迹象，提示存在毒力返强的风险(董德祥等，2013)。
乙型脑炎减毒活疫苗，经国家批准为正式产品已有30年。在疫苗质量控制的各项检测指标中，疫苗病毒是否存在毒力返强的检测尤为重要。在《中国药典》(第三部，2010版)对乙型脑炎减毒活疫苗的毒力返强，规定了严格的检测方法，即将疫苗接种小鼠脑内，待小鼠发病后，取脑组织制成10％悬液，用于测定病毒含量，低于《中国药典》中的规定值，即判为乙型脑炎活疫苗无毒力返强现象(杨邦玲等，2014)。
在使用减毒活疫苗过程中，安全性是最主要的问题。虽然毒力返强不是经常发生的，但这种风险是一直存在的。它要求人们在疫苗接种时，不断保持警惕。免疫疫苗在体内返强成强毒株，那么注射疫苗后就可能会发病。在动物疫苗中，也有毒力返强的问题，甚至比人用疫苗的情况更为堪忧。
因此，为保证疫苗的安全性，有必要在疫苗设计中对病毒进行改造，降低返强的几率。对疫苗株的基因进行改造，提高其基因序列的保真性，减少疫苗病毒在体内返强的几率。即便发生变异，也会较早地终止病毒蛋白的合成，使之不能有效地组装和产出下一代病毒，从而达到降低疫苗株返强致病的风险。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种基于密码子同义突变的基因序列改造方法，采用该方法对密码子进行改造，可以提高物种或病毒的遗传稳定性。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
有6个三联密码子编码亮氨酸(leu，l)，它们分别是tta、ttg、ctt、ctc、cta和ctg。以tta为例，在基因复制过程中，如果第二位的t变异成a，那么就会形成taa(终止密码子)；如果第二位的t变异成g，就会形成tga(终止密码子)，从而导致肽链合成提前终止。ttg中第二位的t变异成a，会形成tag(终止密码子)，也会导致肽链合成提前终止。从上面的例子，我们可以看出，tta和ttg只需变异一个碱基，就可以形成终止密码子。但对于ctt、ctc、cta和ctg而言，它们也是亮氨酸的密码子，但是它们至少要同时变异两个碱基，才能形成终止密码子。如果把ctt、ctc、cta和ctg，经过同义突变，进行基因序列改造，改造成tta或ttg，这样仅需变异一个碱基就可以形成终止密码子，由基因变异而引起肽链合成终止的概率也会大大增加，从而可以大大提高物种或病毒的遗传稳定性。
与之类似的是，编码丝氨酸(ser，s)的也有6个三联密码子，它们分别是tca、tcg、tct、tcc、agt和agc。其中tca和tcg，只需变异一个碱基，就可以形成终止密码子。剩下的四种密码子，tct、tcc、agt和agc，如果经过同义突变改造成tca或tcg，也可以仅变异一个碱基，就可以形成终止密码子。
基于上述，本发明提出了一种基于密码子同义突变的基因序列改造方法，即对基因序列中的全部或部分同义密码子进行碱基突变，包括：将序列中的全部或部分同义密码子改造成tta、ttg、tca或tcg。
其中，优选的，对基因序列中的同义密码子进行碱基突变，包括：将全部或部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子ctt同义突变成tta或ttg，将全部或部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子ctc同义突变成tta或ttg，将全部或部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子cta同义突变成tta或ttg，将全部或部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子ctg同义突变成tta或ttg。
其中，优选的，对基因序列中的同义密码子进行碱基突变，包括：将全部或部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子tct同义突变成tca或tcg，将全部或部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子tcc同义突变成tca或tcg，将全部或部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子agt同义突变成tca或tcg，将全部或部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子agc同义突变成tca或tcg。
其中，优选的，所述的改造方法，包括以下步骤：
(1)选择一个要进行同义突变的基因序列，将其编码基因的序列，翻译成氨基酸序列，使密码子与其编码氨基酸一一对应；
(2)从起始端开始，逐个密码子进行观察，发现其中的亮氨酸(leu，l)和丝氨酸(ser，s)及其对应的密码子；
(3)依据上述的同义突变方法，将该基因序列中的全部或部分亮氨酸(leu，l)和丝氨酸(ser，s)对应的密码子进行同义突变；
(4)将改造后的dna或rna序列翻译成氨基酸序列，并与原序列翻译后的氨基酸序列进行比对，确保没有导致氨基酸的改变；
(5)同义突变可以在原基因片段上进行定点突变，或将改造后的dna序列进行人工合成。
其中，优选的，所述的基因序列来自双链或单链的dna或rna病毒。
进一步的，本发明还提出了一种改造后的基因序列，所述的基因序列是按照以上任一项所述的方法改造后得到的。
其中，优选的，所述的基因序列来自双链或单链的dna或rna病毒，更优选的，所述的病毒为感染人类、动物或植物的双链或单链的dna或rna病毒。
其中，优选的，所述的基因序列为双链或单链的dna或rna病毒的完整基因组或病毒基因组的一部分。
更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的改造后的基因序列在制备减毒活疫苗中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种基于密码子同义突变的基因序列改造方法，该方法对同义密码子进行碱基突变，改造成tta、ttg、tca或tcg。这样在基因复制过程中，仅需变异一个碱基就可以形成终止密码子(taa、tga、tag)，由基因变异而引起肽链合成终止的概率也会大大增加，从而可以大大提高物种或病毒的遗传稳定性。在减毒活疫苗的使用过程中，安全性是最主要的问题。减毒活疫苗的毒力返强的风险是一直存在的。在减毒活疫苗的设计中，对病毒基因的密码子进行改造，可以提高疫苗毒序列的保真性，减少疫苗毒在体内毒力返强的几率，从而提高减毒活疫苗的安全性。
附图说明
图1为64种密码子及其编码的氨基酸；
图2为原始的、未经改造的蛋白及其密码子序列；
图中，标记的氨基酸为需同义突变的氨基酸，下划线或波浪线为需突变的密码子；
图3为密码子同义突变后的蛋白及其密码子的序列；
图中，标记的氨基酸为需同义突变的氨基酸，密码子中标注的碱基为突变后的碱基。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的一种急性传染病。该疾病传播广泛，多见于儿童，故又名小儿麻痹症。病毒主要侵犯中枢神经系统，损害脊髓前角运动神经细胞，导致肢体麻痹、瘫痪。目前尚无治疗脊髓灰质炎的有效药物。
该病主要靠使用疫苗进行预防控制。目前有减毒活疫苗(口服糖丸疫苗，直接含服或以凉开水溶化后服用；口服液体疫苗，直接滴于婴儿口中或滴于饼干上服下)，也有灭活疫苗(针剂，注射给婴幼儿)。口服糖丸：婴儿一般于第2、4、6月龄时各服一丸；1.5～2岁、4岁和7岁时再各服1丸。口服液体疫苗：婴儿一般于第2个月开始，每次2滴，间隔4～6周，共免疫3次；4岁或入学前再免疫1次。针剂疫苗：婴儿在2、3、4月时分别打前3针，4岁时打第4针。
自50年代中期以来，一直采用salk灭活疫苗及sabin减毒活疫苗，免疫效果良好，极大地降低了脊髓灰质炎的发病率。salk灭活疫苗由三型病毒经甲醛灭活后混合制成，肌肉注射，可诱导机体产生中和抗体。其优点是便于保存及运输，无减毒株返强现象，且副作用较少。sabin减毒活疫苗是用减毒变异株制成，采用口服，方法简便，对野毒株有消灭作用，从而切断其在人群中的传播，但减毒活疫苗有恢复毒力的危险，在免疫缺陷人体内易致麻痹，发生与小儿麻痹症相似的症状，如肢体瘫痪。近年来，有多起报道，免疫脊髓灰质炎减毒活疫苗后，小儿出现麻痹症状。因此，该类减毒活疫苗在毒力返强方面，有深入研究的空间。
本实施例以我国2014年的一株脊髓灰质炎病毒的衣壳蛋白序列为例，进行了密码子同义突变。具体方法如下：
(1)对我国2014年的一株脊髓灰质炎病毒的衣壳蛋白序列进行同义突变，将其编码基因的序列，翻译成氨基酸序列，使密码子与其编码氨基酸一一对应，密码子与其编码氨基酸序列如图2所示；
(3)将该基因中亮氨酸(leu，l)和丝氨酸(ser，s)对应的密码子进行同义突变；
将部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子ctt同义突变成tta或ttg，将部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子ctc同义突变成tta或ttg，将部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子cta同义突变成tta或ttg，将部分编码亮氨酸(leu，l)的密码子ctg同义突变成tta或ttg；
将部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子tct同义突变成tca或tcg，将部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子tcc同义突变成tca或tcg，将部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子agt同义突变成tca或tcg，将部分编码丝氨酸(ser，s)的密码子agc同义突变成tca或tcg；
(4)将改造后的dna序列翻译成氨基酸序列，并与原序列翻译后的氨基酸序列进行比对，确保没有导致氨基酸的改变，改造后的密码子与其编码氨基酸序列如图3所示；
同义突变后，仅需变异一个碱基就可以形成终止密码子(taa、tga、tag)，由基因变异而引起肽链合成终止的概率也会大大增加，可以降低病毒在体内复制后产生子代病毒的复杂性，有利于维持病毒原有的序列，从而降低减毒活疫苗毒力返强的风险。