ConstructionofafusiongeneexpressionvectorcontaininghumangranulysinandgreenfluorescentproteingeneanditsexpressioninmurinemacrophageRAW264.7
【Abstract】AIM:ToclonethehumangranulysinfromactivatedcytotoxicTlymphocytes(CTL)，constructaneukaryoticexpressionvectorcontainingthefusiongeneofgranulysin(GLS)andgreenfluorescentproteinreporterandobserveitsexpressioninmurinemacrophageRAW264.7strain.METHODS:ThecodingsequenceofthegranulysinwasamplifiedfromthetotalRNAofhumanCTLactivatedbyallogenicantigenafterreversetranscriptionbyNestedPCR，insertedintopEGFPC1plasmidandthentransfectedRAW264.7cells.TheexpressionofthefusionproteinandGLSwasdetectedbyfluorescencemicroscopeandRTPCR.Theimmunoreactiveoftheproductwasconfirmedbyimmunocytochemistrymethod.RESULTS:ThewholecodingsequenceofGLSwassuccessfullyamplifiedasexpected.Theaccurateopenreadingframe(ORF)ofthefusionproteinreconwasconfirmedbyPCR，endonucleasedigestionandsequencing.Thefusionproteinthatwasimmunoreactivewassuccessfullyexpressedinthetargetedcells.CONCLUSION:HumangranulysincanbeexpressedinmurinemacrophageRAW264.7straininafusionproteinpatternandretainitsimmunoreactivity.
【Keywords】granulysin；greenfluorescentprotein；macrophage；nestedPCR；immunoreactivity
【摘要】目的:克隆人天然颗粒溶素(granulysin，GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体，观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法:提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA，经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列，插入pEGFPC1质粒，鉴定正确后转染RAW264.7细胞，采用荧光显微镜及RTPCR法检测融合蛋白及GLS的表达，采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性.结果:成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA，经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达，表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达，其表达产物具有良好的免疫反应性.
【关键词】颗粒溶素；绿色荧光蛋白；巨噬细胞；套式PCR；免疫反应性
0引言
颗粒溶素（granulysin，GLS）对细菌、真菌、原虫、肿瘤细胞等具有很强的广谱杀伤活性，因此对其免疫杀伤作用机制的研究对于开发天然、低毒、高效的新一代杀菌制剂以及研究人体的天然免疫过程具有重要意义.为此我们直接从激活后的人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA中扩增出GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白报告基因融合的真核表达载体，转染到鼠巨噬细胞株RAW264.7中进行了表达.
1材料和方法
1.1材料
E.coliTop10，Clontech公司质粒载体pEGFPC1为本室保存;小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药理学教研室.人外周血单个核细胞(PBMC)分离液及植物血凝素（PHA）购自第三军医大学试剂服务中心；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶BsPEI，BamHI购自NEB公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA），高保真ProbestTaq酶、T4DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarkerDL2000等均购自大连宝生物公司；GenePorter2真核转染试剂为美国GTS公司产品；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德；RPMI1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.
1.2方法
根据GeneBank中人GLS的cDNA序列，共设计合成了4条引物：PG1:5′GCGCTAGCGTATCTGTGGTAAACCCAGTG3′;PG2:5′GCGGTACCCTTGCTTGACACTTTATTCTCG3′;PGE1:5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGAACCCAGGTCTGGTCTTCTC3′;PGE2:5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCAGAGGGGACCTGTAGAAG3′;全部由大连宝生物公司合成.由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在PGE1引物设计中去除了GLS的分泌肽编码序列.首先用PHA活化外周血单个核细胞，然后用同种异型抗原诱导、刺激其中的CTL细胞和NK细胞活化，从而启动GLS基因的转录.方法是，无菌采集2份健康人静脉血各6mL，肝素抗凝.1500r/min离心10min，分别吸出上层血浆及白细胞层，然后用PBS缓冲液1∶1稀释白细胞，再按PBMC分离液说明，常规分离外周血单个核细胞.取其中一份PBMC样本洗涤2次后以含100mL/L自体血浆的完全RPMI1640培养液重悬，调节细胞浓度为2×106/L，加入PHA使其终浓度为200mg/L，置37℃，50mL/LCO2培养箱中，培养24h后加入另一份样本（此样本PBMC经灭活处理后以含100mL/L灭活小牛血清的完全RPMI1640培养液重悬）共同培养48h后收获细胞.
1.2.1GLScDNA的扩增、克隆与测序抽提细胞总RNA，逆转录后调适相应的缓冲液，用高保真ProbestTaq酶取代试剂盒自带的HSTaq，用引物PG1，PG2进行PCR扩增25个循环，获得包含目标序列在内的GLScDNA全长片段.然后取产物2μL为模板，以引物PGE1与PGE2进行套式扩增，反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸8min.10g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测.纯化后以BsPEI，BamHI双酶切、回收，与同样处理的pEGFPC1载体大片段在16℃连接1h，转化大肠杆菌TOP10，涂布于含30mg/L卡那霉素LB平板上培养，次日挑取卡那霉素抗性单菌落，进行PCR鉴定，阳性克隆置3mL含30mg/L卡那霉素LB培养基中振摇增菌，小量抽提质粒，用BsPEI与BamHI进行双酶切鉴定，送上海博亚公司测序.
1.2.2细胞转染及表达产物的检测RAW264.7细胞在含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中，以24孔板置37℃，50mL/LCO2培养，常规方法制作RAW264.7细胞爬片，至80%~90%汇片后按转染试剂盒说明进行转染，以pEGFPC1空质粒转染的RAW264.7细胞作为对照.转染72h后分别收集实验孔及对照孔的细胞:①取出爬片进行荧光检测，观察融合蛋白的表达及分布；②以RTPCR法对GLS基因进行转录水平上的检测：抽提细胞总RNA逆转录，以PGE1，PGE2为引物，按上述条件进行扩增；③GLS表达产物的免疫学活性检测：取出爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法是：PBS洗，40g/L多聚甲醛固定，PBS洗，30mL/LH2O2灭活内源性过氧化物酶10min；PBS洗，滴加血清封闭液，室温20min；滴加1∶300稀释的山羊抗人GLS抗体，4℃过夜；PBS洗，滴加生物素化的兔抗山羊抗体，室温20min；PBS洗，滴加链酶亲和素生物素酶复合物（SABC）液，室温20min；PBS洗，DAB避光显色20min；苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片，观察.
2结果
2.1GLScDNA的套式PCR扩增两次PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，分别在433，754bp处见到一特异性目的片段，与理论预测的GLS全长cDNA序列大小相符(Fig1).
2.2重组质粒的PCR及酶切鉴定插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后，电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带.分别抽提质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明，酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段(Fig2).
2.3GLS转录产物的RTPCR检测转染72h后抽提细胞总RNA以原引物作RTPCR重新扩增出目的片段为433bp，与理论预测值完全相符(Fig3).
2.4GLS与EGFP融合蛋白的荧光检测转染72h后融合蛋白表达产物主要定位于细胞质(Fig4).
2.5GLS表达产物的免疫细胞化学以山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗，DAB显色可见GLS呈强阳性表达(Fig5).
3讨论
参考文献
［1］骆旭东，朱道银，陈全，等.结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗免疫原性的比较［J］.第四军医大学学报，2003;24（17）:1630-1631.
LuoXD，ZhuDY，ChenQ，etal.ComparisonofimmunogenicityofDNAvaccineencodingMycobacteriumtuberculosisAg85BandMPT64［J］.JFourthMilMedUniv，2003;24（17）:1630-1631.
［2］江山，朱道银，蒋英，等.结核分枝杆菌Ag85BAg85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达［J］.第四军医大学学报，2003;24（21）:1973-1975.
JiangS，ZhuDY，JiangY，etal.ConstructionoffusedeukaryoticexpressionvectorofMycobacteriumtuberculosisAg85BandAg85Aantigensanditsexpression［J］.JFourthMilMedUniv，2003;24（21）:1973-1975.
［3］OgawaK，TakamoriY，SuzukiK，etal.Granulysininhumanserumasamarkerofcellmediatedimmunity［J］.EurJImmunol，2003;33(7):1925-1933.
［4］KidaY，ShimizuT，KuwanoK.Opposingrolesofactivatorprotein1andCCAAT/enhancerbindingproteinbetaintheregulationofinduciblegranulysingeneexpressioninahumanmonocyticcellline，THP1［J］.Immunology，2002；107(4):507-516.
［5］HansonDA，KasparAA，PoulainFR，etal.Biosynthesisofgranulysin，anovelcytolyticmolecule［J］.MolImmunol，1999；36(7):413-422.
教学内容：义务教育课程标准北师大版数学第四册第26－28页。
教学目标：体会生活中有大数，激发学习数学的兴趣，感受学数的必要。认识新的计数单位“千”、“万”，并了解千与万之间的联系。对大数有具体的感受，发展学生的数感。
教学准备：调查生活中有哪些大数；准备10个正方体模型。
教学流程：
一、激趣引入，体会大数。考一考：同学们，你们知道我们中国最长的河流是哪一条吗学生回答：长江!对，那长江有多长呢(大约6211公里)长江很长。那你们知道我们的头发有多少根吗(大约10万)
设计意图：课一开始以“长江有多长”和“人的头发有多少根”，抓住学生的注意力；引出智慧老人带来的新知识，及时比较图中的大数，初步体会大数；再让学生交流找到的生活中的大数，体会到数学与生活的联系，感受学数的必要性。
二、探索新知，感悟大数。1、建立表象，数一数。(1)出示—个大正方体。估计一下：它是由多少个小正方体组成的(学生估计)(2)你能想出什么办法准确算出一共有多少个小正方体(3)小组商量后合作数小正方体。(4)全班交流，课件演示，揭示：10个一百是一千(有出现错的，全班学生再数数)。(5)课件出示10个大正方体，有几个小正方体，你想怎么数个别说一说，全班数数。揭示：10个一千是一万。记一记。2、抽象模型，感受千万。(1)堆书。出示1本一百页，堆出10本一千页，把一千页和一百页书的厚度比较一下，再想像一下一万页(教师比划)。(2)一万人有多少上星期我们去电影院看电影，电影院大吗要5个那么大的电影院才能坐下一万人。设计意图：让学生估计“一共有多少个小正方体”，初步激发学生的估计意识；再让学生进行合作数小正方体，帮助学生建立起一千个小正方体的模型，让学生在活动中发展对数的感知，培养学生的数感，同时认识新的计数单位“千”和“万”；再通过堆书活动和10000人去电影院看电影的情境，让学生感受一千和一万，进一步体会大数。
三、体验数住，知识拓展。1、智慧老人想考大家，出示数位表。学生填一填，记一记。2、找一找计数单位之间的关系。3、对口令。一个同学说出一个大数，其他人说出更大的数，全班一起玩。
设计意图：以智慧老人引入数位表的填写、识记，让学生了解计数单位之间的关系。同时及时进行活动，进一步感受大数。
四、反思小结，生活延伸。1、这节课我们学习了什么2、生活中大数的应用也很多，布置一个小任务：调查一下，1000元能买哪些东西记录在数学日记中。
当然，本节课也存在着不足：1、当学生数成600时，虽然及时纠正，却忘了让学生在和电脑一起数完后，再数一数，未能较好地让学生进行再思考。2、教学的评价还不够。如当说到如果大正方体的一个红色的小正方体不算的话，有999个小正方体时，这一回答比较精彩，教师没有及时地进行有针对性的评价、鼓励。3、课堂中学生处于比较兴奋的状态，回答问题几次出现冲口而出答错的情况。
10000这样的较大数在生活中普遍存在，学会认、读、写较大数是学生必须掌握的一项技能，但对二年级的学生来说，有一定难度，通过实际教学和反思，我认为本课的教学要注意以下几个方面。
一、读写结合，正向迁移
在教学“万以内数的认识”之前，学生已经学会一个一个、一十一十、一百一百地数数，认识了“个、十、百、千”的数位名称、顺序，也知道其相邻计数单位之间的进率。因此，在教学这部分内容时，可充分利用学生已有的知识经验，用旧知识同化新知识，在正确理解教材编写意图的前提下，读写结合，实现知识的“正向迁移”。
教材中的情境图给出南京长江大桥公路桥长4589米，铁路桥长6772米，让学生读一读，说说是怎么读的。这时老师因势利导提出：“请你在计数器上拨出4589，说说是怎么拨的。”
学生回答后，师生一起总结出：读数的时候要从高位读起，千位上是4就读四千，百位上是5就读五百，十位上是8就读八十，个位上是9就读九。接着，老师提问：“这个数是怎样组成的？”学生对照计数器理解了4589是由4个千、5个百、8个十和9个一组成的。这时，抓住时机让学生试着写一写这个数，指名学生板演，并说明：从高位写起，千位上写4，百位上写5，十位上写8，个位上写9。
之后，及时安排巩固练习，如老师在计数器上拨一个数，学生把这个数的读法、写法写在纸上，写完后说说它的组成，同桌互相交流、订正。
二、逐步抽象，突破难点
让学生经历从“具体事物（小立方体）――半具体半抽象的事物（计数器）――抽象出数”这个逐步提升的过程，有效突破了本课的重难点――认识新的计数单位“万”。
例4给出一些小立方体，先让学生初步估计一下大概有多少，教师再利用课件带着学生数小立方体验证估计数。先是一个一个地数，一十一十地数，一百一百地数，然后问学生，像4589这样大的数，想一想还可以怎样来数？（学生意识到可以一千一千地数。）
教师用计数器演示，让学生边拨珠边数数。先拨出一千，顺序数到九千时，问学生：“九千后再添一个千是多少？怎么拨？”学生有了满十进一的经验，就会类推出数到九千时，再加一千的拨珠方法。计数器的演示，有利于学生理解“10个一千是一万，一万是由10个一千组成”，加深对新计数单位“万”的认识，比较形象直观地建立起万位概念。
为了让学生进一步掌握数位及其顺序，教师可以这样提问：最大的四位数是几？（9999）数中每个“9”所表示的意义相同吗？然后追问：如果这个数再加上1是几？学生回答后，让他们在计数器上拨珠，通过连续进位的操作，充分感受相邻计数单位之间的关系。在复习“10个一是十，10个十是一百，10个一百是一千”旧知的基础上，巩固“10个一千是一万，一万是由10个一千组成”的新知。
例5可以根据“提示语”作为读、写、计数器拨珠的综合练习让学生独立完成，然后全班订正。
用问题“说说我们学过的数位有哪些？你能按顺序给它们排一排吗？”指导学生补充完成数位顺序表后，让学生在数位表上用自制数字卡片摆出老师或同学说的数，进行巩固练习。
三、适当拓展，培养数感
《数学课程标准（实验稿）》明确指出：“数感主要表现在：理解数的意义；能用多种方法来表示数；能在具体的情境中把握数的相对大小关系；能用数来表达和交流信息；能为解决问题而选择适当的算法；能估计运算的结果，并对结果的合理性做出解释。”万以内数的认识是学生数概念的又一次扩充。但由于10000这个数较大，学生很难结合具体的量获得直观感受。因此，教师在教学中要有意识地补充一些学习素材，引导学生从实际生活经验中找“大数”，通过具体的感知和体验，帮助学生进一步理解数的意义，建立数感。如，用“1万有多少”激发学生的学习兴趣。还可以通过课件演示、观察实物等形式为学生提供丰富的学习素材。例如：
A郾数大米。让学生课前在家里数好一千颗大米（带来），十个同学一组，把大米合在一起看看一万颗大米有多少。
B郾我们学校有多少人？（1147）一万人大约有多少？（大约9个我们学校的人数。）回忆学校升旗仪式时全校学生在操场集队时的情形，想象9个（这样的）学校的学生数，体验“一万”的大小。
C郾国庆大阅兵中，一个方阵的人数是1000人，一万人有多少个方阵？（10个方阵）
D郾在二十八届雅典奥运会上，我国女子长跑运动员邢慧娜获得女子10000米冠军。你知道她围着体育场的跑道（400米）跑了多少圈吗？（25圈。）
F郾一张纸非常薄，10张纸叠起来大约厚1毫米。一万张纸叠起来有多厚呢？（1米。）
生活中这样的例子很多，教师可以根据学生的实际情况适时补充学习素材（辅之以课件演示、实物等），使学生真正体会到身边处处有数学，发展学生的数感。
2教学方法和手段的改革
3合理的课程体系
关键词：数学；一年级；计算
《数学课程标准（2011年版）》要求把培养计算能力作为小学数学教学的一项重要任务。可见，在整个小学数学教学阶段，低年级计算教学的基础性和重要性不言而喻。因为学生只有掌握好低年级计算的算理算法，才能运用它们进行知识的迁移，触类旁通，是为后续计算学习奠定下坚实的基础。
一、重视加减法含义的理解
首先，在情境中理解加减法的含义。加法表示把几部分合起来，减法表示从一个数中去掉一部分，求另一部分。减法含义的情境图是加法情境图的继续，因此可以在加法含义教学的基础上继续进行。如：在教学加法含义时利用课件动态演示3个红气球与1个蓝气球合并在一起的过程，使学生明确：把气球合并在一起，求一共有多少个气球用加法计算；而减法含义的理解可以借助加法含义的情境图：课件动态演示合并在一起的那4个气球里，飞走了1个气球，还剩几个气球的过程，使学生明确：求还剩几个气球，就是从4里面去掉1，用减法计算。通过课件演示全过程，学生在对比中加强了对加减法含义的理解。
其次，设计摆一摆、演一演、画一画、说一说等多种学习活动，在活动中强化对加减法含义的理解。如：让学生摆一摆、说一说：2块橡皮擦和1块橡皮擦合并在一起，求一共有几块橡皮擦用加法计算，算式是2+1=3。
接着，让学生感受加减法算式在生活中的应用。通过让学生举例说一说加减法算式可以表示生活中的哪些事，感受数学与生活的紧密联系。让学生在充分观察的基础上说一说算式表示的含义，让学生的感受更真实、更直观、更深刻。
再次，鼓励学生用自己的方式表示加减法算式的含义。如：在表示算式2+1=3的含义时，学生有的用自己的手指表示，有的用画图形的方式表示等等，让学生在作品交流中，加深对加减法含义的理解与认识。
最后，让学生感受加减法之间的关系，进一步认识两个加法算式和相应的两个减法算式之间的关系，使学生更好地掌握加减法。如：在教学8的加减法时出现算式5+3=8、3+5=8、8-5=3、8-3=5，可以先引导学生横看、竖看，发现其中的规律，直观感知加、减法之间的关系。然后通过讨论：“在加法算式中整体在哪儿？两个部分在哪儿？两个部分在哪儿？”还可以提出“看到3+5=8你还能想到哪些算式？”等问题，使学生联想出其他3个算式，从而帮助学生逐步提高计算能力。
二、注重算法的理解过程
如：在9加几的教学中呈现的实物图，为学生提供了实物操作，接着在算式下面标注出口算过程图，组织学生进行表象操作，让学生在头脑中重现分一分、摆一摆的过程，并用数学语言表征出来。这是学生从具体形象思维向抽象逻辑思维过渡的桥梁。这是在充分理解算理的基础上，学生进行抽象的符号操作，直接说出计算的结果。如：9+4，学生口述思考过程：把9凑成10还需要1，从4里拿走1给9，4还剩3，10加3等于13。当学生充分理解算理后，可以让学生简缩思维过程，如9+4，想10，13。
三、计算练习注重丰富性、坡度性和趣味性相结合
20以内的加减计算是本册教材的重点。能熟练地口算20以内的加减法是学生需要练好的基本功之一。为了避免学生在计算练习中感到枯燥，因此计算练习在内容上要体现丰富性，在形式上要体现趣味性，同时计算练习的内容和形式要随着学生能力的提升而变化，即体现坡度性。
除了练习内容的丰富，教师还应不断变换练习形式，注意从直观到抽象、由易到难，逐步提高要求。丰富多彩的练习形式激发了学生的兴趣，使学生能在情趣盎然的气氛中计算，在“玩儿”的过程中不断地加快自己的计算速度，从而提高学生的计算能力。如：设计有竞赛性质的计算游戏：爬山比赛、射击比赛、投篮比赛、数学转轮等形式。另外，学生不仅能视算，还可以进行听算练习，帮助学生逐步加快计算的速度，以达到对学生计算的要求。
四、对所学计算进行简单的梳理
本册教材所涉及的计算问题不论是数的范围，还是计算方法，都存在一定的差异。教材采用“分类”加”举例“的方式对所学习的计算进行整理。学生在正确计算的基础上，应能将算式进行分类，并按要求举出每一类的例子，形成对所学计算的整体认识。在此基础上，学生能结合具体算式，对计算方法进行回顾。
教师把上面的算式以算式卡片的形式贴在黑板上，首先让学生观察运算符号，挑出不同的2道题，使学生明确：我们学习的计算有加法，也有减法。接着，比较8+5和13+2这两道题在计算时有什么不同，使学生进一步认识加法有进位加法和不进位加法。再让学生指出卡片上的加法题中哪些是进位加法、哪些是不进位加法。最后，让学生举例分别说一个减法算式、一个不进位加法算式和一个进位加法算式。对于每一个计算的问题，学生应能根据已学知识准确判断出怎样计算，并选择自己喜欢的方法进行计算。
同时，可以通过加法算式表、减法算式表和进位加法表对所学习的计算进行整理，对加法表和减法表的整理要全面而有序。教师要注意引导学生进行探索和发现，并让他们切实经历这种探索和发现的过程。
如：进位加法表的整理：让学生根据9+1=10，说出9+几的其他进位加法算式，确认其他的进位加法算式都写出后，让学生按照一定的顺序排列算式。教师注意引导学生按竖行找规律，再按横行找规律，最后从全表找规律，找出哪些是大数加小数的算式、哪些是小数加大数的算式，并说说分别可以用什么方法计算，同时感悟得数不变的情况下，两个加数的变化规律。
五、自选算法，不必统一。
不同算法是不同思维发展水平的体现。在学生知道有多种方法可以得到计算结果后，可以让学生自主选择自己喜欢的方法来进行计算，不必强求一致。在计算时，有多种不同的计算方法，可以根据题目的具体情况，选择自己喜欢或掌握得比较好的方法进行计算。
在多种计算方法中，10以内的计算主要是采用“接着数”和“想数的组成”两种方法。随着教学的进行可以慢慢引导学生按数的组成进行计算，注意逐步提高对学生计算的要求，让学生从看图计算逐步过渡到想数的组成进行计算。因此，在练习中要加强学生用组成进行计算的训练，引导学生能用数的组成较快地算出得数。在20以内进位加法教学中，“凑十法”是学生新接触的一种方法，教材在算法多样化的基础上，突出了“凑十”的计算方法。“凑十法”包括“拆小数，凑大数”和“拆大数，凑小数”两种。如：在“9加几”部分呈现“接着数”“凑十法”，鼓励学生说说自己口算的方法；在计算“8+9”时，有“拆小数，凑大数”“拆大数，凑小数”和“交换加数的位置”的方法，允许学生用自己喜欢的方法进行计算，尊重学生的自主选择。
总之，计算教学是一个长期而复杂的教学过程，要提高学生的计算能力不是一朝一夕的事，教师应在认真学习数学课程标准，深入解读教材和做好学情分析的基础上，把课改中的新理念运用到自己的计算教学中，才能不断改进、完善计算教学。
参考文献：
[1]王惠.在小学数学教学中培养学生的创新意识.[J].教育论坛.2011（19）：68