摘要：目前，批准在人类和动物物种上使用的口服疫苗数量有限，开发有效安全的口服疫苗对鱼类免疫学家一直是一个挑战。口服疫苗效果不佳的重要原因是由于恶劣的胃环境对抗原的破坏，以及肠道环境的高耐受性和疫苗设计方法的不足。在本文中，我们讨论了目前大规模养殖鱼类口服疫苗的开发方法；借鉴人类和兽医疫苗的开发经验，从鱼类粘膜免疫学和新分子生物学的最新进展的角度，提出了鱼类口服疫苗的设计方法；并讨论了用斑马鱼作为预筛选动物模型的优点和缺点，旨在加快养殖鱼类疫苗的设计和验证。
1、引言
目前，用于养殖鱼类的疫苗绝大多数是针对细菌病原体，只有少数是针对病毒的。目前市售疫苗的给药途径是口服（通过混饲）、浸泡、腹腔注射（ip）或肌肉注射（im）。虽然注射接种疫苗对鱼的保护最有效，但操作难度较大。腹腔注射通常用于给予水包油型注射疫苗，而肌肉注射最常用于给予DNA质粒。水包油型注射疫苗会产生局部副作用，包括组织炎症、组织粘连或组织坏死。鱼太小或不能注射接种疫苗的，可通过口服或浸泡接种疫苗，但这些方法通常效果不佳、保护周期短。目前，也有开发出浸泡、口服和注射组合使用的疫苗接种方法来确保整个周期都能受到疫苗的保护。
口服疫苗免疫还存在诱导耐受后的潜在风险，特别是免疫功能不成熟的幼鱼，因此，鱼类免疫学家考虑正在发展的粘膜疫苗。从动物的福利和处理成本来看，鱼用口服粘膜疫苗，将是疫苗接种的理想方法，但还没有通过此途径实现大规模疫苗接种。
本文在总结人用和兽用口服疫苗的基础上，将粘膜免疫应用于鱼用口服疫苗研制，特别在抗原的类型、剂量、灭活等方法上的研究。首先，通过探索病原体的性质、鱼体性质和疫苗接种方面的共性，剖析鱼口服传递抗原耐受的可能条件。其次，从免疫保护机制入手，针对抗原耐受性问题和实现疫苗口服问题进行解决。再次，针对局部抗原呈递细胞（APC）和M细胞进行探究，选择出促进抗原粘附于M细胞或强烈激活局部非特异性免疫和特异性免疫应答的粘膜免疫佐剂。
2、人类和兽用疫苗的研究现状
在哺乳动物中，胃肠外抗原给药会触发弱的粘膜反应，而在粘膜表面的抗原给药会有效地触发局部以及全身性的体液和细胞介导的反应。在粘膜表面触发对粘膜病原体的特异性免疫反应保护的重要性是公认的。
经100多年研究，被批准的人用粘膜疫苗仅有5个，包括四个口服疫苗，预防小儿麻痹病毒，轮状病毒，沙门氏菌，伤寒和霍乱及一个鼻用抗流感病毒疫苗。
商业化的鱼类病原体的口服疫苗目前仅有大西洋鲑和银鲑商业口服疫苗、大扇贝口服疫苗，前者用于抵御鲑鱼立克次氏体、胰腺感染性病毒和传染性鲑鱼贫血病毒、虹鳟抗胰腺感染性病毒、彩虹鳟鱼和鲈鱼抗鳗弧菌；后者用于抵御加氏乳球菌。但与人类口服疫苗类似，鱼用口服疫苗只能提供弱效或短期的保护。
所有许可使用在人类和兽医物种的口服疫苗都是针对粘膜病原体，这些粘膜病原体要么感染粘膜表面本身，要么以粘膜为入口，再进行全身性感染。
只有少数成功的口服疫苗是在减毒活的病毒或细菌的基础上，模仿病原体感染的途径，并触发强大的局部免疫反应，且不需要任何额外的佐剂。减毒活疫苗的特点是安全性差，原因是不能保证病原体不会恢复到致病状态以致易感人的发病。
出于方便和安全性的考虑，鱼类口服疫苗的抗原研究集中于使用灭活病原体（加热或甲醛灭活），虽没有具体提到是否给予佐剂，但大多数疫苗都加入了抗原传递系统保护载体，旨在避免抗原在胃降解，也可能促进抗原粘附粘膜表面，或可能作为局部的炎症信号。灭活病原体的优势是相对安全，但其保护是弱效和短期的且与血清IgM水平有关，而疾病易感与血清IgM水平下降有关。另有报道，重复口服给药（灭活病原体）可保证鱼体在整个生产周期中的高血清IgM，说明口服抗原可以引起全身反应，但也说明鱼没有建立强大的记忆效应和形成耐受性。
4、非胶囊化鱼类口服疫苗研究策略与效果
尽管存在很多有前途的方法，但仍然很难系统的解决使用剂量、疫苗类型、疫苗效能的长期保护（＞3个月）等问题，且大多数研究中的病原体感染没有采用自然的感染途径。
5、胶囊化口服疫苗的研究对策与效果
6、鱼用口服疫苗的合理免疫方法
毫无疑问疫苗触发适当的免疫途径是对抗病原最有效的方法，但这种适当的免疫反应是如何实现的呢？
病原体引发全身体液免疫反应是适当的保护，灭活微生物、蛋白佐剂疫苗、病毒样颗粒或其他亚单位疫苗足以引发足够的全身性免疫反应。
然而，从目前的研究来看，专门引起全身性体液免疫的疫苗，可能不是有效的对粘膜（肠道）的病原体，因为肠外免疫难以有效地引起粘膜反应。
7、口服疫苗触发保护性体液免疫和细胞介导的反应
要触发保护性体液免疫和细胞介导的反应，应从以下几方面考虑：
再次，模仿病原体进入并激活粘膜反应。模仿病原体制备的疫苗包括：以减毒肠道致病菌作为疫苗载体的减毒活疫苗，包裹的DNA质粒和激活有效的粘膜免疫应答，重组减毒活疫苗载体。
8、合理的疫苗设计和未来疫苗的新方法
近年来，采用活病毒载体作为疫苗载体，是设计疫苗新的方向。这些活病毒载体包括杆状病毒、甲病毒、腺病毒等。它们具有一些共同点：1）可以被修饰并在自然物种上使用而不具有致病性；2）能够在真核细胞中递送核酸，由宿主细胞自身允许疫苗抗原表达；3）通过假型化的病毒，可以设计成靶向作用于被感染细胞；4）简单的克隆和变异策略。
9、目前最理想的口服疫苗的改进方法：粘膜佐剂
在口服给药时，非复制的抗原，如可溶性蛋白，质粒DNA的免疫原性很差，因为它们无法引发适当的炎症刺激信号。有效的粘膜免疫佐剂的使用可以大大提高这些疫苗的有效性。这些佐剂，包括以下几种，一是借鉴人用或其他物种疫苗的传统佐剂，如明矾、弗罗佐剂、脂质体、皂苷、角鲨烯等；二是肠毒素，肠毒素及肠病原体本身，无论是作为活的传递载体还是灭活的病原体，都可提供足够的刺激信号,都可用于口服免疫制剂的佐剂；三是分子佐剂，即以DNA质粒编码分子或以RNA为基本成分的载体分子作为分子佐剂是可能的，但从目前来看，这些分子佐剂用于鱼类的口服免疫还很局限。四是基于PAMPs的粘膜佐剂，在鱼类研究中，关于模式识别受体、清除剂受体及C型凝集素的鉴定及特征性描述已取得一定进步，可为合理佐剂设计提供方向。已有报道，聚肌胞苷酸（polyI:C一种干扰素诱导剂）比较适合作为鱼类疫苗佐剂，但用于口服疫苗佐剂仍需要评估。五是以植物蛋白作为免疫刺激剂打破粘膜耐受性。
10.关于鱼的习性和环境因素的考虑
已有研究表明，选择与鱼环境相匹配的封装方法是十分重要的。在饲养条件下，测试疫苗对靶动物是否有效，与鱼种、所处环境差异及养殖条件有重要的关系。因此，水产养殖动物口服疫苗的设计，应尽可能考虑不同鱼种的生活环境和饮食习惯的差异性。
11、斑马鱼作为水产动物的动物模型
疫苗验证须在合适的物种和其自然生长环境最相似的条件下进行。采用斑马鱼为模型有助于我们尽快搞清楚有关疫苗的特征和宿主的免疫反应，例如，口服传递抗原对吸收、分布和激活的免疫反应有相对贡献的特定细胞类型等的信息。已有以斑马鱼肠道生理和其潜在应用为模型进行研究报道。斑马鱼可以证明采用新方法开发的口服疫苗的有效性，有助于加速抗原、佐剂、疫苗传递载体和封装方法的选择。
当然，使用斑马鱼作为模型在水产养殖物种中仍有一定的局限性。由于杂食动物和食肉动物的肠道菌群和肠道环境的不同，斑马鱼是鲤科和淡水鱼类的合适模型，但不太适合作为鲑鱼、鳟鱼、大菱鲆、鲷科鱼类或鲈鱼的模型。
12、结语
借鉴人类和兽医口服疫苗方面所取得的成功，鱼类口服疫苗可从中吸取经验。由于养殖鱼类的物种及其病原体的多样性，现有口服疫苗难以满足市场需求。尽管在过去30年中，已有一些有关鱼粘膜免疫学的研究，但仍处于起步阶段，这与硬骨鱼类的物种差异性大有关。
近5～10年，鱼粘膜免疫也有新发现，包括IgT或M样细胞、粘膜免疫学和疫苗学，结合对鱼内脏的研究表明，M样细胞或抗原呈递细胞将为鱼类疫苗给药提供一种可行的选择。
从分子印迹技术和遗传学的角度，斑马鱼动物模型可加快鱼类疫苗开发，类似其他动物模型有助于人类和兽医领域。对于如何接种口服疫苗、以及设计突破粘膜耐受性的策略，宿主粘膜反应和鱼类肠道微生物群的信息是必不可少的。另外，学术界的同行和养殖户之间协作，对生产商业安全有效的鱼用疫苗也是有帮助的。
唐晓莹徐静等
本稿为水产养殖动物疾病防控技术国家地方联合工程实验室原创编译整理