董莹1、2、3，贺文斌2，赵景壮2，任广明2，卢彤岩2，邵轶智2，徐黎明2、4*
(1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海201306；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨150070；3.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海201306；4.黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室，黑龙江哈尔滨150070)
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关键词:虹鳟；传染性胰脏坏死病毒；酵母展示；口服疫苗
传染性胰脏坏死病(Infectiouspancreaticnecrosis,IPN)是一种高致病性的病毒性疾病，主要感染虹鳟Oncorhynchusmykiss、河鳟SalmofarioLinnaeus、大西洋鲑Salmonsalar等鲑科鱼类的鱼苗和稚鱼[1]，死亡率可达到90%以上，实际生产中给鲑鳟鱼养殖业带来了巨大的经济损失[2]。传染性胰脏坏死病毒(Infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV)是IPN的病原，广泛流行于欧洲、亚洲、美国等地[3]，中国的山西[2]、山东[4]、四川[5]、云南[6]等地均有IPN暴发的报道。IPNV是无囊膜的双链RNA病毒，被归类为双RNA病毒科Birnaviridae水生双RNA病毒属Aquabirnavirus[7]，具有双节段基因组，即A片段和B片段。A片段编码VP2、VP3、VP4和VP5蛋白，B片段编码VP1蛋白[8]。VP2蛋白是IPNV的结构蛋白之一，是IPNV的重要保护性抗原[9]。
IPNV因其广泛的流行性和致病性，被许多国家列为进出口检验检疫对象。中国对于IPN尚无有效的防治药物。疫苗接种是公认的控制养殖动物疾病的安全高效途径，目前，关于IPNV疫苗的研究报道主要集中在DNA疫苗[10]、减毒疫苗[11]、灭活疫苗[12]和亚单位疫苗[13]方面，所采用的免疫方式主要为注射法。由于鱼类生活在水中，群体量大，实际生产中注射免疫可操作性较低，且不适于小鱼的群体免疫。口服免疫在实际操作中简单方便、不损伤机体，能降低动物的应激反应，可免疫不同生长阶段的水生动物。因此，制备口服疫苗预防IPNV感染具有十分重要的现实意义。
酿酒酵母能将抗原蛋白展示于酵母细胞表面，是一种理想的制备口服疫苗的载体。目前已有关于病毒的酵母展示疫苗的研究报道，如利用酵母表面展示技术(Yeastdisplaytechnology)制备的传染性造血器官坏死病毒[14](infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV)和草鱼呼肠孤病毒[15](grasscarpreovirus,GCRV)的口服疫苗。本课题组于2013年从中国云南某养殖场患病虹鳟体内分离获得一株IPNV，命名为ChRtm213[6]，该毒株基因型为genogroup1，属于中国现行IPNV流行毒株[8]，本课题组前期利用酵母展示系统将IPNVChRtm213的表面蛋白VP2展示在酵母细胞表面，构建了重组酵母疫苗株[16]。本研究中以虹鳟为试验动物，对该疫苗株诱导虹鳟免疫反应能力及保护效力进行了检测与分析，同时对不同的免疫方案进行了比较，以期为该口服疫苗的实际应用提供科学参考。
IPNVChRtm213毒株为刘淼等[6]从云南某虹鳟养殖场中分离，并由黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室保存(以下简称本实验室)。虹鳟体质量为(5±1)g，购自本溪艾格莫林实业有限公司。大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinooksalmonembryocells，CHSE-214)由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害教研室曾令兵研究员惠赠，亮氨酸和色氨酸营养缺陷型的酿酒酵母菌株EBY100和酵母展示载体pYD1(InvitrogenLifeTechnologies，V835-01)由中国水产科学研究院黄海水产研究所黄倢研究员惠赠；IPNV酵母展示疫苗株EBY100/pYD1-VP2、空载体酵母EBY100/pYD1[16]和鼠抗IPNVVP2蛋白多克隆抗体[17]由本实验室制备保存。山羊抗鼠IgG抗体(Cy3)购自英国Abcam公司;TRIzolReagent购自美国Invitrogen公司；OneStepSYBRPrimeScriptPLUSRT-PCR试剂盒(PerfectRealTime)购自TaKaRa公司。
1.2.2疫苗制备及口服免疫将EBY100/pYD1-VP2疫苗株接种至150mL2%葡萄糖YNB-CAA液体培养基中扩大培养，根据“1.2.1节”的诱导方法表达VP2蛋白，离心收集酵母细胞。将诱导的新鲜酵母细胞EBY100/pYD1-VP2和空载体酵母细胞EBY100/pYD1悬于PBS中，制备成终浓度为1×1010CFU/mL的酵母悬液。将健康虹鳟随机分为5组，即疫苗株单次免疫组、疫苗株多次免疫组、空载体酵母单次免疫组、空载体酵母多次免疫组和PBS模拟免疫组，每组300尾。单次免疫组为连续口服免疫7d，多次免疫组为单次免疫后间隔一周再次连续免疫7d。用1%MS-222溶液轻度麻醉虹鳟后，每天口灌免疫剂量为100μL酵母悬液。
1.2.4中和抗体效价测定利用中和抗体试验测定各试验组虹鳟血清中IPNV中和抗体的效价。即在免疫结束后第21、49、70天时分别从各组挑取20尾虹鳟，从鱼尾静脉采集血液，将血液于4℃下静置过夜至凝结，以500×g离心10min收集血清，-80℃下暂时保存。将待测血清(50μL)在96孔板上进行二倍系列稀释，与IPNV悬液(200TCID50,50μL)混合，加入96孔板中CHSE-214单层细胞上，15℃下培养1h后换成新鲜培养基，15℃下培养7d。以抑制50%细胞病变的血清最高稀释倍数的倒数作为血清中和抗体效价。
1.2.5IPNV攻毒试验及病毒载量测定虹鳟口服免疫结束后第14、21天，取各组虹鳟用MS-222溶液进行轻度麻醉，腹腔注射100μL100TCID50/mLIPNV病毒悬液，然后置于独立的循环水养殖鱼缸中(15℃)，每组30尾，设3个平行。同时设置PBS模拟攻毒组。在攻毒后第14天，分别采集各组虹鳟头肾、脾脏和肝脏的组织匀浆混合后提取RNA作为模板，以β-actin管家基因作为内参，采用RT-qPCR测定疫苗株单次免疫组、疫苗株多次免疫组、空载体酵母单次免疫组和空载体酵母多次免疫组虹鳟VP1和VP2基因的表达水平，以PBS模拟攻毒组虹鳟组织RNA为空白对照。采用2-ΔΔCT方法计算VP1和VP2基因相对表达量。
试验数据以平均数±标准差(mean±S.D.)表示。使用GraphPadPrism5.0软件进行多因素方差分析，采用Tukey法进行多重比较，显著性水平设为0.05。
2.1.2酵母细胞表面VP2蛋白的流式细胞仪分析
2.2.2RT-qPCR定量评估CD4和CD8基因表达
标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。Themeanswithdifferentlettersaresignificantlydifferentinthegroupsatthe0.05probabilitylevel,andthemeanswiththesameletterarenotsignificantdifferences,etsequentia.图1EBY100/pYD1-VP2表面VP2蛋白的免疫荧光检测Fig.1DetectionofEBY100/pYD1-VP2expressedVP2proteinbyimmunofluorescenceassay
利用RT-qPCR测定各组虹鳟攻毒后头肾、肝脏和脾脏混合组织样品中VP1和VP2基因表达量，以PBS模拟攻毒组虹鳟组织RNA为空白对照。从图6可见：在第14、21天时，空载体酵母免疫组虹鳟组织中VP1和VP2基因表达量均显著高于疫苗免疫组(P<0.05)，其中空载体酵母单次和多次免疫组VP1基因表达量分别为疫苗株单次和多次免疫组的95、202倍和90、280倍，空载体酵母单次和多次免疫组VP2基因表达量分别为疫苗株单次和多次免疫组的90、237倍和83、220倍；在第14、21天，疫苗株单次免疫组VP1和VP2基因的表达量显著高于疫苗株多次免疫组(P<0.05)，疫苗株单次免疫组为疫苗株多次免疫组的2.25、3.33倍(VP1)和2.67、2.80倍(VP2)。本研究结果表明，该酵母口服疫苗可使虹鳟体内的病毒载量显著降低(P<0.05)，且多次免疫具有更强的抗病毒效果，各组攻毒虹鳟未出现IPNV病理性死亡。
图2酵母表面展示VP2蛋白的流式细胞仪检测Fig.2FlowcytometryanalysisofVP2proteindisplayedonyeastsurface
IPNV是一种高传染性、高致死率的病原体，对鲑鳟水产养殖业造成了巨大的经济损失。对鱼类病毒性疾病来说，疫苗是一种安全、高效的理想防控药物。目前全球只有挪威有一种IPN商业化疫苗为亚单位疫苗，该商业化亚单位疫苗主要针对Sp血清型IPNV，而中国现行IPNV毒株并非全是SP血清型。因此，中国IPN的有效防控只能依靠疫苗的自主研发，无法引进国外商业化疫苗。目前，渔用疫苗的免疫方式主要包括口服免疫、腹腔或肌肉注射免疫和浸泡免疫。口服疫苗可操作性强，过程简单方便，利于多次免疫，适合鱼苗的大规模免疫，可减小劳动强度，并且避免注射带来的疼痛和应激反应，尤其对于幼龄鱼，口服免疫带来的便利和安全更为显著[22]。另外，口服免疫需要的免疫剂量远远低于浸泡免疫，降低了经济成本[23]。本研究领域已见口服免疫预防IPN的报道，并取得了一定的效果。如张英[24]利用植物乳杆菌制备了IPNV(Sp血清型)VP2-VP3重组亚单位口服疫苗，Ahmadivand等[25]采用壳聚糖/三聚磷酸盐(CS-TPP)纳米颗粒和海藻酸盐包被IPNV(Sp血清型)核酸疫苗制备了口服疫苗。
图4免疫虹鳟CD4和CD8基因表达定量分析Fig.4ExpressionlevelsofCD4andCD8genesinimmunizedrainbowtrout
酵母表面展示系统是可以将外源蛋白展示在酵母表面的一种真核细胞表达系统，主要包括a凝集素和α凝集素展示系统，外源蛋白通过结合酵母细胞壁蛋白形成融合蛋白锚定并表达于酵母细胞表面[26]。酿酒酵母能将抗原蛋白展示于酵母菌表面，是一种较好的制备口服疫苗的载体[27]。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，能有效地诱导黏膜免疫和全身的免疫应答，产生免疫保护作用[28]。IgM和IgT免疫球蛋白在保护性免疫中起着重要作用[18]。
图6免疫虹鳟病毒载量分析Fig.6IPNVloadinserumofimmunizedrainbowtrout
本研究中充分证明了所构建的IPN酵母口服疫苗能刺激虹鳟非特异性免疫和特异性免疫反应并显著降低虹鳟体内IPNV病毒载量，且多次免疫比单次免疫具有更好的免疫保护效果。该结果可为IPNV新型口服活载体疫苗的研发提供数据资料，同时为鱼类口服疫苗的开发提供科学参考。口服疫苗能减小动物的应激反应，操作简单方便，但同时口服免疫易受到胃肠道酸碱度、蛋白酶及微生物的影响，从而降低疫苗的免疫效果。因此，今后还需进一步探索以保证口服疫苗保护效力的稳定性。
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DONGYing1,2,3,HEWenbin2,ZHAOJingzhuang2,RENGuangming2,LUTongyan2,SHAOYizhi2,XULiming2,4*
(1.NationalDemonstrationCentreforExperimentalFisheriesScienceEducation,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China；2.HeilongjiangRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China；3.NationalPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China；4.KeyLaboratoryofAquaticAnimalDiseasesandImmuneTechnologyofHeilongjiangProvince,Harbin150070,China)
Keywords：Oncorhynchusmykiss;infectiouspancreaticnecrosisvirus;yeastsurfacedisplay;oralvaccine
收稿日期：2019-11-22
基金项目：中央公益性事业单位基本科研业务费专项(HSY201901M)；国家自然科学基金(31802345)；中国博士后科学基金(2018M630893，2019T12027)
作者简介：董莹(1994—)，女，硕士研究生。E-mail:1909662504@qq.com
通信作者：徐黎明(1984—)，女，博士，副研究员。E-mail:xuliming@hrfri.ac.cn