1.诊断性生物标志物（DiagnosticBiomarker）
用于检测或确认疾病的存在，或识别疾病亚型的生物标志物。可判断患者是否患有特定疾病，或者作为志愿者能否作为入组某个疾病临床试验的关键决策。不同疾病亚型会对某些治疗方式表现出不同的效果。比如肿瘤切除后，预后标志物可以预测乳腺癌复发的可能性。某些病理标志物，比如会在心衰时，预测什么人会对治疗有所响应。有些基因水平的标志物可用于判断对癌症的治疗是否应答。可以鉴别疾病亚型的诊断型生物标志物通常在诊断分类结果被用作预测或预后（prognostic）生物标志物时发挥关键作用。
2.预后性生物标志物（PrognosticBiomarker）
反映疾病预后特征、疾病复发或进展风险的生物标志物。预后生物标志物可以指示将来临床事件增加或减少的可能性，以及在特定人群中疾病复发或进展。将来可能发生的临床事件包括死亡、疾病进展、疾病复发、出现新的临床症状。预后生物标志物的出现和强度可能根据临床试验方案的设定而有所不同，比如治疗差异、疾病阶段等，尤其是临床终点的选择。所以，描述预后生物标志物需要结合合适的场景。预后生物标志物通常用作临床试验中更易产生临床事件或疾病进展患者的判定标准。因此，其在药物研发中应用非常广泛：预后性生物标志物可应用于受试者分层，由于不同预后的患者疾病进程不同，发生临床终点事件的几率也不尽相同。通过预后性生物标志物将受试者分层，可减少受试者异质性和混杂因素对研究结果的干扰，减少组间偏倚。预后性生物标志物还可用于人群富集，通过识别、富集临床事件发生比例更高的患者群体，可提高研究针对性。需要注意的是，预后性生物标志物反映患者疾病预后特征，通常与治疗或干预措施无关。
3.预测性生物标志物（PredictiveBiomarker）
4.效应生物标志物（ResponseBiomarker）
用于指示人在接受药物治疗或环境因素影响后产生的潜在的有益的或者有害的生物学效应。药效学生物标志物可对药物的疗效或者疾病的治疗结果以及概念验证进行决策。临床终点往往需要相对更大样本及更长的周期，相比之下，通过药效学生物标志物可以在早期研发阶段探索反应信号。药效学生物标志物可以用于概念验证、指导药物剂量选择，以及作为替代终点开发的指标，写入药品说明书。药效学指标可以提供药物与靶点的作用情况，然而，讨论作用机制时不可与药物直接对疾病的作用情况或者变化割裂讨论。
替代终点指标可以用作替代直接的指标，如患者感受、功能、生存等。替代终点指标不会直接测定临床主要获益，而是以期通过基于流行病学的、治疗学的、病理生理学的或者其它科学的证据预测药物临床获益或有害。药效学生物标志物如能建立临床获益目标的验证关联，可作为替代终点，从而缩短研发周期。依据FDA将替代终点和潜在的替代终点依据临床验证的水平分为三种：经验证的(validated)替代终点，合理可能的(reasonablylikely)替代终点，候选的(candidate)替代终点。
5.安全性生物标志物（SafetyBiomarker）
通过在用药前检测、用药过程中或用药后进行检测，用以指示是否产生毒副作用、程度如何，从而避免或降低患者发生严重安全性风险的生物标志物。安全性生物标志物可以检测或预测医学干预和环境因素不可预期的、且可能有潜在的风险或者具有毒副作用。在毒性反应严重之前通过检测安全性生物标志物的水平获悉潜在风险，从而调整药物剂量或进行干预治疗。安全性生物标志物还可以帮助临床制定合理的治疗方案。这类生物标志物需要进行周期性监测，以保证药物的潜在毒性被监控。理想的安全性生物标志物可以指征毒性作用发展的过程，比如某药物会引起器官损伤，在临床症状或者不可逆的损伤发生之前可以通过安全性生物标志物的监测发现潜在风险。安全性生物标志物还可以作为终止治疗的依据，减少或避免严重不良反应的发生，还可以用于发现人群种族差异，识别安全治疗窗差距，指导合理剂量选择。
6.监测性生物标志物（MonitoringBiomarker）
Fit-for-purpose的生物分析策略
生物标志物作为药物研发中安全性和有效性的重要依据，其生物分析尤为重要。生物标志物是内源性物质或者分子，不同于外源物的生物分析，需要对在生理、病理、合并症、治疗状态以及环境因素作用下引起的内源生物标志物的升高或者降低水平进行检测分析。
1.生物分析方法的类别
根据待测物的代表性将生物分析实验分为绝对定量实验、相对定量实验、半定量实验和定性实验。
绝对定量实验是采用标准品拟合计算未知样品中待测物的绝对量。该类实验通常是在标准参考品明确、且可完全代表内源生物标志物的情况下开展，比如小分子分析物（如甾体）。采用的是已验证准确度和精密度的生理化学或者生物学方法对待测物进行准确定量。
相对定量实验是依赖于标曲的响应-浓度关系进行定量。例如多种细胞因子的免疫实验，标准参考品可能无法获得，或者所获得的标准参考品无法代表内源分析物。在这种情况下，方法的精密度可以被验证，但是准确度是相对准确。
半定量实验则不用标准曲线，但待测样品具有连续的响应和可报告的分析结果的特征。比如抗药抗体的抗体滴度实验能够表明方法的精密度，但无法表征准确度。
定性实验产生的数据与样品中分析物的量缺乏比例关系。这样的结果通常用于判定结果是全或无的效应，比如表示基因或基因产物有或者没有。作为定量实验，则需要对方法的适用性、可靠性进行合理评估、确证或验证，以最终决定方法是否可用于生物样品中生物标志物的分析。
2.Fit-for-purpose的生物分析
创新药物研发时的生物分析方法有别于实验室用于健康评价、疾病诊断、预防或治疗时所采用的方法，后者是基于美国临床实验室改进法案修正案（theClinicalLaboratoryImprovementAmendments,CLIA)。如前文所述，药物研发所涉及的生物标志物种类众多，在药物的开发过程中应用目的也极为广泛，因此，到目前为止并没有监管部门统一发布的生物标志物方法验证的法规或指导原则。由于生物标志物研究缺乏标准物质、存在于基质中、个体之间水平变异大，使得生物标志物的分析方法很难设定一致的分析策略和接受标准。目前，行业对于生物标志物的生物分析已达成共识，可以采用“fit-for-purpose”的生物分析策略，即为根据生物标志物应用的目的、临床用途和实际结果表现来确定生物分析方法学验证的内容和接受标准。
表1生物标志物方法学研究策略
3.制定方案前的考量
需要基于生物标志物的应用场景制定生物分析方案，可根据药物的作用机制或生物学意义、药效学作用、方法开发、结果的报告和结果的解读等方面全面考量（如表2所示）。如需根据临床试验目标人群，确定试剂、基质（健康人或患者，真实基质或替代基质等）的选择；根据目标人群中生物标志物的水平以及给药后生物标志物的变化水平进行方法的灵敏度等确定；样本的采集、处理储存等环节的把控至关重要，其直接决定检测数据的可靠性、准确性，需根据临床需求制定合理的生物样本采集、运输、储存方案。方法学的考察应能覆盖样本从采集至检测完成整个生命周期，包括不限于如下考虑，如：采样管/储存管的材质、采用血清还是血浆、细胞或全血的处理过程（如细胞样本若处理不当，通路可能被激活）、稳定性。对于生物标志物的检测还应考虑药物与生物标志物结合所带来的干扰。此外，检测平台的选择关乎方法的变异，根据生物标志物的特点，如可溶性、细胞膜表面的、直接与靶点作用、下游事件乃至基因层面等。并且，一种平台适应某种生物标志物的检测，但可能不适合其它的，所以检测方法和平台的选择非常重要。
表2基于应用目的的生物标志物生物分析的基本考量[10]
3.1标准参考品
3.2基质
与PK实验不同，生物标志物生物分析中基质经常较为复杂，常用的基质包括：含有内源分析物的基质和替代基质，其中，替代基质包括不同种属的基质（无待测物或含少量的同源干扰物的）、去除内源物的同源基质（采用活性炭、亲和柱、高温孵育、酸碱水解等方式）、PBS、含有胎牛血清的PBS。因为大部分生物标志物的检测通常无法获得空白基质，所以会采用替代基质配制标曲。替代基质的优势是稳定性好、方便、长期一致性。使用替代基质的问题是因为与真实基质存在差异，需衡量采用替代基质检测真实样品的能力，以及采用内源基质检测结果的相似程度。可以采用替代基质中加标、内源样品池浓度在LLOQ和ULOQ之间的样品、内源基质和替代基质混合，或者在内源样品池中加标的方式进行相应考察。采用在替代基质中加标的方式最容易实施，此时，可以采用平行性评估标曲的性能，以指征替代基质中标曲对于真实基质中内源生物标志物定量的相似性，若采用替代基质的浓度-响应关系与真实基质的一致，结果即可被接收。然而，多指标生物标志物分析时，采用替代基质时，多指标没法同时满足要求的情况常常出现，所以，对于某些分析物非平行性问题也是不可避免的。
3.3验证性样品和质控样品
内源性样品池不可实现时，应用较多的是采用含有低浓度水平内源物的真实基质或替代基质加标的方式制备验证性样品和质控样品，然后通过扣减内源性物质的水平评估准确度。但需要注意但是，对于蛋白生物标志物，加入的标准品可能没法等同于内源物。具体见“准确度和精密度”描述。
此外，还可以采用筛选阴性基质或者含内源性分析物水平极低的基质的方式，将基质混合后加标制备验证性样品和质控样品。
3.4方法学验证内容
对于采用配体结合法（Ligandbindingassays,LBAs)应用于低分子量的代谢物、多肽和蛋白，并且为单指标分析的情况，对于方法学验证和样品分析行业内已经形成了一定的具体的实施细则。全验证项目包括：准确度（相对），分析范围（AnalyticalMeasurementRange，AMR）：包括LLOQ和ULOQ，平行性：包括最低需求稀释度（MRD)和稀释线性，精密度（Imprecision;intermediateprecision,reproducibility）：批内、批间、不同天、不同人员（如适用）、不同lots（如适用），选择性，特异性，稳定性（样本）：实验台、短稳、长稳、反复冻融。其中，平行性、选择性、灵敏度和稳定性是生物标志物的生物分析的关键指标（Keyparameters）。
（1）特异性
（2）选择性
（3）标准曲线
（4）准确度和精密度
生物标志物准确度的考察是否按照PK实验进行具有一定争议。关键的问题是要清楚绝对准确度和相对准确度。小分子或者多肽类生物标志物，且采用稳定同位素内标的质谱法可以谈绝对准确度。生物标志物的准确度和精密度要求需根据试验的目的来制定。当待测物为低分子量物质，并且其标准物质可获得，则允许采用绝对准确度进行评估。
批内和批间的准确度和精密度可以通过目标人群获得的内源性真实基质重复测定精密度和定值（人群间或人群内或/和样品池相对于标准值的平均值和变异）进行评估，但绝大多数情况，由于可能无法获得标准参考物质而无法评估绝对准确度，相对准确度数据仍具参考意义。可依据内源物体内真实水平配制不同浓度的质控样品进行考察，也可以通过替代基质稀释真实基质、真实基质加标（包括加入替代标准参考品）、或者替代基质加标（包括加入替代标准参考品）。这些方法中，首选采用真实基质（患者基质或者受试者样品）进行精密度和准确度的考察。当采用含有内源物的基质加标配制质控样品时，准确度的两种计算公式如下所示，选择其中一个即可：准确度%=（待测物浓度-内源物浓度）/加标浓度×100或准确度%=待测物浓度/（内源物浓度+加标浓度）×100。无论是采用替代基质或者真实基质，不同的分析批中建议至少评价4个浓度，至少3个重复。当采用替代基质进行QC样本的制备时，应至少采用1批真实基质进行评价。
（5）稀释线性和钩状效应（hookeffect）
如PK分析中稀释线性的考察方式，在生物标志物实际样品分析中，若样品存在浓度高于标准曲线的定量上限ULOQ的浓度时，需通过对采用标准参考品配制的超过ULOQ的高浓度质控样品进行稀释，至少3个稀释因子，至少3个重复进行稀释线性的考察。同时，利用高浓度质控样品考察钩状效应，若高浓度质控样品的浓度低于ULOQ，则表示存在钩状效应，需优化方法消除基质干扰。稀释线性和钩状效应的考察根据具体情况，为非必须考察项。
（6）平行性
对于生物标志物来说，由于基质中存在内源分析物，因此，大部分采用LBA或者LC-MS法进行生物标志物定量研究的实验都采用替代基质。尤其采用LBA法，检测的只是结合部位的相互作用，不能全面反映真实样品中内源物内在的理化性质。所以，需要证明方法中采用的关键试剂与标曲中的标准参考品的相互作用和与真实内源物相互作用的相似性，主要是通过将真实基质稀释不同系列获得的平行线来评估的。理想的平行性考察结果是所有稀释度下的回收率均为100%，但现实中由于内在分析方法的变异不可能实现的。
应该在早期开发以及验证时就进行平行性的考察，并且在适用的情况下，应用正常或者疾病状态下的样本进行研究。但是在某些情况下，比如在健康人中没有表达或者仅仅在少数疾病状态下才表达的生物标志物，需要待收集临床样本后进行评估。无法获得高水平样本时，可考虑加入刺激剂的方法（若适用）。当生物标志物水平极低没法进行稀释考察平行性时，只能用稀释线性评估。
（7）稳定性
生物标志物的稳定性是用来评估生物基质在不同采集、放置、储存、运输等条件下内源性物质的稳定情况。定义生物标志物的稳定性较为复杂，通常，需要具体问题具体分析。不像小分子，大分子的稳定性是依赖于所采用的检测方法的。对于免疫分析，原理是抗体通过识别抗原表位实现检测，所以会导致稳定性结果的错误判断。比如，反复冻融可能会改变结合位点，使得采用LC-MS或者HPLC法则表明待测物稳定的，但采用免疫学实验会得到不稳定的结果。另外，生物标志物在储存的过程中会发生降解，使得检测结果偏高。所以，需要结合实验原理、生物标志物的特点等综合评判生物标志物的稳定性。
生物标志物研究需要多平台协同开展，实验室需符合GLP、GCP要求的生物分析实验室、P2级细胞实验室和PCR实验室。依托质谱分析平台、免疫分析平台、细胞生物学平台、分子生物学平台四大技术平台，开展从细胞水平、蛋白水平到分子水平的检测工作，协同解决大/小分子创新药物临床前/临床PK/PD研究中所遇到的挑战。实现对大小分子创新药物PK/PD研究的全方位支撑。
图1研究平台部分实验室区域
图2阳光德美生物分析和PK/PD研究平台
▌案例一：细胞-病毒平台案例：抗病毒药物中和活性的检测
呼吸道合胞病毒（RSV）是引起婴幼儿季节性下呼吸道感染最为重要的原因，也是导致新生儿因病毒感染而死亡的重要因素，目前国内尚无用于防治RSV感染的疫苗和特效抗病毒药物上市。某RSV创新药物为全人源化RSV单克隆抗体，是国内头部的药企开发用于治疗RSV感染。前期研究结果表明其具有良好的中和活性，研发成果具有较高的临床价值和商业价值，有望填补国内RSV治疗领域的空白。
阳光德美充分发挥了细胞-病毒平台的优势，采用ELISA法进行PK和免疫原性研究，采用微量中和滴定法进行各个剂量组中血清抗RSV中和抗体滴度水平的变化，高效、高质量地推进了该药物的临床PK、PD及免疫原性研究，为该药物的安全性和有效性评价提供有力的数据支持。目前，该药物正在进行Ib/II期临床试验。
▌案例二：细胞平台案例
（1）应用免疫细胞信号通路激活模型检测pSTAT1水平
（2）流式细胞法检测人外周血中淋巴细胞亚群的数量
RAK细胞免疫治疗是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，杀伤功能增强，然后回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受、激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效，被称为细胞免疫治疗“机械化步兵”。某自体RAK细胞表现出在各实体肿瘤的过继细胞免疫治疗中均有明显效果，且具有良好的安全性和有效性，其注射液获批适应症为2线治疗失败的晚期肾癌患者，以及用于预防肝细胞癌外科根治性切除术后患者高危复发。目前该项目处于临床II期。阳光德美采用流式细胞法完成该疗法人外周血中15种淋巴细胞亚群的检测，以支持该疗法临床有效性的评价。
（3）PD1受体占位研究
PD1抑制剂与小分子药物联合用药具有巨大的优势。阳光德美采用流式细胞平台，分别应用Bond策略和Free策略进行PD1的受体占位研究，可为药物的安全性和有效性研究提供了参考。
（4）CFU的检测
集落形成（CFU）用于衡量造血克隆形成能力，证明其有分化血液中具有造血功能的细胞的潜能，是造血功能的恢复的重要指标。某药物是趋化因子受体4（CXCR4）拮抗剂，临床拟申请作为造血干细胞动员剂（HSC），适用于非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者动员HSC进入外周血，以便于完成HSC采集与自体移植。
该项目的难点是：CFU的培养需要14天，对细胞操作水平要求极高，此外，对集落类型的判定、以及检测通量问题均具有挑战。阳光德美凭借扎实的技术技能，成功地建立了人全血样品中CFU的定量分析，为该创新药物的有效性研究提供了重要的数据支持。
▌案例三：免疫分析平台案例：ET-1的检测
▌案例四：分子生物学平台案例：A2A受体靶基因检测
腺苷A2A受体（A2AR）已经成为众多非多巴胺类治疗帕金森病药物的明星靶点，其拮抗剂VG081821AC已经获得美国FDA上市。某创新药物是首个在国内申报临床的1类A2AR拮抗剂用于帕金森治疗的药物。目前正在II期临床试验中。阳光德美应用qPCR对PBMC样品中的A2AR基因表达水平进行检测，结果用于支撑药物的有效性评价。
结语
生物标志物可以作为帮助创新药物研发走出困境的一个重要工具，但不同于PK，生物标志物的应用场景众多，甚至对于同一种生物标志物会对应多种应用，使得生物标志物的生物分析面对诸多挑战。需要分析科学家通过了解药物的作用机制或生物学意义，建立合适的样本采集和生物分析方法，制定合适的验证内容和接受标准，以支持临床前、临床数据的解读，发挥好生物标志物在创新药物研发中的重要作用，助推创新药物研发进入新的发展阶段。
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参考文献
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阳光德美内部数据
北京阳光德美医药科技有限公司是一家集大/小分子药物临床前/临床PK/PD服务于一体的综合性研究平台，可提供全方位的药代动力学-药效学和GLP生物分析服务，专注于解决客户药代药效研究及生物分析中所遇到的挑战。