本发明涉及核磁共振波谱学检测方法，尤其是涉及利用一维同核去偶1hnmr谱的一种鉴别真假蜂蜜的核磁共振去偶氢谱方法。
背景技术：
蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花中采得花蜜，与自身分泌物结合后酿造而成的富含大量易于人体吸收的果糖和葡萄糖，少量蔗糖、麦芽糖等糖分以及微量维生素的天然食品，具有很高的营养和保健效果，备受消费者青睐。巨大的市场带来了巨大的经济利益，因此就有不少不法商贩通过向蜂蜜中掺假来冒充蜂蜜获取利益，且掺假手段丰富多变，有向其中掺入廉价的蔗糖、植物糖浆或者葡萄糖浆来冒充蜂蜜等，还有向价格较高的蜂蜜(洋槐花蜜等)中掺入价格较低的蜂蜜(油菜花蜜等)来以次充好等手段。这些行为在严重侵害了消费者利益的同时也对蜂蜜行业的健康发展产生了极大的负面影响[1]。
针对层出不穷的掺假方式，的检测手段也在不断发展。从传统的感官上观测到对理化指标的检测，再到依靠现代分析技术来进行鉴别。目前比较常用的方法为碳同位素比率法[2-3]、色谱分析(气相色谱[4-5]、离子色谱[6-7]和液相分离-同位素质谱[8]等)及其联用技术、光谱分析[9]、显示扫描量热法[10]等。这些方法各有长短，有的受限于实验条件，有些只能针对某一类掺假方式。
近年来，利用核磁共振(nuclearmagneticresonance,nmr)与统计分析工具相结合的方法逐渐走入了人们的视野[11-13]。
技术实现要素：
本发明的目的是提供可获得去偶的1hnmr谱，提高谱图分辨率，结合多变量统计分析可实现其在蜂蜜真假鉴别中应用的一种鉴别真假蜂蜜的核磁共振去偶氢谱方法。
本发明包括以下步骤：
1)蜂蜜样品制备：
在步骤1)中，所述蜂蜜样品制备，可将所需要检测的蜂蜜配制成为用核磁共振谱仪检测的溶液样品；所选用的蜂蜜可由江苏省出入境检验检疫局动植物与食品检测中心所提供，花源为洋槐和油菜，产地有江苏、四川和河南等地；假蜂蜜为检测中心已经证实的由市场上收集到的掺入不同比例大米糖浆、转化糖浆等的掺假蜂蜜；配样方法为称取蜂蜜100mg，加入500μl含0.05％tsp(2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸)的磷酸缓冲液(0.60mol/l,k2hpo4/nah2po4,ph＝4.92,99.9％d2o)，使用振荡器将其混匀；在室温下静置5min后，经离心10min，转速10000rpm，取其上层清液500μl加入到5mm核磁管中并密封。
2)蜂蜜溶液样品的nmr检测；
在步骤2)中，所述蜂蜜溶液样品的nmr检测，可导入事先编译好的序列进行实验数据采集，得到1hnmr去偶谱图和常规谱图；将已经制备好的蜂蜜溶液样品核磁管置于500mhzagilentnmrsystem核磁共振谱仪中，用常规单脉冲序列采集一张1hnmr谱，获得谱线的线宽，为谱宽参数设置提供依据，同时线宽值反映了磁场均匀性情况；向核磁共振谱仪操作软件中导入事先编译好的zs序列以及tnnoesy序列，设置合理参数，进行数据采样，其中，zs序列所得到的自由感应衰减信号需要通过事先编译好的数据处理程序进行自由感应衰减信号(fid)拼接重组获得新的fid，将这个拼接后的fid和tnnoesy序列所得到的fid分别进行傅里叶变换，得到所检测蜂蜜样品的去偶谱图和常规谱图。
3)实验数据预处理；
在步骤3)中，所述实验数据预处理，可将实验所得到的谱图进行相位基线调整、去除溶剂峰、分段积分和归一化处理得到积分数据供后续建模分析；
将从步骤2)中所得到的zs去偶谱和常规tnnoesy谱用分别用mestrenova(version9.0)软件进行手动相位矫正、多点基线矫正、定标、谱峰对齐和分段积分等数据预处理操作；在实验中，得到的谱图在水峰部分(δ＝4.75～4.90)会变得不规则，因此要将这部分谱图去除以免影响后续分析；对剩余部分区域(δ＝0.50～9.0)进行等间隔积分，其中积分间隔为△δ＝0.01，对获得的积分数据进行归一化处理，归一化后的积分数据转存为ascⅱ格式以供后续统计建模。
4)实验结果处理分析。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明将zs去偶谱方法与多变量统计分析方法相结合，并应用于复杂的天然食品蜂蜜的组成分析中。通过对获得的纯化学位移谱图进行主成分分析法和正交偏最小二乘法分析，实现了真假蜂蜜的鉴别，同时，找到了真蜂蜜和掺假蜂蜜的差异物质，确定了掺假方式。
(2)本发明所采用的zangger-sterk去偶方法能够去除宽带同核1h-1h偶合，仅保留了化学位移信息，应用于复杂蜂蜜样品获得了质量较高的去偶氢谱图，提高了谱图分辨率。zs脉冲序列简单，易于操作，常规谱仪条件即可满足实验要求。
附图说明
图1为本发明所使用的zs去偶脉冲序列。
图2为本发明所使用的zs去偶脉冲层选拼接示意图。
图3为分别使用去偶谱方法zs序列和tnnoesy序列所采集到的真蜂蜜和掺假蜂蜜的去偶氢谱和常规氢谱。
图4为掺假蜂蜜样品(图中显示为方形)和真蜂蜜样品(图中显示为星形)进行主成分分析(pca)所得到的得分图。
图5为掺假蜂蜜样品(图中显示为方形)和真蜂蜜样品(图中显示为三角形)进行正交偏最小二乘法分析(opls-da)所得到的得分图。
图6为由opls分析结果通过matlab处理得到的负载图。
具体实施方式
本发明将zs去偶谱方法与多变量统计分析方法相结合，通过对获得的纯化学位移谱图进行主成分分析法和正交偏最小二乘法分析，实现了真假蜂蜜的鉴别，找到了真蜂蜜和掺假蜂蜜的差异物质，确定了掺假方式。
图1给出本发明所使用的zs去偶脉冲序列，图2给出本发明所使用的zs去偶脉冲层选拼接示意图。
本发明具体实施过程中的各个步骤如下：
(2)核磁共振谱图采集
由于单次采样得到的去偶fid信号很短，信号分辨率不够，因此，通过二维采样得到一系列包含去偶谱信息的fid。在检测期开始之前，由于180°组合脉冲的作用标量偶合演化被完全重聚掉，每一个fid的第一个数据点必须被连续的排列组合成为一个新的fid，实现这个非常简单，可以切割每个fid的数据点并将其拼接成为一个新的fid。之后再将fid通过傅里叶变换成为所需要的去偶谱图。
(3)实验数据预处理
将获得的zs去偶谱用mestrenova软件(version9.0)对谱图进行手动相位矫正、多点基线矫正等数据预处理操作，以tnnoesy谱图中所获得的tsp峰定标为δ＝0。在实验中，由于谱图中的水峰部分水峰部分(δ＝4.75～4.90)会变得不规则，因此要将这部分去除以免影响后续分析。对剩余部分以区域(δ＝0.50～9.0)进行等间隔积分，其中积分间隔为△δ＝0.01。之后对每一张谱图所得到的积分数据进行归一化处理，整理得到所有经过归一化处理的积分数据，将其转存入excel表格供后续建模分析。
(4)实验结果及分析
a.一维氢谱比较
如图3所示，分别为真假蜂蜜的去偶谱图和常规谱图。从常规谱图中可以看出，绝大多数谱峰都集中在δ3.0～4.2之间，在这段谱图中谱峰非常拥挤，重叠得很严重，对应于蜂蜜中所含有的大量的糖类物质，主要由葡萄糖以及果糖构成。比较去偶谱图和常规谱图，可以明显看出，β葡萄糖在δ3.25处的双重双重峰(dd)和在δ4.64的两重峰(d)经过去偶后均分别得到了一个单峰(s)，α葡萄糖在δ5.23处的两重峰(d)去偶后也得了单峰(s)，对于谱图中拥挤重叠的部分δ3.0～4.2，也在去偶后变得清晰易于辨认，谱图得以简化，显著地提高了谱图的分辨率。受限于zs较低的信噪比，强度较弱的谱峰无法获得，而强度较高的谱峰都可以在zs谱中归属得到。经过谱峰归属得到所含有的组分及其对应于常规谱图和去偶谱图中的谱峰化学位移值如表1所示。在图3中同样可以看到真蜂蜜和掺假蜂蜜的对比图，可以发现，因为蜂蜜样品本身组成成分复杂，不管是去偶前还是去偶后，从肉眼上都无法直接观测到差异。
表1
峰型：s:singlet,单峰；d:doublet,双峰；t:triplet,三重峰；dd:doubletofdoublets,双重双重峰；m:multriplet,多重峰。