目的建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法同时测定厄贝沙坦原料药中3种N-亚硝胺类基因毒性杂质(N-亚硝基乙基异丙胺、N-亚硝基二异丙胺和N-亚硝基二丁胺)。方法采用Agilent120PFP色谱柱(100mm×2.1mm,2.7μm),流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸(B),梯度洗脱,流速0.4mL·min-1,柱温40℃;采集模式为正离子,监测模式为质谱多反应监测。结果N-亚硝基乙基异丙胺、N-亚硝基二异丙胺和N-亚硝基二丁胺在各自线性范围内线性关系良好(R2≥0.9997),平均加样回收率分别为95.13%,92.00%和93.96%,RSD分别为4.22%,3.25%和3.60%。结论该方法简单、快速,灵敏度高,准确性强,重复性好,可用于厄贝沙坦原料药中N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测。
ObjectiveToestablishanHPLC-MS/MSmethodforthedeterminationofthreegenotoxicN-nitrosamineimpurities(N-nitrosoethylisopropylamine,N-nitrosodiisopropylamineandN-nitrosodibutylamine)inirbesartansimultaneously.MethodsAgilent120PFPcolumn(100mm×2.1mm,2.7μm)wasapplied.Themobilephasewasmethanol(A)-0.1%formicacid(B)ataflowrateof0.4mL·min-1withgradientelution.Thecolumntemperaturewassetas40℃.Andpositiveionwasusedastheacquisitionmode.Themultiplereactionmonitoring(MRM)wasusedasthemonitoringmode.ResultsN-nitrosoethylisopropylamine,N-nitrosodiisopropylamineandN-nitrosodibutylaminehadagoodlinearrelationshipwithintheirrespectivelinearranges(R2≥0.9997).Theaveragerecoverieswere95.13%,92.00%and93.96%,respectively;andRSDwere4.22%,3.25%and3.60%,respectively.ConclusionThemethodissimple,rapid,sensitive,accurate,andreproducible,whichcanbeusedforthedetectionofN-nitrosaminegenotoxicimpuritiesinirbesartan.
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Fig.1ChemicalstructureofeachsubstanceA.irbesartan;B.N-nitrosoethylisopropylamine;C.N-nitrosodiisopropylamine;D.N-nitrosodibutylamine.
随着LC-MS/MS技术的迅速发展,该技术被广泛应用于N-亚硝胺类基因毒性杂质检测。笔者在本研究建立同时检测厄贝沙坦原料药中N-亚硝基乙基异丙胺(N-nitrosoethylisopropylamine,NEIPA)、N-亚硝基二异丙胺(N-nitrosodiisopropylamine,NDIPA)和N-亚硝基二丁胺(N-nitrosodibutylamine,NDBA)的LC-MS/MS方法,并进行方法学验证。该方法简单,快速,灵敏度高,准确性强,适用于厄贝沙坦原料药中基因毒性杂质的检测,可为其质量控制提供参考。
高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司,配置LC-20AT二元泵);TripleQuad6500质谱仪(美国ABSCIEX公司);XS105型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司,感量:0.01mg)。
厄贝沙坦原料药(购于河北龙海药业有限公司,批号:S20200201,S20200202,S20200203);NEIPA对照品(批号:XH20-2477,含量:100%)、NDBA对照品(批号:XH20-2478,含量:100%)、NDIPA对照品(批号:XH20-2479,含量:100%)购于HIC公司;甲醇和甲酸为LC-MS级(Merck公司);水由屈臣氏提供。
2.1.1LC条件色谱柱为Agilent120PFP(100mm×2.1mm,2.7μm);流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)。采用梯度洗脱:0~3min,90%B;3~5min,90%→2%B;5~8min,2%B;8~10min,2%→90%B,最后以90%B平衡3min;流速0.4mL·min-1;柱温40℃。
2.1.2MS条件大气压化学电离(atmospherepressurechemicalionization,APCI)源,采集模式为正离子,监测模式为质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM),离子源温度350℃,脱溶剂气流量35mL·min-1。质谱检测条件见表1。
①isquantitativeion.
表13种N-亚硝胺类基因毒性杂质的质谱分析参数
Tab.1MSparametersofthreeN-nitrosaminegenotoxicimpurities
2.2.1对照品溶液的配制分别精密称取NEIPA、NDIPA和NDBA对照品各25mg,置25mL量瓶,以20%甲醇溶液溶解并定容至刻度,摇匀,即得对照品储备液。
2.2.2混合对照品溶液的配制分别精密量取“2.2.1”项对照品储备液适量,置同一量瓶,加溶剂稀释制成每毫升含NEIPA、NDIPA和NDBA均为100ng的混合溶液,作为混合对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的配制称取厄贝沙坦原料药100mg,置10mL量瓶,加甲醇2mL振摇使溶解,水定容至刻度,摇匀,即得。
Fig.2HPLC-MS/MSchromatogramsofspecificitytestA.blanksolution;B.samplesolution;C.mixedreferencesolution.
精密量取混合对照品溶液,加溶剂逐级稀释成不同浓度溶液。按“2.1”项色谱条件进样分析,以信噪比(S/N)=3为检出限,以S/N=10为定量限。结果显示,NEIPA、NDIPA和NDBA检出限分别为0.0337,0.0234和0.0611ng·mL-1,定量限分别为0.2013,0.0701和0.1014ng·mL-1。
精密量取混合对照品溶液0.02,0.1,0.2,0.5,1,5,10mL,分别置10mL量瓶,加溶剂稀释至刻度,作为线性溶液。按“2.1”项色谱条件分别进样分析,记录色谱图。以对照品溶液浓度为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,绘制标准曲线,结果见表2。实验结果表明,NEIPA、NDIPA和NDBA在各自线性范围内线性关系良好。
Tab.2LinearityresultsofthreeN-nitrosaminegenotoxicimpurities
精密量取对照品溶液,按“2.1”项色谱条件重复进样分析6次,记录色谱图。经计算,NEIPA、NDIPA和NDBA的RSD分别为1.3%,1.4%,2.0%,表明仪器精密度良好。
按“2.2.3”项配制供试品溶液,平行制备6份,按“2.1”项下色谱条件进样分析,记录色谱图。重复测定6次,结果表明,该方法重复性良好。
取供试品溶液和对照品溶液,室温下分别放置0,1,2,3,6,12h后,按“2.1”项色谱条件进样分析,记录色谱图。结果表明,对照品溶液和供试品溶液12h内稳定。
精密称取供试品100mg,共9份,置10mL量瓶,分别加甲醇2mL振摇使溶解,分别精密加入系列对照品溶液0.8,1.0,1.2mL各3份,溶剂定容至刻度,摇匀,按“2.1”项色谱条件进样分析,记录色谱图。测得量与加入量比值即为回收率。结果见表3,经计算得NEIPA、NDIPA和NDBA平均加样回收率分别为95.13%,92.00%和93.96%。
Tab.3RecoveryresultsofthreeN-nitrosaminegenotoxicimpurities
按“2.2”项对照品溶液与供试品溶液配制方法制备待测液,按“2.1”项色谱条件进样分析,记录色谱图。结果3批样品(批号:S20200201,S20200202,S20200203)均未检测到基因毒性杂质NEIPA、NDIPA和NDBA。
N-亚硝胺类基因毒性杂质浓度极低,因此为达到痕量分析测定要求,不仅需要克服灵敏度低、选择性差的问题,还需要排除溶剂基质干扰大等因素影响。本实验通过专属性、检测限、定量限、线性、精密度、重复性、加样回收率及稳定性等进行一系列的方法学考察,证明了所建方法专属性强、灵敏度高的特点,能够满足痕量N-亚硝胺类基因毒性杂质的定量检测需求。
同时,本研究通过改变色谱分析条件,如流速、柱温、流动相B的初始比例等,对本方法耐用性进行了考察,结果显示,微调色谱分析条件后,3种基因毒性杂质的峰面积基本一致,说明3种N-亚硝胺类基因毒性杂质的测定量基本一致,表明本方法的色谱条件耐用性良好。
本研究建立的HPLC-MS/MS法简单、快速、灵敏度高、准确性强、重复性好,适用于厄贝沙坦原料药中基因毒性杂质NEIPA、NDIPA和NDBA同时测定,可为其质量控制提供参考,并为临床用药安全提供保障。
2.1.1LC条件色谱柱为Agilent120PFP(100mm×2.1mm,2.7μm);流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水(B).采用梯度洗脱:0~3min,90%B;3~5min,90%→2%B;5~8min,2%B;8~10min,2%→90%B,最后以90%B平衡3min;流速0.4mL·min-1;柱温40℃....高效液相色谱-串联质谱法同时检测厄贝沙坦原料药及其片剂中3种-亚硝胺类基因毒性杂质12021...厄贝沙坦原料药(购于河北龙海药业有限公司,批号:S20200201,S20200202,S20200203);NEIPA对照品(批号:XH20-2477,含量:100%)、NDBA对照品(批号:XH20-2478,含量:100%)、NDIPA对照品(批号:XH20-2479,含量:100%)购于HIC公司;甲醇和甲酸为LC-MS级(Merck公司);水由屈臣氏提供.