高效液相色谱–质谱联用技术(HighPerformanceLiquidChromatography-MassSpectrometry,HPLC-MS)，即HPLC-MS联用技术。具有高选择性以及高灵敏度，在药物分析的鉴别、定量中可以显著提高方法的灵敏度，能最大限度减少干扰，满足基因毒性杂质痕量分析的要求，是近年基因毒性杂质检测常用的技术。它既可以有效整合多样化的结构信息，又能高效分离出待测物，特别适用其分离和结构识别。在当前的医学领域中，HPLC-MS联用技术之已成为研究杂质最有力的分析工具之一。
本文将从基因毒性杂质的分类、限度要求、各类基因毒性杂质在HPLC-MS中的应用及目前研究所面临的问题4个方面进行阐述，为基因毒性杂质的进一步研究提供参考。
2.基因毒性杂质的分类
EMA和FDA指南都认为利用警示结构去研究基因毒性杂质是有效方法之一。但需注意的是，具有警示结构的化合物不一定具有基因毒性，只是其含基因毒性的可能性比较高，需对其做进一步的毒理学评估。例如，吡啶类的氮氧化合物，近期有研究表明其引起基因毒性的可能性很小[14]，但由于其被列入警示结构，申报人在提交新药申请时，涉及到此类化合物都被要求评估其产生基因毒性的风险，大大增加了不必要的研究成本。
Table1.Commonwarningfunctionalgroups
A：烷基、芳香基或氢原子；Halogen：F，Cl，Br，I；EWG：吸电子基团，如氰基和羰基等。
Figure1.Structureofsupercompounds
3.基因毒性杂质的限度要求
限度要求
但需注意的是，TTC不能被认为是绝对安全的保障，在药物上市过程中，还是需要更加具体的毒性数据以及更灵敏的检测技术来确定基因毒性杂质的允许摄入量。2019年1月23日，国家药典委员会根据我国国情发布了《关于<中国药典>2020年版四部通则增修订内容的公示》，新增了内容“遗传毒性杂质控制指导原则审核稿”，其对药物基因毒性杂质的分类和控制做了进一步的指导[16]，本指导原则包括了危害评估方法、可接受摄入量计算方法和限值制定方法。表明我国在原料药以及药物制剂中基因毒性杂质的限度控制上应该更加严格规范。
Table2.AcceptablelimitsforgenotoxicimpuritiesspecifiedbyEMAandFDAinstages
4.不同类型的基因毒性杂质的研究
药物中的基因毒性杂质必须控制在低于0.01%~0.03%的限度内[17][18]。这就需要使用高灵敏度的分析仪器，同时还要求检测方法具有更高的选择性。HPLC-MS作为杂质分析最有力的工具之一，近年来已广泛应用于基因毒性杂质的检测。下面是常见的一些基因毒性杂质的检测实例：
4.1.亚硝胺类化合物
N-亚硝基吡啶烷N-二甲基亚硝胺N-二乙基亚硝胺N-二丙基亚硝胺
Figure2.StructuresofGTIsinnitroamine
Figure3.Syntheticrouteofticagrelor
4.2.磺酸酯类化合物
Figure4.Structureofcommonmethanesulfonicacidgenotoxicimpurities
4.3.肼类化合物
Figure5.Thestructureofcommonhydrazinecompoundsgenotoxicimpurities
4.4.其他类型的基因毒性杂质
Figure6.StructureofcommonazaarylN-oxidegenotoxicimpurities
5.目前基因毒性杂质研究所面临的问题
5.1.基因毒性杂质的限度低
基因毒性杂质检测时，由于其限度较低，要达到所需要的检测限，就必须要配制高浓度的供试品溶液。然而，高浓度的供试品溶液可能会面临堵塞色谱柱、污染离子源、以及基质效应等问题，检测难度大大增加[30]。同时其检测一般使用气质联用或者液质联用技术，对于药企来说，检测成本增加。在实际操作时，上述问题可通过改变溶剂的组分使供试品溶液成分析出，将高浓度的基质除去，以降低基质干扰。
5.2.基因毒性杂质的种类繁多且理化性质差异较大
一个药物中可能含有多种类型的基因毒性杂质，在进行测定时，可能就需要建立多种检测方法对其分别进行测定，将得到的检测结果进行对比，相互补充，才能满足其检测要求。
5.3.基因毒性杂质的稳定性较差
由于基因毒性杂质大多数具有活泼的官能团，自身容易发生氧化、水解或还原反应，或者与其他物质发生反应，故在测定时需进行衍生化或加入稳定剂[31]。
5.4.基因毒性杂质的溶解性
为了确保检测结果的可靠性，一般要求选择合适的溶剂体系，既要使潜在的基因毒性杂质完全溶解，同时也要保证所选择的溶剂对待测物质无干扰。
5.5.杂质评估不充分
5.6.计算机理论预测比较单一化
对于未经检测的降解杂质产物不应仅根据计算机或理论预测进行研究，而应重点研究通过强制性降解试验、加速或长期稳定性研究观察到的降解途径和主要降解产物[32]；目前关于如何识别、预测和处理合成过程中形成的基因毒性杂质的文献报道较多，如替尼类药物的N-氧化物、硝基苯催化氧化还原反应及副反应的控制、过渡金属杂质的处理等，但目前还没有统一的策略和方法，已经成为制约国内基因毒性杂质研究的瓶颈。
6.结语
充分的杂质研究是制定科学合理的质量标准的基础，也是药品安全、有效、质量可控的重要保证。加强药品研发和质量控制，特别是对药品中所含基因毒性杂质的有效控制，将其限度控制在一个可接受的范围内，保证药品质量，减少不良反应的发生。是当前的首要任务。
HPLC-MS联合技术具有分离效率高、速度快、灵敏度高、选择性好等优点。它不仅具有色谱的优点，而且可以给出丰富的结构信息，提高其定性能力，可以寻找和鉴定药物中基因毒性杂质的最佳条件，是目前有效控制药物质量的最重要的分析工具之一。同时，在药物定性鉴定、体内代谢物研究、中药复杂成分分析等领域发挥着重要作用。随着色谱及其联用技术的不断进步，各种技术相互配合和补充，将成为未来药物杂质研究的主流。