依据载体的不同，可将基因治疗制品分为以病毒为载体的基因治疗制品，以质粒DNA为载体的基因治疗制品，以及以细菌为载体的基因治疗制品，其中以病毒和质粒DNA为载体的基因治疗制品为常见。
2.制造
2.1基本要求
2.2载体的设计与构建
2.3起始原材料
以下是对生产用起始原材料质量控制的一般要求，对不同的制品和生产工艺还需结合具体情况考虑。
2.3.1病毒种子批
2.3.2哺乳动物细胞库
生产/包装细胞系进行的检测应包括鉴别及纯度、基因分型/表型、成瘤性/致瘤性、遗传稳定性、引入序列的鉴别和完整性以及拷贝数等。
生产/包装细胞库内、外源病毒因子的检测应根据本版药典要求进行。应确定无细菌、真菌、支原体和螺原体（昆虫细胞）等污染。
2.3.3细菌种子批
细菌种子批的质控项目通常包括菌落形态、染色镜检、生化特性、抗生素抗性检查、电镜检查、质粒限制性酶切图谱分析等。应确保不存在其它细菌、真菌和噬菌体的污染。应检测细菌种子批多次传代后的基因型和表型的稳定性。此外，对于基因修饰的细菌，其基因组重要区域（如引入的治疗和调控元件，以及被人为改造的任何区域及其侧翼至少0.5kb内的区域）的序列应与理论预期相符。对于经基因改造的质粒不大于50kb的，应进行全序列测定。对于转导质粒的细菌种子批，应检测质粒拷贝数和有/无质粒细菌的比例。对于生产质粒用途的细菌种子批，应检查质粒产率。对于引入的治疗基因，应检测其表达水平和功能活性。对于减毒细菌载体，应鉴定其减毒的特性和稳定性，并检测其抗生素敏感性。
2.3.4质粒DNA
2.4原材料及辅料
用作病毒或DNA载体递送系统的复合材料必须符合其预期目的，并具有良好的工艺稳定性和产品稳定性。应根据其具体性质和对制品的影响情况进行适当鉴定，并建立相应的检测方法和质控要求。
2.5生产过程的控制
2.4.1病毒/细菌培养物的制备
2.4.1.1病毒培养物的制备
（1）细胞培养
（2）病毒增殖和收获
接种病毒时应明确病毒感染滴度与细胞的最适比例，同一工作种子批按同一MOI接种。
采用多质粒瞬时转染或加入辅助病毒等生产病毒的方式，也应明确加入量与细胞的最适比例。除另有规定外，接种病毒后维持液不得再添加牛血清、抗生素等成分。
应根据生产过程中培养、增殖和产物产量一致性的研究资料，确定终止培养、收获产物的技术参数。每次收获后应检测目标产物含量、细菌内毒素、支原体等。应根据生产过程及所用材料的特点，在适宜的阶段进行常规或特定的外源病毒污染检查。
2.4.1.2细菌培养物的制备
（1）细菌培养
将工作种子接种于规定的培养基进行培养扩增。自菌种开启到菌体收获应有明确的扩增次数规定。细菌培养过程中可进行细菌纯度、细菌总数、pH值及耗氧量等监测。
（2）菌体的收获
根据不同的培养方式采用适宜的方法收获菌体。培养物收获后应进行细菌纯度、细菌总数、活菌含量等检测。
2.4.2提取和纯化
采用的分离纯化方法或技术，应能适应于规模化生产并保持稳定。应对纯化工艺中可能残存的有害物质进行严格控制，包括固定相或者流动相中的化学试剂、各类亲和色谱柱的脱落配基或抗体以及可能对目标制品关键质量属性造成影响的各种物质等。
纯化工艺应保证将制品的一些特定工艺杂质去除或降低至可接受的水平，包括来自表达载体的核酸、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、污染的外源因子、细菌内毒素、核酸蛋白酶以及源自培养液的各种其他残留物等。
2.4.3原液
2.4.4复合工艺控制
对于复合的基因治疗制品，其复合材料的生产以及复合的过程应根据具体的产品情况和工艺特点设置适宜的工艺参数和过程控制要求，以保持工艺稳定性和产品质量的一致性。
2.4.5半成品
除另有规定外，制备成品前，如需对原液进行稀释或加入其他辅料制成半成品，应确定半成品的质量控制要求，包括检定项目和可接受的标准。
2.4.6成品制剂
2.4.7包装及密闭容器系统
2.5生产工艺变更
3.特性分析
应采用先进的分析手段，从生物学、分子生物学、免疫学、物理化学等角度，对基因治疗制品的基因型和表型、纯度、治疗序列活性/生物效价、感染性/转导效率和预期用途的适用性等进行全面的分析，并提供尽可能详细的信息，以反映目标制品内在的质量属性，并作为建立并制定上市制品质量标准的基础。特性分析应包括对原材料、中间体、原液和成品特性的分析。对于复合核酸载体，应充分研究载体、复合组分和复合物的特性。特性分析数据可能来自整个开发和/或制造过程。对于不同阶段（开发、试生产、完整规模生产等）生产的产品批次可根据不同情况开展适宜程度的特性分析研究，其中用于制定上市制品质量标准的产品批次工艺应代表预期的上市制品工艺。
特性分析一般在研发阶段进行，并通过生产工艺的优化，以及具有代表性的足够批次制品的周期性监测加以完善。
特性分析至少应包括以下内容：
3.1结构分析
3.2生物学活性
3.3纯度、杂质和污染物
3.3.3污染物
污染物系指所有引入且并非生产过程所需的物质（如各种微生物、细菌内毒素）。应严格避免引入污染物并对其进行相应控制。
3.4含量
应建立基因治疗制品物理数量和生物数量的含量检测指标。可以通过诸如总颗粒数、感染性滴度或感染性颗粒数、基因组DNA/RNA或质粒DNA浓度等的检测来确定含量。可通过物理、生物物理等方法来测量颗粒的物理数量，或测量病毒颗粒内已知分子量和拷贝数的某种代表性的结构蛋白来评估病毒颗粒数。感染性滴度或感染性颗粒数可采用噬斑形成单位（PFU）、半数组织培养感染剂量（TCID50）等基于细胞的体外检测方法。对于病毒载体，应控制总颗粒数与感染性滴度或感染性颗粒数的比例。应尽可能使用标准品或对照品来校准含量测定结果。通过方法学研究确定用于制品放行检定的含量测定方法。
3.5其他特性
通常应评估颗粒或分子大小的平均值和分布、聚集体以及折射率等多种理化和其他特性及其与制品安全、有效性的关系，必要时应将其纳入制品检定项目中。
病毒载体类基因治疗制品，还应对病毒的感染性、毒力、复制能力等特性进行分析。应分析载体脱落，载体复制，插入突变，内源性病毒再激活或与内源性病毒互补的可能性，以及对安全性的影响。
细菌载体类基因治疗制品，应测定其质粒拷贝数和含/不含质粒细菌的比例。应分析表型、免疫学特性（包括遗传修饰的细菌成分）以及由细菌载体递送的治疗序列和选择/调控元件等。
4.标准品/参比品/对照品
对于效价、感染性滴度等活性检测方法，应建立具有长期稳定性的活性标准品/参比品。
对于鉴别试验、颗粒数等各种理化分析，可选择已证明足够稳定且适合临床试验的一个（多个）批次，或用一个代表批次作为参比品/对照品，并应按特性分析要求进行分析鉴定。在采用PCR或定量PCR方法的检定项目中所用到的质粒DNA或核酸对照品，在制备和分装后应进行适宜的分析鉴定。
5.制品检定
应根据制品关键质量属性、对制品和工艺的深入了解和风险评估的原则，制定相应质量控制策略。制品检定采用的检测方法应经验证或确认并符合要求。纳入质量标准的检定项目、可接受限度，应结合特性分析数据、临床前和/或临床研究多批次样品的数据、工艺验证批次的数据、稳定性研究数据等综合确定。基因治疗制品的质量检定至少应包括以下项目，但对不同的制品和生产工艺还需结合具体情况加以考虑。
5.1鉴别试验
根据基因治疗制品的情况，应在核酸序列水平采用限制性酶切图谱分析、PCR、RT-PCR和核酸序列测定等方法对载体组成、治疗序列、缺失片段以及其他影响治疗序列表达的重要部分进行鉴定。还可同时在蛋白水平采用蛋白电泳、免疫印迹、免疫中和试验等方法，对结构蛋白、表达产物、免疫标记、表型特征等进行鉴别。对于复合的核酸制品，应对相应的脂质等复合成分进行鉴别试验。相应的鉴别试验检测中应设置适宜的阳性和阴性对照样品。
5.2纯度和杂质
应采用类似正交组合的方法来评估制品的纯度/杂质。
5.2.1总纯度
适用的情况下，应采用高效液相色谱（HPLC）、SDS-PAGE、紫外吸收（如OD260/OD280比值测定）等方法评估产品的总纯度水平。
5.3效价
根据制品具体情况应建立至少一个反映疗效的生物效价指标。效价测定通常包括对基因转移效率（感染性/转导效率/传递效率）、治疗序列表达的水平、表达产物的功能或整个制品的直接活性（例如肿瘤细胞杀伤活性等）的测定。效价应尽可能采用定量的方法测定。首选体外生物效价检测方法，如体外感染、转染或转导易感细胞后，对表达产物的功能测定（例如测定酶活性、细胞生长的刺激或抑制等）。当转基因表达的生物学功能表现出的活性范围过宽或仅能产生半定量甚至仅为定性结果时，可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他定量方法测定治疗序列的表达水平，作为补充的效价测定方法。体外方法不可行时，可采用动物离体组织或动物体内检测方法，必要时可采用转基因动物或移植了人体组织或系统的动物。
效价测定需要采用相应的活性标准品或参比品，用于计算供试品的相对效价或作为对照。
5.4含量
根据制品组成情况，应对总颗粒数、感染性滴度或感染性颗粒数、基因组DNA/RNA或质粒DNA的量或浓度进行适宜的组合来测定原液和成品的含量，并用参比品或对照品进行比较计算或作为对照。在制品为病毒载体的情况下，还应进行总颗粒数与感染性滴度与感染性颗粒数比例的测定和控制。
5.5一般安全性试验
根据制品的具体情况而定，检测应至少包括无菌检查、细菌内毒素检查、异常毒性检查等。
5.6其他检测项目
根据制品的具体情况或具体剂型，通常的检测项目可包括外观、颜色、澄清度、可见异物、不溶性微粒、pH值、渗透压摩尔浓度、装量、水分、赋形剂、粒度和粒度分布、乳光、折射率、zeta电位、包封率、释放效应等。
6.贮存、有效期和标签
基因治疗制品贮存应符合“生物制品贮藏和运输规程”规定，成品应在适合的环境条件下贮存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
（2）每瓶的活性单位（如必要）；
（3）每瓶有效成分含量；
（4）每瓶标示体积（液体制剂）；
（5）批号和有效期。
起草单位:中国食品药品检定研究院---重组药物室
联系方式:010-67095684
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