用于治疗胶质细胞瘤(GBM)和其它癌症的肿瘤相关肽组合物及相关抗癌疫苗（CN200980139420.5）

分类号A61K39/00;A61P35/00;A61K38/08;A61K38/16;

代理机构上海天翔知识产权代理有限公司;

代理人刘粉宝

地址德国蒂宾根

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

2022-09-23

专利权的终止

2015-01-07

2011-10-12

实质审查的生效IPC(主分类):A61K39/00申请日:20090928

实质审查的生效

2011-08-31

公开

发明内容

为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。

发明背景

胶质母细胞瘤的肿瘤细胞是脑肿瘤中分化最低的肿瘤细胞，所以，肿瘤细胞很可能迁移和增殖，并且具有高度的侵袭性，从而导致预后非常差。由于胶质母细胞瘤在大脑中呈快速、侵袭性及浸润性生长，因此会导致死亡。浸润性生长模式导致这些肿瘤具有不可切除的特性。同时，胶质母细胞瘤对放疗、化疗也具有相对的抗性，因此，治疗后复发率高。此外，在手术切除和放疗后，肿瘤细胞的免疫反应对彻底消除肿瘤细胞无效。

胶质母细胞瘤分为原发性胶质母细胞瘤(新肿瘤)和继发性胶质母细胞瘤，这取决于在未分化星形胶质细胞或胶质前体细胞的恶性转化期间基因机制上的差异。继发性胶质母细胞瘤发生在年龄最大达45岁的较年轻的人群中。平均在4到5年期间，继发性胶质母细胞瘤从低级别的星形细胞瘤发展为未分化的星形细胞瘤。相比之下，原发性胶质母细胞瘤主要发生在较年长的人群中，平均年龄为55岁。一般来说，原发性胶质母细胞瘤作为暴发性胶质母细胞瘤而发生，特点是在3个月内就可从无任何临床或病理异常状态进展为胶质母细胞瘤。

胶质母细胞瘤沿有髓神经迁移并在中枢神经系统中广泛扩散。在大多数情况下，手术治疗持续疗效有限。

恶性胶质瘤细胞通过产生免疫抑制物、削弱T细胞的增殖以及免疫刺激因子IL-2的产生，从而逃逸宿主免疫系统的侦测。

颅内肿瘤可发生于CNS的任何结构或细胞类型，包括脑、脑膜、脑垂体、头骨、甚至残留的胚胎组织。在美国，原发性脑肿瘤的总体年发病率是每10万人中有14例。最常见的原发性脑肿瘤为脑膜瘤，占所有原发性脑肿瘤的27％，以及胶质母细胞瘤，占所有原发性脑肿瘤的23％(而成人中，胶质母细胞瘤占恶性脑瘤的40％)。这些肿瘤中，很多都具有侵袭性，并且级别高。原发性脑肿瘤是儿童中最常见的实体瘤，在儿童中，是仅次于白血病的第二位最常见癌症死亡原因。

结直肠癌

根据美国癌症协会的报道，在美国，结直肠癌(CRC)是排在第三位的最常见癌症，受罪的新患者每年超过175,000名。在美国、日本、法国、德国、意大利、西班牙和英国，每年有超过480,000例患者罹患该疾病。它是发达国家癌症死亡的最常见原因之一。研究表明，结直肠癌的发病是遗传和环境因素之间相互作用的结果。在大多数病例中，结直肠肿瘤似乎由腺瘤息肉演变而来；但是这个演变过程可能需要很多年。结直肠癌的主要风险因素是年龄，90％的病例在50岁之后诊断患有此病。根据美国癌症协会的报道，结直肠癌的其它风险因素包括饮酒、饮食中脂肪和/或红色肉类含量高、水果和蔬菜的摄取量不足。结直肠癌的发病率持续上升，特别是日本等地区，这些地区接受西化饮食，摄入过多的脂肪和肉类而纤维摄入量减少，这些因素可能是罪魁祸首。但是发病率的上升速度不如以前快，这可能是由于进行了更多的筛查和息肉切除从而防止了息肉发展成为癌症。

像大多数实体肿瘤的治疗，一线治疗为手术治疗，然而，手术受益者仍局限于早期患者，而很大一部分患者在确诊时已是晚期。基于氟尿嘧啶的化疗方案是晚期结直肠癌的标准治疗。这些治疗方案的大多数为所谓的FOLFOX方案(输注5-FU/亚叶酸+奥沙利铂)和FOLFIRI(伊立替康、亚叶酸，团注和连续输注5-FU)方案。

第三代细胞毒素类药物的引入，如伊立替康和奥沙利铂，增加了显著改善疗效的希望，但预后仍较差，转移癌的存活率一般仍只有大约20个月，因此，治疗该疾病的需求仍远未满足。

最近出现了新一代药物，即靶向分子药物，如阿瓦斯丁(贝伐单抗)和爱必妥(西妥昔单抗)，而且大约有40种针对不同阶段结直肠癌的化合物处于后期临床开发阶段。这些化合物中的几种相结合可增加未来潜在治疗选择的数量。绝大部分药物都处于开发的2期阶段，这些化合物与开发中的任何其它结直肠癌药物相比，更经常地针对表皮生长因子受体(EGFR)，这是由于在约80％的结直肠癌患者中，EGRF表达都上调。

对II期患者采用化疗结合最近批准的单克隆抗体(mAb)(西妥昔单抗+伊立替康或FOLFOX4；贝伐单抗单药或与FOLFOX4联合)的临床试验目前正在进行。经过三至四年的观察，预计这些试验会得出有统计学意义的结果。

目前肿瘤科所用的单克隆抗体(mAb)一般都很可能不会干扰积极免疫治疗。事实上，有临床前证据表明，用贝伐单抗去除VEGF是DC-介导的T细胞激活的积极结果。

前列腺癌和其它肿瘤

据估计，2007年有27050人死于前列腺癌，它是男性癌症死亡的首要原因。虽然自20世纪90年代初以来，其死亡率在白人和非裔美国男性中一直下降，但是，非裔美国男性的死亡率仍然比白人男性高两倍以上。前列腺癌是男性中最常见的癌症。非裔美国男性的发病率显著高于白人男性，其原因不明。在过去20年里，前列腺癌的发病率发生了很大的变化：在1988-1992年期间迅速上升、1992-1995年期间急剧下降、自1995年以来略有增加。这些趋势在很大程度上反映了采用前列腺特异抗原(PSA)血液检查进行前列腺癌筛查的增加。过去10年中发病率增加趋缓最有可能是由于在65岁以上的男性中普遍开展PSA筛查。在65岁以上的男性中，前列腺癌的发病率趋于稳定。在白人男性中，发病率于1992年达到高峰(每100000人男性中有237.6人)，而在非裔美国男性中，于1993年达到高峰(每100000人男性中有342.8人)。

前列腺癌的治疗包括观察等待、手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、冷冻手术、激素治疗、或一些组合疗法。哪种方案最佳取决于疾病的阶段、Gleason评分和PSA水平。其它重要因素是男性的年龄、一般健康状况、以及对潜在治疗及其可能副作用的感觉。由于所有的治疗均可能有一定的副作用，如：勃起功能障碍和尿失禁，因此治疗讨论往往注重于治疗目标与生活方式改变风险之间的平衡。

如果癌症已扩散出前列腺，治疗选择会发生明显的变化，因此，大多数治疗前列腺癌的医生使用各种诺模图来预测扩散概率。观察等待、HIFU、放射治疗、冷冻手术和外科手术一般在癌症仍然局限在前列腺内的男性中进行。激素疗法和化疗常常在疾病已经扩散出前列腺的患者中进行。但是，也有特例：对于一些晚期肿瘤，可使用放射治疗，对于一些早期肿瘤，可使用激素治疗。如果初始的治疗失败并且癌症进展，也可使用冷冻疗法、激素疗法、化疗。

在所有前列腺癌中，有90％以上在发现时处于局部性和区域性阶段；肿瘤在此阶段确诊的患者5年相对存活率接近100％。在过去25年中，所有阶段肿瘤组合在一起的5年存活率从69％上升至接近90％。根据最新的数据，10年相对存活率为93％，15年相对存活率为77％。存活率，特别是5年存活率的巨大提升，部分归因于早期诊断和治疗的改进。但是，在肿瘤扩散至其它组织和器官后，患者的存活率显著下降。

肺癌

2007年美国预计新发病例为21万例，约占确诊癌症病例的15％。男性发病率显著下降，从1984年的每10万人102例高点，下降到2003年的78.5例。在女性中，这一发病率在一段长期的增长之后正趋向于平稳。为了治疗之目的，临床上肺癌分为小细胞肺癌(13％)和非小细胞肺癌(87％)。

治疗选择根据癌症的类型(小细胞和非小细胞肺癌)和阶段进行确定，包括手术、放疗、化疗、靶向生物治疗，如贝伐单抗和埃罗替尼对于局部癌，通常选择外科手术治疗。最近的研究表明，手术随后化疗可提高早期非小细胞肺癌的存活率。由于该疾病在发现时通常已经扩散，因此，常常使用放射和化疗，有时与手术联合使用。化疗单疗或与放疗结合是治疗小细胞肺癌的通常选择；采用这一方案，有很大比例的患者获得缓解，在一些病例中，缓解为持久缓解。

肺癌的1年相对存活率在1975-1979年期间为37％，至2002年，略上升至42％，这主要是由于手术技术的改进和组合疗法的使用。然而，所有阶段的肺癌组合在一起，5年存活率仅为16％。对于疾病在检出时仍为局部性的病例，存活率为49％；但是仅有16％的肺癌在此早期得到确诊。

表1：2007年美国按性别估计的新发癌症病例和死亡人数(AmericanCancerSociety.CancerFacts&Figures2007.Atlanta：AmericanCancerSociety；2007.)

因此，对于胶质母细胞瘤、前列腺肿瘤、乳腺癌、食管癌、结直肠癌、透明细胞肾细胞癌、肺癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鳞状细胞癌、白血病和髓母细胞瘤以及表现出过度表达生存素的其它肿瘤仍然需要有效且安全的新治疗方案，从而在不使用化疗药物或其它可能导致严重副作用的药物的情况下，增强患者的安康。

发明的详细说明

除非另有说明，否则本文使用的所有术语具有下述定义。本文所用“肽”这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常通过α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。这些肽的长度优选为9个氨基酸，但长度至短可为8个氨基酸，至长可为10、11、12、13、14、15、16、17、或18个氨基酸。

本文所用“寡肽”这一术语，系指一系列氨基酸残基，通常通过α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。寡肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要在寡肽中保持正确的表位即可。通常，寡肽长度约小于30个氨基酸残基，约长于14个氨基酸。术语“多肽”系指一系列氨基酸残基，通常通过α-氨基酸与相邻氨基酸的羰基团之间的肽键相互连接。多肽的长度对于本发明来说并不十分关键，只要保持正确的表位即可。

与术语肽或寡肽相对，术语“多肽”是指包含多于约30个氨基酸残基的分子。

肽、寡肽、蛋白质或编码此类分子的核苷酸如果能诱导免疫反应，则具有“免疫原性”(因此是本发明中的一种“免疫原”)。在本发明的情况下，免疫原性的更具体定义是诱导T细胞反应的能力。因此，“免疫原”是一种能够诱导免疫反应的分子，并且在本发明的情况下，是一种能诱导T细胞反应的分子。

T细胞“表位”要求的是一种结合至MHCI或II类受体上的短肽，从而形成一种三元复合体(MHCI类α链、β-2-微球蛋白和肽)，其可由载有以相应亲和力结合至MHC/肽复合体的匹配T细胞受体的一种T细胞进行识别。结合至MHCI类分子的肽的典型长度为8-14个氨基酸，最典型为9个氨基酸长度。与MHCII类分子结合的T细胞表位长度通常为12-30个氨基酸。对于表位结合至MHCII类分子的情况，同一个肽与相应的T细胞表位可共享一个共同的核心节段，但是由于核心序列的氨基末端上游和核心序列的羧基端下游的侧翼序列分别具有不同的长度，因而总体长度不同。MHCII类受体具有更开放的构造，结合至MHCII类受体上的肽相应地不完全埋没于MHCII类分子的肽结合槽裂结构中，因为它们位于MHCI类分子的肽结合槽裂之中。出人意料的是，对于根据SEQIDNO：1的肽，情况并非如此，因为肽长度的微小差异会导致活性的极度降低(见下文)。

在人类中，有三种编码MHCI类分子的不同基因位点(人MHC分子也是指定的人白细胞抗原(HLA))：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-A*11是可从这些基因位点表达的不同MHCI类等位基因的例子。

MHCII类基因的人基因组有三种不同基因位点：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。MHCII类受体是异源二聚体，包含一个α链和一个β链，两者均通过跨膜区在细胞膜中锚定。HLA-DRB1*04和HLA-DRB1*07是两种不同的MHCII类β等位基因的例子，它们已知在这些位点被编码。II类等位基因非常多态，例如，已经描述的有数百种不同的HLA-DRB1等位基因。对于HLA-A*02和最常见的HLA-DR血清型，不同人群中的表达频率如表2所示。

表2：HLA-A*02和最常见HLA-DR血清型的表达频率F。频率根据Mori等人(Morietal.，1997)使用的Hardy-Weinberg公式F＝1-(1-Gf)2改编，由美国人群范围内的单体型频率推导出。由于联结不平衡，A*02与某些HLA-DR等位基因的组合可能是浓缩的或频率低于其预期单一频率。有关详细信息，请参阅Chanock等人的文献(Chanocketal.，2004).

因此，为了治疗和诊断目的，与数种不同HLAII类受体以合适亲和力结合的肽是高度可取的。与数种不同HLAII类分子结合的肽被称为混杂结合剂。

本文提到的DNA序列既包括单链DNA也包括双链DNA。因此，除非本文另有所指，否则具体的序列是该类序列的单链DNA、该类序列与其互补序列的双工(双链DNA)以及该类序列的互补序列。术语“编码区”系指在自然基因组环境中自然或正常编码基因表达产物的那一基因部分，即，体内编码该基因的天然表达产物的区域。

编码区可来自正常基因、突变基因或异常基因，甚至还可以来自DNA序列，完全可在实验室中使用本领域熟知的DNA合成方法合成。

术语“核苷酸序列”系指脱氧核苷酸的杂聚物。

编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可为天然核苷酸序列，也可为合成核苷酸序列。

一般来说，编码肽、多肽以及本发明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸衔接物，或一系列寡核苷酸组成，以提供一种合成基因，该基因能够在包含源自微生物或病毒操纵子的调节元素的重组转录单元中被表达。

术语“表达产物”系指多肽或蛋白，它是基因序列和任何核酸序列的翻译产物，这些序列编码遗传密码退化所造成的同等物，从而编码同样的氨基酸。

术语“片段”当指的是一种编码序列时，表示包含少于完整编码区的DNA的一部分，其表达产物与完整编码区表达产物基本上具有相同的生物学功能或活性。

术语“DNA片段”系指一种DNA聚合物，以单独的片段形式或一种较大DNA结构的组分形式存在，它们至少从分离过一次的DNA中以基本纯净的形式获得，即，未污染内源性材料并且其数量或浓度使得能使用标准生化方法(如，使用克隆载体)识别、处理和回收片段及其组分核苷酸序列。此等片段以开放阅读框架(未被内部非翻译序列打断)或内含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。非翻译DNA序列可能存在于开放阅读框架的下游，在那里其不会干预编码区的操纵或表达。

术语“引物”表示一种短核酸序列，可配有一个DNA链，并在DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链的地方含有一个游离的3′OH端。

术语“启动子”表示参与RNA聚合酶的结合从而启动转录的DNA区域。

“开放阅读框架(ORF)”这一术语是指编码无终密码子的氨基酸的一系列三联体，并且是一种(潜在地)可翻译成蛋白质的序列。

术语“分离”表示一种物质从其原来的环境(例如，如果是天然发生的则是天然环境)中被移走。例如，活体动物中的天然核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中一些或所有共存物质中分离出来的核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可能是载体的一部分和/或此类多核苷酸和多肽可能是一种组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境的一部分，因此它仍然是分离的。

根据本发明披露的核酸和多肽表达产物，以及包含此类核酸和/或多肽的表达载体可能以“浓缩的形式”存在。本文中所使用的术语“浓缩”系指材料的浓度至少是其自然浓度的大约2、5、10、100或1000倍，更方便地来说，即按体重计为0.01％，优选为至少0.1％。也明确考虑到，按重量计约为0.5％、1％、5％、10％和20％的浓缩制剂。序列、构型、载体、克隆物以及包含本发明的其它材料可有优势地以浓缩或分离的形式存在。

“活性片段”这一术语是指产生免疫反应的片段(即具有免疫原性活性)，不论是单独或可选地与合适的佐剂一起给予一种动物，比如哺乳动物，例如兔子或小鼠，也包括人；这种免疫反应采用的形式是在接受动物(如：人)体内刺激T细胞反应。或者，“活性片段”也可用于诱导体外T细胞反应。

根据本发明，术语“百分比同一度”或“百分比同一”，如果指的是序列，则表示在拟对比序列(“对比序列”)与所述序列或权利要求的序列(“参考序列”)排队比对后，把一种序列与所述序列或权利要求的序列进行比较。然后根据下列公式计算等同度百分比：

等同度百分比＝100[I-(C/R)]

其中C是参考序列与被对比序列之间对准长度上参考序列与被对比序列之间的差异数量，其中

(i)参考序列中每个碱基或氨基酸序列在被对比序列中没有对应的对准碱基或氨基酸；

(ii)参考序列中每个空隙，以及

(iii)参考序列中每个对准碱基或氨基酸与被比对比序列中对准碱基或氨基酸不同，即构成一个差异；

并且R是参考序列与被对比序列对准长度上在参考序列中产生任何空隙也计算为一个碱基或氨基酸的参考序列中的碱基或氨基酸数目。

如果“被对比序列”和“参考序列”之间存在的一个对准按上述计算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，则被对比序列与参考序列具有指定的最低等同度百分比，虽然可能存在按本文上述计算的等同度百分比低于指定等同度百分比的对准。

在本文中，保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1-小脂肪族、非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2-极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3-极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4-大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5-大芳香残基(Phe，Tyr，Trp)。

较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。高度不保守的取代可能涉及一个酸性氨基酸被另一个具有极性或甚至具有碱性性质的氨基酸所取代。然而，这种“激进的”取代不能认为是无效的而不予考虑，因为化学作用是不完全可预测的，激进的取代可能会带来其简单化学原理中无法预见的偶然效果。

当然，这种取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其它结构。因此，D-氨基酸可能被本发明的抗原肽中常见的L-氨基酸取代，也仍在本公开的范围之内。此外，具有非标准R基团的氨基酸(即，除了天然蛋白的20个常见氨基酸之外的R基团)也可以用于取代之目的，以生产根据本发明的免疫原和免疫原性多肽。

如果在一个以上位置上的取代发现导致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定义值，则对这些取代的组合进行测试，以确定组合的取代是否产生对肽抗原性的叠加或协同效应。肽内被同时取代的位置最多不能超过4个。

术语“T细胞反应”是指由一种肽在体外或体内诱导的效应子功能的特异性扩散和激活。

对于MHCI类限制性CTL，效应子功能可能为溶解肽脉冲的、肽前体脉冲的或天然肽提呈的靶细胞、分泌细胞因子，优选为肽诱导的干扰素γ、TNF-α或IL-2，分泌效应分子、优选为肽或脱颗粒作用诱导的颗粒酶或穿孔素。对于MHCII类限制辅助性T细胞效应子功能可能为肽诱导的细胞因子分泌，优选为，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL5、IL-10或IL-2或肽诱导的脱颗粒作用。CTL和辅助性T细胞的可能效应子功能不仅限于此列表所述功能。

免疫治疗方法

细胞免疫反应的特定元素能特异性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的细胞毒性T-细胞(CTL)表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别细胞液8至10个源自蛋白或缺损核糖体产物(DRIPS)(SchubertU，AntónLC，GibbsJ，NorburyCC，YewdellJW，BenninkJR.；Rapiddegradationofalargefractionofnewlysynthesizedproteinsbyproteasomes；Nature2000；404(6779)：770-774)的残基中载有主要组织相容性复合体(MHC)的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。

MHCII类分子，主要发现于专职抗原提呈细胞(APC)上，并主要提呈内吞作用过程中被APC摄取并随后被加工的外源性蛋白肽。

哺乳动物(如小鼠)模型显示，即使没有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应细胞(如，CD8阳性T淋巴细胞)，CD4阳性T细胞也能通过分泌干扰素-γ(IFNγ)抑制血管生成，从而抑制肿瘤的出现(Qin，Z.andT.Blankenstein.CD4+T-cell-mediatedtumorrejectioninvolvesinhibitionofangiogenesisthatisdependentonIFNgammarecepto

由于HLAII类分子的组成性表达通常仅限于免疫系统的细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离II类肽被认为是不可能的事。然而，发明家最近成功地在肿瘤中直接识别了MHCII类表位(EP1642905，EP1760088；DengjelJ，NastkeMD，GouttefangeasC，GitsioudisG，SchoorO，AltenberendF，MüllerM，B，MissiouA，SauterM，HennenlotterJ，WernetD，StenzlA，RammenseeHG，KlingelK，S.；UnexpectedabundanceofHLAclassIIpresentedpeptidesinprimaryrenalcellcarcinomas；ClinCancerRes.2006；12：4163-4170).

在没有炎症的情况下，MHCII类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专业抗原提呈细胞(APC)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。令人吃惊的是，在肿瘤患者的肿瘤细胞中发现有MHCII类分子的表达(DengjelJ，NastkeMD，GouttefangeasC，GitsioudisG，SchoorO，AltenberendF，MüllerM，B，MissiouA，SauterM，HennenlotterJ，WernetD，StenzlA，RammenseeHG，KlingelK，S.；UnexpectedabundanceofHLAclassIIpresentedpeptidesinprimaryrenalcellcarcinomas；ClinCancerRes.2006；12：4163-4170)

对于触发(引发)细胞免疫反应的肽，它必须与MHC分子结合。这一过程依赖于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异性多态性。MHC-I类-结合肽的长度通常为8-10个氨基酸残基，并且在其与MHC分子相应结合沟槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(“锚”)。这样，每个MHC的等位基因都有“结合基序”，从而确定哪些肽能与结合沟槽特异性结合(RammenseeHG，BachmannJ，StevanovicS.MHCligandsandpeptidemotifs，LandesBioscience，USA，1997)。

在MHC依赖性免疫反应中，肽不仅必须能与肿瘤细胞表达的某些MHC分子结合，而且它们还必须能被T细胞特异性T细胞受体(TCR)识别。

但是，使用一种CTL通常不足以消灭所有肿瘤细胞。肿瘤具有很强的诱变性，能快速对CTL的攻击作出反应，通过改变CTL的蛋白质模式以逃避被CTL识别。为了反击肿瘤逃逸机制，在接种疫苗中，运用各种特异性肽。这样，可同时使用数种CTL克隆物对肿瘤进行广泛的同时攻击。这可能会减少肿瘤逃避免疫反应打击的机会。这一假设最近已经在治疗晚期黑色素瘤患者的一项临床研究中得到证实。除了少数情况之外，至少有三次不同T细胞反应的患者显示出客观的临床有效率或稳定病情(Banchereauetal.，2001)以及生存期延长(与J.Banchereau个人性交流)，而绝大多数少于三次T细胞反应的患者被诊断有进展性疾病。

申请人的一项研究显示，当使用一种由13种不同肽组成的疫苗接种肾细胞癌患者时，得到了类似结果(H.Singh-Jasuja，S.Walter，T.Weinschenk，A.Mayer，P.Y.Dietrich，M.Staehler，A.Stenzl，S.Stevanovic，H.Rammensee，J.Frisch；CorrelationofT-cellresponse，clinicalactivityandregulatoryT-celllevelsinrenalcellcarcinomapatientstreatedwithIMA901，anovelmulti-peptidevaccine；ASCOMeeting2007Poster#3017；M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich，T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter，H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief；AnopenlabelstudytoevaluatethesafetyandimmunogenicityofthepeptidebasedcancervaccineIMA901，ASCOmeeting2007；Poster#3017)。

在本发明中，发明人分离和描述了与直接来自于哺乳动物肿瘤(主要为胶质母细胞瘤主要患者的样本)中的HLAI类或II类分子结合的肽，肿瘤样本还包括大肠癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤和胃癌的样本。

根据本发明，其目标通过这样方式达成：提供了一种至少包含两种肽的药物组合物，这两种肽含有选自SEQIDNO1至SEQIDNO8构成的组中的一个氨基酸序列、和/或含有与SEQIDNO1至SEQIDNO8具有至少80％同源性的一个变异氨基酸序列，和/或含有编码SEQIDNO1至SEQIDNO8的核酸的一个多聚核苷酸或变异氨基酸序列，以及一种药用载体。同时，本发明的药物组合物还可包括至少一种额外的肽，它含有选自SEQIDNO9至SEQIDNO：20构成的组中的一个氨基酸序列、或包含与SEQIDNO9至SEQIDNO：20至少80％相同的一个变异氨基酸序列或含有编码SEQIDNO9至SEQIDNO：20的核酸的一个多聚核苷酸或变异氨基酸序列。这些肽的总长度可为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至17个氨基酸。这些肽也可含有非肽键。如下文所述，除了含MET-005的肽之外，构成本发明基础的肽都已确定为由MHC-I类或II类承载细胞提呈的肽。因此，这些特殊肽以及其它含有序列的肽(即衍生肽)都能引发特异性T细胞反应，虽然其诱导的反应程度可能会因不同的肽和患者而不同。差异可能因肽的突变等原因造成。本领域技术人员熟知可应用于确定各个肽诱导反应程度的方法，特别是参照本文实施例和相应的文献。

优选情况是，发明中的变体可诱导T细胞与发明中各个肽发生交叉反应。

表3：本发明中的肽及其亲本蛋白的功能

硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)

CSPG4(硫酸软骨素蛋白多糖)为完整膜硫酸软骨素蛋白多糖。它被称为细胞表面黑色素瘤早期发展的标志物，刺激肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。CSPG4在90％以上的人类黑色素瘤病变中呈强烈表达。虽然严格来说，CSPG4并不具有肿瘤特异性，但是在黑色素瘤患者和健康人群中的肿瘤反应性CD4+T细胞反应可识别表达黑色素瘤细胞并缺乏自体免疫的HLA-DR11上的CSPG4693-709(Erfurtetal.，2007)。

CSPG4的表达增强了整合素介导的细胞扩散、FAK(焦点粘附激酶)磷酸化、以及ERK1/2(细胞外信号调节激酶)的激活(Yangetal.，2004)。此外，体外实验数据积累了CSPG4在肿瘤血管生成中发挥重要作用的证据。因此，CSPG4阳性肿瘤已经被发现血管新生率和血管量显著增加，并且CSPG4显示可吸收血管增生抑制素，从而抑制血管内皮细胞的增殖与血管新生。不成熟的血管还包含CSPG4阳性周细胞，这表明在血管发育过程中可通过阻滞血管抑制素的抑制作用而在此细胞群中发挥调节血管内皮细胞增殖的作用(Chekenyaetal.，2002b)。

除了激活的周细胞，CSPG4的表达也在一些正常组织中得到描述，如：内皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、表皮内的某些基底角质形成细胞、以及毛囊内的细胞(Campolietal.，2004)。

脂肪酸结合蛋白，脑(IMA-FABP7-001)

脂肪酸结合蛋白(FABP)为细胞质14-15kDa蛋白，应该参与脂肪酸(FA)吸收、传输和定位。当脂肪酸在膜室之间转运时，则被认为可增加细胞质中脂肪酸的溶解度，并将脂肪酸带至其细胞核的靶标(Glatzetal.，2002)。FABP可调节脂肪酸的浓度，并以这种方式影响各种细胞功能，如：酶的活性、基因表达、细胞生长与分化(GlatzandStorch，2001)。神经组织含有九种已知FABP中的四种，并且具有独特的时空分布(VeerkampandZimmerman，2001)。FABP7在中枢神经系统整个发育过程中在桡神经胶质细胞中呈高表达，并在成人中逐渐下降(FengandHeintz，1995；Shimizuetal.，1997)。在神经元诱导的胶质细胞分化以及随后神经元沿胶质细胞迁移过程中需要该蛋白，但是其对细胞增殖和粘附没有作用(Fengetal.，1994；Kurtzetal.，1994)。在雪旺细胞中，FABP7表达于RAS独立型EGFR信号通路的下游，并且调节正常周围神经和周围神经瘤中的雪旺细胞和轴突之间的相互作用(Milleretal.，2003)。

神经胶质素4，X-连锁(IMA-NLGN4X-001)

X-连锁NLGN4基因突变是自闭症的潜在原因，并且在数例患有自闭症、亚斯伯格综合症、精神发育迟滞的患者中报告有该突变(Jamainetal.，2003；Laumonnieretal.，2004；Lawson-Yuenetal.，2008)。

NLGN4X与癌症的关系有以下很少的描述：在胃肠道间质肿瘤中，在儿科和年轻病例中与年龄较长病例相比发现有NLGN4X的过度表达(Prakashetal.，2005)。

细胞粘合素C(健生蛋白)(IMA-TNC-001)

神经细胞粘附分子(IMA-NRCAM-001)

NRCAM(神经细胞粘附分子)是一种神经元跨膜细胞粘附分子，含多个免疫球蛋白样C2-型和纤维连接蛋白III型域。它通过形成与其它IgCAM的嗜同种和嗜异性相互作用(Volkmeretal.，1996；Sakuraietal.，1997；Zachariasetal.，1999)而参与神经元细胞的指导、过速生长和自发性收缩(Grumetetal.，1991；Moralesetal.，1993；StoeckliandLandmesser，1995；Perrinetal.，2001；Sakuraietal.，2001)。锚定蛋白结合NRCAM(DavisandBennett，1994)在形成内皮细胞的管道中上调，表明可能具有形成管道和血管生成的作用(Aitkenheadetal.，2002)。

胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IMA-IGF2BP3-001)

IGF2BP3是胰岛素样生长因子-IImRNA结合蛋白家族中的一员，涉及mRNA定位、转换及翻译控制。该蛋白包含数个KH(钾同源)域，这些域在RNA结合中起着重要作用，并已知参与RNA合成和代谢。表达主要在胚胎发育期间发生，并在一些肿瘤中有描述。因此，IGF2BP3被认为是一种癌胚蛋白(Liaoetal.，2005)。与对照组织相比，在许多癌症组织中存在IGF2BP3的高水平转录，这表明IGF2BP3蛋白可能在转化细胞的增殖中发挥着功能性作用。该假说由这一发现得到支持，即，表达IGF2BP3转录物的唯一非恶性人体组织是人胎盘，这是以细胞生长和增殖为特征的组织(Mueller-Pillaschetal.，1997)。

科学文献中没有关于IGF2BP3在GBM中表达的具体资料，但该蛋白质被描述为在其它数种恶性肿瘤中过度表达。

IGF2BP3在胰腺癌中也呈高表达。在2项研究中，＞90％的胰腺肿瘤组织样本在免疫染色后显示IGF2BP3表达，而非肿瘤胰腺组织的IGF2BP3为阴性。此外，该表达随着肿瘤分期的发展而逐步升高(Yantissetal.，2005；Yantissetal.，2008)。

IGF2BP3表达在高级别尿道上皮肿瘤中也发现有显著上升，而在良性尿道上皮或低级别尿道上皮肿瘤中一般没有表达。此外，IGF2BP3阳性肿瘤的患者的无进展生存率和无疾病生存率比IGF2BP3阴性肿瘤患者低得多(Lietal.，2008；Sitnikovaetal.，2008；Zhengetal.，2008)。

BCAN-短蛋白聚糖(IMA-BCA-002)

短蛋白聚糖(BCAN)是硫酸软骨素蛋白多糖的凝集蛋白聚糖家族中的一种大脑特异性成员。已经报道过两种BCAN的异构体：全长异构体，它分泌到细胞外基质；较短的异构体，它含有一个预测糖磷脂酰肌醇锚的序列。分泌的异构体自出生到8岁整个期间呈高表达，到20岁时下调至低水平，该水平在成人正常皮质中维持。GPI异构体在整个发育期间均一直处于低水平(Garyetal.，2000)。BCAN属于蛋白多糖家族，通常作为屏障分子，阻止成人神经系统中的细胞和神经突运动(ViapianoandMatthews，2006)。在体内，BCAN在延髓迁移流边界周围表达(JaworskiandFager，2000)，在神经元损伤后，它是胶质瘢痕的一种主要上调成分(Jaworskietal.，1999)。

Met原癌基因(肝细胞生长因子受体)(IMA-MET-005)

MET原癌基因c-Met编码一种跨膜酪氨酸激酶受体，具有调节细胞增殖、分化、运动、黏附和侵袭的能力。它被肝细胞生长因子(HGF)激活(Giordanoetal.，1989；TrusolinoandComoglio，2002)。

c-Met的信号通路参与器官再生-这在肝和肾、胚胎发育、造血、肌肉发育中得到证实，并且参与正常激活B细胞及单核细胞的迁移和粘附的调节(Naldinietal.，1991；Mizunoetal.，1993；Bladtetal.，1995；Schmidtetal.，1995；ZarnegarandMichalopoulos，1995；vanderVoortetal.，1997；Beilmannetal.，2000)。

不同类型肿瘤的研究已证明了激活c-Met的若干机制，包括HGF/c-Met的自分泌循环、激活位点突变、TPR-Met融合蛋白以及将c-MET分裂为α和β链失败(Parketal.，1986；Mondinoetal.，1991；Ebertetal.，1994；Schmidtetal.，1997；Oliveroetal.，1999；Parketal.，1999；DiRenzoetal.，2000)。c-Met通过磷酸化的组成性激活也被认定为人类透明肾细胞癌的一种重要发生机制(Nakaigawaetal.，2006)。

表4：本发明组合物中其它有用的免疫原性肽

在WO2007/028574中披露了SEQIDNO14、SEQIDNO15和SEQIDNO16，CDC42(细胞分裂周期42)是参与调解细胞周期的一种蛋白质。该蛋白质是Rho-子家族的一种小GTP酶，调节控制多种细胞功能的信号通路，其中包括细胞形态、迁移、内吞作用和细胞周期进展。CDC42被发现在胶质母细胞瘤中高度过度表达。

分泌磷蛋白1(SPP1)，亦称为骨涎蛋白(BSP-1)、早期T淋巴细胞激活(ETA-1)，最经常称为骨桥蛋白(OPN)，是一种人类基因产物，其它物种中也含有。骨桥蛋白是骨重塑中重要的因子。具体来说，研究表明具有将破骨细胞锚固至骨矿物质基质的作用。除了骨桥素外，骨头的有机成分大约是I型胶原、骨钙素、骨连接素、骨唾液酸蛋白和碱性磷酸酶干重和计数的20％。I型胶原占蛋白质量的90％。

OPN与数种整合素受体结合，包括白血球表达的α4β1、α9β1和α9β4。这些受体在这些细胞中有效地执行细胞黏附、迁移和生存的功能。因此，近期的研究工作主要集中于OPN在介导这些反应中的作用。

骨桥蛋白表达于广泛的免疫细胞中，包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞，T细胞和B细胞，动力学各不相同。据报道，OPN可以不同方式充当免疫调节剂。首先，它具有趋化特性，促进将细胞征募至发炎部位。它还具有粘附蛋白的功能，参与细胞附着和伤口愈合。另外，OPN介导细胞活化和细胞因子产生，并通过调节细胞凋亡促进细胞存活。

IL-12促进活化T细胞向Th1型分化，从而产生包括IL-12和IFNγ的细胞因子。OPN可抑制Th2细胞因子IL-10的产生，从而加强Th1应答。OPN影响细胞介导的免疫，并具有Th1细胞因子的功能。它增强了B细胞免疫球蛋白的产生和增殖。2008年的最新研究表明，OPN还会引起肥大细胞脱颗粒。[NagasakaA，MatsueH，MatsushimaH，etal.(February2008)。“骨桥蛋白由肥大细胞产生并影响IgE介导的肥大细胞脱颗粒和迁移”。Eur.J.Immunol.38(2)：489-99]研究人员观察到，与野生型小鼠相比，IgE介导的过敏性反应在剔除OPN的小鼠中显著降低。一项癌症研究也提示了OPN在巨噬细胞活化中的作用，研究人员发现，与OPN缺乏肿瘤相比，产生OPN的肿瘤能够诱导巨噬细胞活化。[21]

在很多情况下，OPN是一种重要的抗凋亡因子。OPN阻止巨噬细胞和T细胞以及暴露于有害刺激物的成纤维细胞和血管内皮细胞的激活诱导的细胞死亡。OPN可阻止炎症性结肠炎中的非程序性细胞死亡。

OPN与广泛表达的多种细胞表面受体相互作用的事实使其在许多生理和病理过程中发挥着积极作用，包括伤口愈合、骨转换、肿瘤的发生、炎症、缺血和免疫反应。因此，操纵血浆OPN水平可能有利于治疗自身免疫性疾病、癌转移、骨质疏松症和某些形式的应急。

研究表明，OPN促进IL-17的产生；OPN在多种癌症中过度表达，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤和间皮瘤；OPN还可导致肾小球肾炎和肾小管间质肾炎；并且OPN可在动脉内的粥样硬化斑块中发现。因此，操纵血浆OPN水平可能有利于治疗自身免疫性疾病、癌转移、骨质疏松症和某些形式的应急。

蛋白酪氨酸磷酸酶受体型ξ-1(PTPRZ1，PTP-ξ)

PTPRZ1是受体型蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成员，编码一次通过(single-pass)I型膜蛋白，该被编码蛋白含两个细胞质酪氨酸蛋白磷酸酶区域，一个α-碳酸酐酶区域和一个纤维连接蛋白III型区域。在以下细胞中该基因被诱导表达：胃癌细胞(Wuetal.，2006)、乳腺癌(Perez-Pineraetal.，2007)、多发性硬化病变的再髓鞘化少突胶质细胞(Harrochetal.，2002)、以及组织缺氧情况下的人胚胎肾细胞(Wangetal.，2005)。

蛋白和转录物都在胶质母细胞瘤细胞中过度表达，这促进了它们按络合点次序进行迁移(haptotacticmigration)(Luetal.，2005)以及胶质细胞瘤中基因组DNA的扩增(Mulhollandetal.，2006)。

几丁质酶3样2(CHI3L2)

CHI3L2最初确定源自软骨细胞并在骨关节炎等时上调(Stecketal.，2002)。虽然该蛋白的特点尚不鲜明，但是它很有可能分泌到细胞外间隙中。常作为类风湿关节炎的靶抗原。siRNA转染(VEGF-A)人胶质瘤细胞系诱导实验性抗血管生成造成CHI3L2上调。

生存素(BIRC5)

乙肝核心抗原

对于乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白HBc，致免疫肽为众所周知(Bertolettietal.，1993；Livingstonetal.，1997)。根据本发明，来自HBc的10-氨基酸肽可能纳入作为患者免疫活性的阳性对照，并成功接种入癌症疫苗。

在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQIDNO1的氨基酸序列以及根据SEQIDNO12或SEQIDNo17的氨基酸序列的肽。

在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQIDNO1的氨基酸序列以及根据SEQIDNO2和/或SEQIDNo17的氨基酸序列的肽。

在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQIDNoSEQIDNo3的氨基酸序列以及根据SEQIDNO2和/或SEQIDNo17的氨基酸序列的肽。

在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQIDNoSEQIDNo1的氨基酸序列以及根据SEQIDNO7和可选SEQIDNo17的氨基酸序列的肽。

在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQIDNoSEQIDNo2的氨基酸序列以及根据SEQIDNO7和可选SEQIDNo17的氨基酸序列的肽。

在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物包括至少两种含有根据SEQIDNoSEQIDNo3的氨基酸序列以及根据SEQIDNO7和可选SEQIDNo17的氨基酸序列的肽。

在更为优选的实施方案中，药物组合物包括至少有一种以上肽，肽含有选自SEQIDNO2至SEQIDNO11和SEQIDNo14至SEQIDNo20构成的组中的一个氨基酸序列、和/或与SEQIDNO2至SEQIDNO11或SEQIDNo14至SEQIDNo20至少80％相同的一个氨基酸序列，和/或含有编码SEQIDNO2至SEQIDNO11或SEQIDNo14至SEQIDNo20核酸的一个多聚核苷酸或变异氨基酸序列，以及一种药用载体。

本发明的进一步优选实施方案包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个肽，肽含有选自SEQIDNO1至SEQIDNO12和SEQIDNo14至SEQIDNo20构成的组中的一个氨基酸序列、和/或与SEQIDNO1至SEQIDNO12至少80％相同的一个氨基酸序列、和/或含有编码SEQIDNO1至SEQIDNO12和SEQIDNo14至SEQIDNo20的核酸的一个多聚核苷酸或变异氨基酸序列，以及一种药用载体。

该药物组合物还可包含更有效的其它肽和/或赋形剂，将进一步解释如下。

发明人用给定氨基酸序列的“变种氨基酸序列”表示，一个或多个氨基酸残基等的侧链通过取代另一个自然产生的氨基酸残基的侧链或其它侧链而改变，这样，这种肽仍然能够以含有给定氨基酸序列的肽大致同样的方式与HLA分子结合。例如，一种肽可能被修饰以便至少维持(如果不提升的话)其与HLA-A或HLA-DR等合适的MHC分子互动和结合，以及至少维持(如果不提升的话)其产生能识别和杀伤细胞(这些细胞表达含本发明中所定义的一种氨基酸序列的多肽)的激活CTL的能力。从数据库中可得知，HLA-A结合肽的某些位点通常为锚定残基，可形成一种与HLA结合槽的结合基序相称的核心序列。

相应地，诱导T细胞与本发明中的肽发生交叉反应的变体往往为长度可变的变体。如果长度约为12个氨基酸残基的肽直接与MHC-II类分子结合，那么，两侧有核心HLA结合区、且不会对该肽与MHC-II类分子的结合槽特异性结合能力或该肽提呈至CTL的能力产生重大影响的残基则为优选。但是，正如上所述，应了解，可使用较大的肽(特别是核苷酸进行编码时)，因为这些较大的肽可被适当的抗原提呈细胞分成片段。另外，侧翼氨基酸可以降低体内肽降解速度，以使提供给CTL的肽实际量高于无侧翼氨基酸的肽。

MHCI类表位(通常长度为8至10个氨基酸)也可能由肽从较长的肽或包含实际表位的蛋白中加工而产生。与MHC-II类表位相似，首选情况是，实际表位N-和C-端的拉长前体肽上游和/或下游的侧翼残基不会对该肽提呈至CTL产生重大影响、也不会掩盖加工拉长肽介导的产生实际表位所需的蛋白裂解位点。

优选情况是，这些肽含有一个核心序列，其由SEQIDNO1至SEQIDNO7和SEQIDNo9至SEQIDNo11组成并且C端和/或N端上有1至10个氨基酸的延长，更优选的情况是，这些侧翼氨基酸的总数为1至12个，更优选1至10个，更优选1至8个，更优选1至6个，其中侧翼氨基酸可在C端和N端以任意比例分布(例如所有侧翼氨基酸可以被添加至一个末端，或氨基酸可均等地或以任何其它比例加入两种末端)，但前提是，该肽仍然能根据SEQIDNO1至SEQIDNO7和SEQIDNo9至SEQIDNo11任何一个序列所得肽的同样方式与HLA分子结合。

优选的药物组合物是，其中这些肽的总长度可为8至100个氨基酸、优选为8至30个氨基酸，最优选为8至17个(即9、10、11、12、13、14、15或16个)氨基酸。

此外，该肽或变体可进一步修饰以提高稳定性和/或与MHC分子结合，从而引发更强的免疫反应。肽序列的该类优化方法是本领域内所熟知的，包括，例如，反式肽键和非肽键的引入。

因此，另一方面，本发明提出了一种药物组合物，其中，至少有一个含非肽键的肽或变体。

在反式肽键氨基酸中，肽(-CO-NH-)并未连接其残基，但是其肽键是反向的。这种逆向反向模拟肽(retro-inversopeptidomimetics)可通过本领域已知的方法制备，例如：Meziere等在《免疫学杂志》((1997)J.Immunol.159，3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。这种方法涉及制备包含骨架(而并非侧链)改变的模拟肽。Meziere等人(1997年)的研究显示，这些模拟肽有利于MHC和辅助性T细胞的反应。以NH-CO键替代CO-NH肽键的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。

非肽键为-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美国4897445号专利提出了多肽链中非肽键(-CH2-NH)的非固相合成法，该方法涉及按标准程序合成的多肽以及通过氨基醛和一种含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽键。

含上述本发明序列的肽可与其氨基和/或羧基末端的其它化学基团进行合成，从而提高肽的稳定性、生物利用度、和/或亲和力等。例如，苄氧羰基、丹酰基等疏水基团或叔丁氧羰基团可加入肽的氨基末端。同样，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，例如，疏水基团、叔丁氧羰基团或氨基团都可能被加入肽的羧基末端。

另外，本发明中的所有肽都可能经合成而改变其空间构型。例如，可能使用这些肽的一个或多个氨基酸残基的右旋体，通常不是其左旋体。更进一步地，本发明中肽的至少一个氨基酸残基可被熟知的一个非天然氨基酸残基取代。诸如此类的改变可能有助于增加本发明肽的稳定性、生物利用度和/或结合作用。

当蛋白与戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交联用于配制水凝胶时，治疗性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修饰往往可延长循环半衰期。针对免疫治疗的变态反应原化学修饰往往通过氰酸钾的氨基甲酰化实现。

一般来说，肽和变体(至少含氨基酸残基之间的肽联接)可使用Lu等人(1981)J.Org.Chem.46，3433)以及此处列出的参考文献所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式等方法进行合成。

纯化可通过以下技术的任何一种或组合方法实现，如：再结晶法、体积排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法以及(通常)反相高效液相色谱法(如使用乙腈/水梯度分离)。

肽分析可使用以下方法进行：薄层色谱法、电泳法、特别是，毛细管电泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色谱法、酸水解后的氨基酸分析、快原子轰击(FAB)质谱分析法以及MALDI、ESI-Q-TOF质谱分析法。

另一方面，本发明提出了一种编码本发明中肽或变体的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能为DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA等或为单链和/或双链，或多聚核苷酸的原生或稳定形式，如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸，或其组合物，并且只要它编码肽，就可能包含也可能不包含内含子。当然，多聚核苷酸只能编码加入天然肽键并含有天然氨基酸残基的肽。另一个方面，本发明提出了一种可根据本发明表达多肽的表达载体。不同类型细胞的表达载体为本领域所熟知并且无需过度不当实验就可选定。

一般来说，DNA可以适当的方向和正确的表达阅读框架附着到一种表达载体(如质粒)中。如有必要，该DNA可能与所需宿主所识别的相应转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管表达载体中一般存在此类控制功能。然后，该载体通过标准方法被引入宿主。指导可参阅，如：Sambrook等(1989)所著MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY。

但是，在本发明的一个特别优选实施方案中，药物组合物至少包含两种由根据SEQIDNO1至SEQIDNO12的氨基酸序列构成的肽。

对于用作GBM疫苗的一种组合物，例如，亲本蛋白在正常组织中高表达的肽在本发明的组合物中将会避免使用或含量较低。另一方面，如果已知某个患者的肿瘤高表达某种蛋白，则治疗这种癌症的各药物组合物可能含有大量和/或一个以上针对这种特定蛋白的肽，或者可能含有这种蛋白的通路。技术人员可通过以下测试选择免疫原性肽的优选组合，如：测试体外T细胞的代及其效果和总量、针对某些肽的某些T细胞的增殖、亲和力和扩增，以及通过分析IFN-γ的产生(参阅下文实施例)测试.细胞的功能性。通常为了上述之目的，最有效的肽然后组合为一种疫苗。

一种合适的疫苗将优选为包含1至20个肽，更优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个不同的肽，进一步优选为6、7、8、9、10、11、12、13或14个不同的肽，最优选为10、11、12、13或14个不同的肽。用于癌症疫苗的肽长度为任何合适的肽。特别是，它可能是一种合适的9-mer肽或一种合适的8-mer或9-mer或10-mer或11-mer肽或12-mer、13-mer、14-mer或15-mer肽.。较长的肽也可能适合，附表1和2中所述的9-mer或10-mer肽优选为MHC-I类肽，而12-至15-mer肽优选为MHC-II类肽。

肽组成了肿瘤或癌症疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。

该肽可能为纯肽，也可能是与免疫刺激佐剂的组合物(见下文)、或与免疫刺激细胞因子联合使用、或以适当的输送系统给药，例如脂质体。该肽也可共轭形成一种合适的载体(如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或甘露)到合适的载体(参阅WO95/18145及Longenecker等(1993)Ann.NYAcad.Sci.690，276-291)。该肽也可进行标记、或是一种融合蛋白或是杂合分子。本发明中给出肽序列的肽预期会刺激CD4或CD8CTL。但是，有反向CD阳性T细胞提供帮助时，刺激更为有效。因此，对于刺激CD4T细胞的MHC-II类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD8阳性T细胞的适当表位。另一方面，对于刺激CD8CTL的MHC-I类表位，一种杂合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD4阳性T细胞的适当表位。CD4-和CD8刺激表位为本领域所熟知、并包括本发明中确定的表位。

药用载体通常是已熟知的液体，可配制其中的一种有效治疗剂制。剂型中的载体虽然可能具有化学和/或生物稳定性、释放特性等等，但是一般不具备任何药理活性。典型配方可在诸如AlfonsoR.Gennaro.Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，20thEditionBaltimore，MD：LippincottWilliams&Wilkins，2000等书籍中找到，包括(但不限于)盐水、水、缓冲水、0.3％甘氨酸、透明质酸、葡萄糖等。最近，人们发现在人类患者中用作静脉营养很多年的某些脂肪乳剂也可充当一种肽赋形剂。有两种此类乳剂已用作商用脂肪乳剂，名叫Intralipid、Lipofundin。″Intralipid″是瑞典KabiPharmacia公司一种静脉营养脂肪乳剂的注册商标，美国专利号为3169094。″Intralipid″是德国B.BraunMelsungen公司的注册商标。两者均包含大豆油脂肪(1000蒸馏水中含100或200克：即含量分别为10％或20％)。Intralipid中卵黄磷脂用作乳化剂(12g/l蒸馏水)，Lipofundin中蛋黄卵磷脂用作乳化剂(12g/l蒸馏水)。Intralipid和Lipofundin的等渗性均是在它们中加入甘油(25g/l)的结果。

其它有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、Poly(I:C)(如polyI：C12U)、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：咪唑喹啉、环磷酰胺、舒尼替单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、ipilimumab、tremelimumab和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需过度进行不当实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。

优选佐剂为dSLIM、BCG、OK432、咪喹莫特、resimiquimod、GM-CSF、干扰素-α、PeviTer和JuvImmune或其组合物。

本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂选自集落刺激因子构成的组，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。

在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为咪喹莫特或resimiquimod。在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为GM-CSF和咪喹莫特的组合物。

此组合药物为非肠道注射使用，如皮下、皮内、肌肉、腹腔注射，也可口服。为此，肽和其它选择性分子在药用载体中分解或悬浮，优选为水载体。此外，组合物可包含辅料，如：缓冲剂、结合剂、冲击剂、稀释剂、香料、润滑剂等。这些肽也可与免疫刺激物质合用，如：细胞因子。可用于此类组合物的更多辅料可在从A.Kibbe所著的HandbookofPharmaceuticalExcipients(第3版，2000年，美国医药协会和制药出版社)等书中获知。此组合药物可用于阻止、预防和/或治疗腺瘤或癌性疾病，优选为结直肠癌。

细胞毒性T细胞(CTL)可识别与MHC分子而不是与完整外来抗原本身结合的以一种肽形式出现的抗原。MHC分子本身位于抗原提呈细胞的细胞表面。因此，只有出现肽抗原、MHC分子和APC三聚体复合物时，才可能激活CTL。相应地，如果并非只有该肽用于激活CTL，而是添加了含各MHC分子的额外APC，则可提高免疫反应。

因此，在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，另外至少包含一种抗原提呈细胞。抗原提呈细胞(或刺激因子细胞)通常在其表面有一个MHC-I类或II类分子，在一个实施方案中，该抗原提呈细胞自身基本上不能向MHC-I类或II类分子载入选定抗原。正如下面的更为详细描述，MHC-I类或II类分子在体外可很容易载入选定抗原。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，至少包含一种抗原提呈细胞的药物组合物以该肽进行脉冲处理或进行加载，例如，通过实施例4的方法。

作为一种替代物，抗原提呈细胞包括一个编码肽的表达载体。多聚核苷酸可能选为任何合适的多聚核苷酸，优选为能转导树突状细胞，从而提呈一种肽并诱导免疫性。

一般来说，本发明中，含有发明中的一种(多种)核酸的药物组合物可用本发明中那些含有肽的药物复合物的相似给药方式给予，如：静脉注射、动脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、瘤内注射、口服、经皮、经鼻腔、经口腔、经直肠、经阴道、吸入、或外用。

由于逃逸机制的原因，肿瘤往往对治疗药物产生耐药。耐药性可能在治疗期间出现，并转移和复发肿瘤中表现出来。为了避免这种耐药性，肿瘤通常通过联合给药治疗，转移瘤和无病期后复发的肿瘤后往往需要不同的药物组合来治疗。因此，在本发明的一方面，药物组合物与第二种抗癌药物结合使用。第二种药物可在本发明中的药物组合物给药之后给予，也可同时给药。例如，如果化学性质相容，本发明中的药物组合物可与第二种抗癌药物混合使用，从而实现同时给药。同时给药的另一种方法是，本组合物与抗癌药物同一天给药，给药途径可不同，例如，本发明的药物组合物可注射给药，而第二种抗癌药物可口服。药物组合物和第二种抗癌药物也可在同一疗程给药，但是不在同一天和/或在不同的疗程内给药。

另一个方面，本发明提出了一种治疗或预防患者癌症的方法，包括给予患者本发明中的任何一种药物组合物的有效治疗量。

有效治疗量是指能引发免疫反应的量，特别是激活CTL亚群。本领域的技术人员可使用免疫学标准方法很容易确定使用量是否有效，如：本说明书实施例中的方法。监测本药物组合物某种量效果的方法是观察受治疗肿瘤的生长和/或其复发情况。

在本发明药物组合物的一个特别优选实施方案中，本药物组合物作为抗癌疫苗使用。

含肽组合物或肽编码的核酸也可以构成肿瘤或癌症的疫苗。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。

本发明的药物组合物可用于治疗癌症或作为癌症疫苗使用。癌种可能是口腔癌、咽癌，消化道癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、呼吸道癌、乳腺癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫体癌、卵巢癌、男性生殖道癌、尿道癌、骨癌、软组织癌、卡波西肉瘤、皮肤黑色素瘤、眼黑色素瘤、非黑色素瘤眼癌、脑癌、中枢神经系统癌、甲状腺癌、其它内分泌腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤，优选为肾癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、脑癌、胃肠道间质瘤或胶质母细胞瘤，优选为脑瘤，更优选为胶质母细胞瘤。

药品组合物包括游离形式或以一种药用盐形式存在的肽。

此处使用的“药用盐”系指所公开的肽的一种衍生物，其中该肽由制酸或药剂的碱盐进行改性。例如，酸性盐采用自由基(通常其中药物的中性形式具有一种中性-NH2基团)通过与合适酸发生反应而制得。适合制备酸盐的酸包括有机酸，如：乙酸、丙酸、羟基酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水杨酸等等、以及无机酸，如：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一种肽上提呈的酸性基团的碱盐制剂使用药用碱基进行制备，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等等。

在特别优选的实施例中，药物组合物包括乙酸(醋酸盐)铵或盐酸(氯化物)形式的肽。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物可能包括糖、糖醇、氨基酸(如：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸等)作为骨架形成剂。这些糖可能为单糖、双糖或三糖。这些糖可单独使用，也可与糖醇组合。糖的实例包括：单糖(如：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖或山梨糖)、双糖(如：蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)以及三糖(如：棉子糖)。糖醇可能为，例如，甘露糖。优选成分为蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇和/或山梨醇，更优选为甘露醇。

此外，本发明的药物组合物可能包括生理耐受性好的辅料(参见《药用辅料手册(HandbookofPharmaceuticalExcipients)》，第五版，RaymondRowe、PaulSheskey和SianOwen编著，医药出版社(2006年))，抗氧化剂如：抗坏血酸或谷胱甘肽，防腐剂如：苯酚、间甲酚、甲基或对羟苯甲酸丙酯、氯丁醇、硫柳汞或苯扎氯铵、稳定剂，骨架形成剂如：蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或山梨醇，甘露醇和/或乳糖及增溶剂如：聚乙二醇(PEG)，即PEG3000、3350、4000或6000或环糊精，即羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精和γ环糊精、或右旋糖酐或泊洛沙姆，即泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、或吐温20、吐温80。在一项优选实施方案中，本发明的药物组合物包括一种或多种从抗氧化剂、骨架形成剂和稳定剂构成的组之中所选的耐受性良好的辅料。静脉和肌注给药可接受的pH值范围为pH2-12，但皮下给药的pH范围降至2.7-9.0，这是因为体内稀释率降低，导致注射部位产生放射的可能性加大。StrickleyRobertG.，Pharm.Res.，21，NO：2，201-230(2004)。

本发明的另一实施方案中，疫苗为核酸疫苗。接种核酸疫苗(如DNA疫苗)编码多肽会导致T细胞反应。该疫苗可直接给到患者的受影响器官，也可全身给药，或体外应用到来自患者或其细胞株的细胞(随后再将这些细胞注入到患者中)，或体外用于从来自患者的免疫细胞的一个细胞亚群(然后再将细胞重新给予患者)。如果核酸给予体外细胞，可能有益于细胞转染，以共同表达免疫刺激细胞因子，如白细胞介素-2或GM-CSF。核酸可完全单独给药，也可与免疫刺激佐剂或与免疫刺激细胞因子联合使用，或以适当的输送系统给药，例如脂质体。核酸疫苗可与佐剂一起使用，如上述与肽疫苗一起使用的佐剂。核酸疫苗优选为不与佐剂联合给药。

适当的情况是，给予患者的任何核酸都是无菌、无热原的。裸DNA可肌肉注射、皮内注射或皮下注射。核酸疫苗优选可包括任何合适的核酸输送工具。核酸，优选为DNA，也可用一种脂质体或病毒载体输送系统输送。如果是核酸疫苗(如DNA疫苗)，首选注入肌肉，而肽疫苗首选皮下注射。疫苗也优选注入皮内。

我们认为，核酸的吸收和专业抗原提呈细胞(如树突状细胞)编码的肽的表达可能是免疫反应的启动机制所致；然而，树突状细胞可能不会被转染，但是由于它们可能会从组织中的转染细胞中挑选出被表达的肽，因此仍然很重要(“交叉启动”，例如，ThomasAM，SantarsieroLM，LutzER，ArmstrongTD，ChenYC，HuangLQ，LaheruDA，GogginsM，HrubanRH，JaffeeEM.Mesothelin-specificCD8(+)Tcellresponsesprovideevidenceofinvivocross-primingbyantigen-presentingcellsinvaccinatedpancreaticcancerpatients.JExpMed.2004Aug2；200(3)：297-306)。

Conry等(1996年)在《肿瘤学论文集》(SeminarsinOncology23，135-147)中、Condon等(1996年)在《自然-医学》(NatureMedicine2，1122-1127)中、Gong等(1997年)在《自然-医学》(NatureMedicine3，558-561)中、Zhai等(1996年)在《免疫学杂志》(J.Immunol.156，700-710)中、Graham等(1996年)在《国际癌症杂志》(IntJ.Cancer65，664-670)中、Burchell等(1996)309-313在BreastCancer，Advancesinbiologyandtherapeutics一文中、Calvo等(Eds)、JohnLibbeyEurotext都对多聚核苷酸介导的癌症免疫化治疗进行了描述，以完整引用形式并入本文。

这也可能有益于疫苗特异性靶向作用于细胞群(例如抗原提呈细胞)，可使用局部注射、使用靶向性载体和输送系统、或对患者该类细胞群的选择性纯化以及体外给予肽或核酸(例如，树突状细胞可按Zhou等人(1995年)在Blood86，3295-3301中、Roth等人(1996年)在Scand.J.Immunology43，646-651中所述的方法进行分类)。例如，靶向性载体可包括一个组织或肿瘤特异性启动子，引导抗原在适当的位置表达。

本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由胶质母细胞瘤产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。

组织切片上存在本发明的肽可有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱或其它本领域内已知的方法检测本发明的某些肽可使病理师判断该组织为恶性的、炎症还是一般病变。本发明肽基团的存在使得能对病变组织进行分类或子分类。

对病变标本中本发明肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果T淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，本发明肽的提出表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。

本发明的肽可用于分析对本发明肽发生的淋巴细胞反应(如T细胞反应)，或对本发明肽发生的抗体反应，或分析本发明中与MHC分子络合的肽。这些淋巴细胞反应可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞反应，如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，对本发明肽发生的淋巴细胞反应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞反应监测也可能成为移植疗法随访检查中的一种有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。

在另一个方面，本发明涉及一个套件，包括(a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物；(b)可选项，第二个容器，含冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；及(c)可选项，(i)使用溶液或(ii)重组和/或使用冻干粉剂型的说明书。该套件可进一步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v)注射器。容器优选为瓶子、西林瓶、注射器或试管；也可为多用途容器。药物组合优选为冻干粉剂。

本发明中的套件优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。该容器可能由多种材料制成，如玻璃或塑料。优选情况是，套件和/或容器上有说明，表明重组和/或使用的指示。例如，标签可能表明冻干剂型将重组为上述肽浓度。该标签可进一步表明制剂用于皮下注射。

存放制剂的容器可使用多用途西林瓶，使得可重复给予(例如，2-6次)重组剂型。该套件可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。

稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的肽终浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(＝75μMg)，不超过3mg/mL/肽(＝1500μMg)。该套件还可包括商业和用户角度来说可取的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。

本发明中的套件可能有一个单独的容器，其中包含本发明所述的药物组合物制剂，该制剂可有其它成分(例如，其它化合物或及其药物组合物)，也可无其它成分，或者每种成分都有其不同容器。

优选情况是，本发明的套件包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该套件的成分可进行预络合或每种成分在给予患者之前可放置于单独的不同容器。该套件的成分可以是一种或多种溶液，优选为水溶液，更优选为无菌水溶液。该套件的成分也可为固体形式，加入合适的溶剂后转换为液体，最好放置于另一个不同的容器中。

治疗套件的容器可能为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其它盛装固体或液体的工具。通常，当成分不只一种时，套件将包含第二个西林瓶或其它容器，使之可以单独定量。该套件还可能包含另一个装载药用液体的容器。优选情况是，治疗套件将包含一个设备(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本发明的药物(本套件的组合物)。

本发明的药物配方适合以任何可接受的途径进行肽给药，如口服(肠道)、鼻内、眼内、皮下、皮内、肌内，静脉或经皮给药。优选为皮下给药，最优选为皮内给药，也可通过输液泵给药。

应该认识到，此处披露和描述的本发明特点不仅可联合使用，而且也可以单独的方式使用，只要在本发明的预期用途范畴内。为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。

下列参考图、序列表和实施例将对本发明进行详细描述。以下实施例仅作为说明之用，而不是为了限制本发明。

附图简要说明

图1：微球四聚体技术分析促进了健康供体外周血CSP-001和NLGN4X-001特异性CD8+淋巴细胞增殖。与抗CD28+高密度肿瘤抗原A*0201/CSP-001(左板)或抗CD28+高密度肿瘤抗原A*0201/NLGN4X-001(右板)耦合的微球每周对每孔中1x106CD8+浓缩PBMC进行了刺激。经过三次体外刺激，所有的细胞用抗体CD8FITC+荧光标记的四聚体A*0201/CSP-001和A*0201/NLGN4X-001进行染色。细胞在CD8+淋巴细胞上得到门控；数字代表CD8+淋巴细胞指定象限内的细胞百分比。

图2：HLA-A*0201等位基因编码的本发明HLA-I类肽对MHC分子的亲和性。IMA950HLAI类TUMAP、对照肽IMA-MUC-001(中等强度结合剂)以及病毒标志物肽HBV-001(强力结合剂)的解离常数(KD)用基于ELISA的MHC重折叠检测法测得。该法重复三次，结果相似。

实施例

1.合成

肽通过使用Fmoc化学以标准、广为接受的固相合成法合成。制备液HPLC纯化之后，进行离子交换纯化程序从而加入生理相容性反离子(例如，醋酸、氨或氯化物)。最后，在冻干后制得白色至类白色固体。所有的TUMAP优选作为醋酸盐进行给药，其它盐形式也可以。

重要的是，肽的身份和纯度可很容易使用质谱、氨基酸分析法和HPLC分析法确定，并且确认精确度高。根据分析结果，IMA950疫苗所用的所有肽都显示出正确的结构，纯度为95％以上。

肽FTELTLGEF(HLA-A1，PolyPeptideLaboratories公司，德国沃尔芬比特尔)、LMLGEFLKL(HLA-A2；Clinalfa公司，瑞士Sissach)和EPDLAQCFY(HLA-B35；PolyPeptideLaboratories公司)获得了药用质量。

表5：IMA950肽的物理化学特征

2.典型药物组合物IMA950的组成

手术切除的恶性肿瘤样本和GBM患者的正常组织以及健康供体的血液以循序渐进的方法进行分析：

首先，使用微阵列全基因组mRNA表达分析法来确定恶性肿瘤组织与一系列正常器官和组织相比过度表达的基因。在第二个步骤中，恶性肿瘤的HLA配体用质谱法确定。随后，确定的HLA配体与基因表达数据进行比较。第1步中检测到的选择性表达或过度表达基因所编码的肽考虑为多肽疫苗的合适候选TUMAP。

表6：IMA950TUMAP组合物。

典型IMA950含有10种HLA-A*02结合肽(I类)、1种HLA-DR结合肽(II类)和1种拉长的HLA-A*02肽。此外，也包括HBV-001病毒标志物肽，在此未罗列。

组织样本

患者肿瘤组织由CantonalUniversitairedeGen¨¨ve(医学肿瘤学(肿瘤免疫学)实验室)和Neurochirurgische-KlinikHeidelberg(MolekularbiologischesLabor)提供。所有患者在手术前都获得了书面知情同意。手术后立即用液态氮对组织进行冷休克处理，在分离TUMAP前储存于-80下。

从组织样本中分离HLA肽

根据方案(Falk，K.etal1991；Seeger，F.H.etal.T1999)略加修改，使用HLA-A*02特异性抗体BB7.2或HLA-A、-B、-C特异性抗体W6/32、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以固体组织的免疫沉淀法获得了冷休克组织样本的HLA肽库。

用电喷雾-液相色谱质谱(ESI-LCMS)检测TUMAP

方法一：

方法二：

表7显示了胶质母细胞瘤样本的分析结果，大部分样本均来自原发性GBM肿瘤。18份经过分析的样本中，有三份或以上样本发现了所有的HLA-A*02TUMAP，经过分析的GBM样本中50％以上均检测到5种TUMAP。

表7：检测GBM样本中的I类TUMAP

只纳入了进行I类配体分析的肿瘤样本(“-”＝未检测到IMA950I类TUMAP；“+”＝检测到IMA950I类TUMAP)

4.IMA950MHC-I类提呈肽的体外免疫原性

为了获知关于IMA950包括的肽免疫原性方面的信息，我们使用了Walter，S、Herrgen，L、Schoor，O、Jung，G、Wernet，D、Buhring，HJ、Rammensee，HG和Stevanovic，S等人2003年在Cuttingedge：predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti-CD28-coatedmicrospheres，J.Immunol.，171，4974-4978一文中所述的被广为接受的体外刺激平台进行了研究。用这种方法，IMA950中得到检测的10种HLA-A*0201限制肽都显示出正向免疫原性，这表明这些肽为人CD8+前体T细胞的T细胞表位。MET-005免疫原性不能用此方法检测，因为它在拉长肽中不与HLA-A*02结合。所以，不能产生体外刺激不可缺少的含MET-005的四聚体。然而，对于纳入的HLA-A*02表位MET-001(YVDPVITSI，参见EP1507795B1)，体外免疫原性已得到证实。MET-005在经过APC适当和自然加工后，应可刺激MET-001特异性CTL。MET-001的免疫原性提示，健康供体中提呈MET-001特异性CTL，这也是MET-005成为癌症疫苗有效组成部分的先决条件。因此，MET-001的免疫原性是MET-005免疫原性的重要指标。

CD8+T细胞体外启动

IMA950肽的体外免疫原性

对于受到测试的HLA-I类肽，可通过肽特异性T细胞株的生成证明其体外免疫原性。代表性染色显示了特异性T细胞系的生成，如图1所示。结果总结见表8。

表8：IMA950所含HLA-I类肽的免疫原性

Immatics公司针对IMA950所含的所有HLA-I类肽进行了体外免疫原性实验，结果总结如下。所示结果通过刺激高密度珠CD8+细胞而获得。由于不同批次的血清可能会大大影响免疫原性的结果，所以只评价了那些只使用同一批次血清的化验结果。

5.IMA950II类TUMAPBIR-002的免疫原性

为了确认含有SEQIDNO：12肽的免疫原性，进行了一项临床研究。

主要研究目标是：在未检测到明确的转移病灶且前列腺癌根治术后出现生物化学复发的患者中，对皮下注射前列腺特异性肽(接种疗法)的基于PSA(前列腺特异抗原)的反应(PSA-R)。

该研究设计为前瞻性、随机I/II期研究，适应症为“未检测到明确的转移病灶且前列腺癌根治术后出现生物化学复发”。

研究人群

作为本I/II期研究的一部分，我们试图通过在前列腺癌根治术后出现生物化学复发的HLA-A*02+患者中接种前列腺特异性肽从而诱导PSA衰退作为肿瘤生长停止的指标。

前列腺特异性肽的组合物经皮下注射，并在抗原性结构的各种给药方式下评估各自的免疫反应程度。

相对于以前的疫苗接种研究，本研究计划的目标是治疗肿瘤负荷小且影像学程序不能检测出的患者。所有的患者都使用已知的前列腺特异性抗原结构的同样方式进行免疫，以增强对恶性转化细胞的免疫反应。19例患者接受了治疗。

表9：研究人群的特征

总共％中位数范围年龄196355-77在新/辅助治疗之前无1158放疗316间歇性荷尔蒙疗法211放疗+间歇性荷尔蒙疗法211放疗+化疗15RPXTNM分期T2a-cR0632T3a-cR0632T2a-cR1316T3a-cR1316T3aN2R015Gleason评分5-710538-10316未知632接种前RPX月数419-124OP后首次复发月数141-90开始接种时的PSA0.760.14-10.8

治疗计划

在使用电脑断层扫描和骨骼显像排除明显的转移病灶后，根据不同的给药方式将前列腺特异性肽疫苗皮下注射至在前列腺根治术后检测到PSA复发的患者中(PSA在至少14天间隔的两次测量中上升了50％)。该疫苗在每8天的倍数给予，即第0、7、14、28、42和56天给予(每个肽以及每次注射量约为100微克)。每次接种治疗以及在第70天，测定PSA以评估治疗反应。

如果检测到了肿瘤反应(完全缓解[PSA-CR]、部分缓解[PSA-PR]、或病程稳定[无变化，PSA-NC])，则接受了疫苗的患者根据所选择的给药方式每月维持一次。对患者的免疫治疗反应进行了评估，详细如下：

完全缓解(PSA-CR)：在间隔至少4周后测量确定：最初升高的PSA水平正常化。正常化定义为PSA最低值＜0.2ng/ml，这是完全摘除肿瘤或前列腺的前列腺癌根治术后的预期值。

部分缓解：a)PSA-PR≤80％(在间隔至少4周后测量确定最初升高的PSA水平下降80％)；以及b)PSA-PR≤50％(在间隔至少4周后测量确定最初升高的PSA水平下降50％。)

病情稳定(PSA-SD)：在至少四周后无显著变化。这包括在间隔至少4周后测量确定具有稳定性以及下降小于50％、升高小于10％。

进展(PSA-PD)：PSA水平上升超过10％。如果PSA进展，则终止研究。

在患者进入研究后，使用表位特异性疫苗；考虑在前列腺上皮细胞(如：PSMA/PSCA)中特异性表达的蛋白。除了研究注射疫苗的一般疗效(PSA监测方法评估的残留肿瘤生长分数)，本研究还研究了各种接种方法的效果(免疫系统的有效调制)。除了仅仅单独皮下注射该肽之外，还使用了佐剂的各种组合物。特别是，用了Montanide(适合用于人身上的一个经典的不完全弗氏佐剂)肽疫苗的长效和辅助活性，最近其被描述为十分有利。为此，500μl肽溶液以500μlMontanide混合，之后给药。因此，制成油水乳剂，在数周内缓慢释放水相中所含的抗原。该乳剂的物理稳定性非常高，可在4的环境下储存3个月以上，并且无明显相位分离。Montanide的长效功能数个疫苗接种试验中得到了使用，并且获得良好效果(Okaetal.，2004)。

有一个研究组研究了以生长因子、GM-CSF、注射液伴随刺激期间的接种疗效。GM-CSF是肽接种试验中非常常用的一种佐剂，这些研究中有几个研究报告提高了临床及T细胞反应。最初，GM-CSF为树突状细胞招募和分化因子，被认为可增加疫苗注射部位的树突状细胞的数量。虽然GM-CSF不能自身激活抗原，将细胞提呈为树突状细胞和巨噬细胞，但是有体内间接激活的报道(Molenkampetal.，2005)。

另一个研究组研究了经上皮细胞使用咪喹莫特伴随活化树突状细胞期间接种的疗效。咪喹莫特以5％软膏(Aldara)给予。它通过对TLR7阳性细胞(如：浆细胞样DC、朗格汉斯细胞、皮肤DC)的作用而具有强免疫刺激性，激活MyD88依赖性途径。被激活的APC释放T细胞刺激性和炎症细胞因子，上调共刺激和迁移到引流淋巴结。通过将抗原混合至软膏或通过向皮下或皮内注射抗原部位应用Aldara，从而使咪喹莫特有可能加强肽诱导的CTL反应，这已经在动物模型中得到证明。

另一个研究组通过将树突状细胞与鱼精蛋白稳定的mRNA编码粘蛋白-1混合以将其伴随激活以活化TLR7/8，该组研究了在所述伴随激活期间接种的疗效。mRNA显示了小鼠和人免疫细胞群的广泛激活。该制剂中聚碱性蛋白鱼精蛋白的存在提高了mRNA的半衰期并诱导了可能长效粒子的形成。因此，这种佐剂可与长效特性和APC激活特性结合。

总之，该疫苗的给予方式包括以下方法：

-Montanide乳化肽疫苗的皮下注射

-500μlMontanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合外用225μlGM-CSF，以期达到伴随生长因子给药所引发的更强的免疫反应

-500μlMontanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合局部热疗，后者的目的是达到热诱导的更强的免疫反应

-500μlMontanide中乳化肽疫苗的皮下注射联合经上皮给予咪喹莫特，以通过TLR7激活树突状细胞

-500μlMontanide中乳化肽疫苗与55μl粘蛋白-1mRNA/鱼精蛋白一起皮下注射，以通过TLR7/8激活树突状细胞

日程表：本研究为期3年。

前列腺特异性肽疫苗在第0、7、14、28、42和56天给予患者。对于病情稳定或获得客观肿瘤反应(PSA-CR或PSA-PR)的患者，每月皮内注射接种一次疫苗直到发生可检测到的进展。根据迄今为止的经验，肽注射液可耐受且没有明显不良反应。由于对接种疗法的反应仅根据PSA测量进行了血清学评估，因此，在研究开始时进行一项测试以确定注射的疫苗是否干扰体外的PSA测量值，这可刺激临床反应。在第0、7、14、28、42、56和70天，抽取血液样本做化验、PSA水平、血细胞分类计数、FACS分析和细胞因子测试。如果连续治疗到第70天，则进行为期6周的PSA监测，以便及时发现治疗失败。

如果疾病进展得到证明且伴有PSA持续升高，则结束治疗。

该实验室测试包括凝血、电解质、LDH、β2-M、CK、肝酶、胆红素、肌酐、尿酸、总蛋白、CRP、涂片血细胞分类计数、PSA水平、细胞因子、FACS、Elispot。

皮肤对定义细菌和真菌抗原的反应(注射48-72小时后，T细胞介导的迟发型超敏反应(DTH))的分析在本研究开始前将作为患者细胞免疫系统的分析。

研究所需的肽(九肽)由PDDr.StefanStevanovic实验室在Prof.H.-G.Rammensee部制造。这些肽用HPLC法进行纯化并进行质谱分析。这些肽的纯度也可用HPLC、质谱和Edman测序法进行检查。使用这些方法，纯度可高达98％(根据当前方法的状态必须视为最高值)。所合成的肽溶于DMSO(CryoSure，WAKChemieMedicalGmbH；10mg/ml)中，在Ampuwa(FreseniusKabi)中稀释为1∶10，并在无菌条件下分成等份。

临床反应

在两名患者中，在连续直肠指检发现局部肿瘤后，PET-CT扫描可显示局部复发。在其余的17名患者中，在终止研究时，无法证实疾病活跃部位。

血细胞分类计数或大量临床化学的的重复实验室评估未发现研究期间有任何异常。

在这19例患者中，有16例对根据SEQIDNO：12所述的生存素II肽(IFN-gELISPOT，+/-ICS)发生反应。其中，有12名患者在疫苗接种后，诱导了抗生存素T细胞反应。有2名患者之前存在抗T细胞以及2名患者未确定之前是否存在丰富的抗生存素T细胞。

生化反应

根据PSA初次升高后合作实验室最低可检测值，完全反应被视为不可检测的PSA值。测量值必须在至少间隔4周后确认。PR＞80％和＞50％必须在四周后做相应的重新评估。PSA下降小于50％或升高小于10％反映了病情稳定(如果在至少四周后确认)。

疾病进展被视为在治疗开始时PSA上升超过10％。

终止研究的患者的生化反应得到跟踪，直到他们获得了放射或抗荷尔蒙疗法的进一步治疗。

19例患者同意参加并且对数据进行了分析，随访最长为时约3.75年。

PSA稳定性和DT升高

这两名患者在每次接种肽疫苗时都在给药部位皮下注射咪喹莫特。

PSADT升高，PSA不稳定

第11号患者的PSADT在研究的六个月期间从1.5个月上升至10.1个月。开始时他的PSA值为10.8ng/ml，在终止研究程序接受抗雄激素单一疗法时，进展至17.8ng/ml，但PET-CT未发现可见的恶性病变。他接受了Aldara作为佐剂。

PSA进展

*研究结束或随访结束时的PSADT未纳入患者数据。5由于PSA下降

7.将本发明中的HLA-I类限制肽与HLA-A*0201结合

目的和摘要

本分析的目的是评价HLA-I类肽对HLA-A*0201等位基因编码的MHC分子的亲和力，因为这是IMA950作用模式的一项重要参数。IMA950和MET-001中全部10种HLA-I类限制肽都对HLA-A*0201具有中度至高度的亲和力，解离常数(KD)范围为0.14(MET-001)到2.05nM(CSP-001)。所有值均在0.1(强力结合剂HBV-001)至4.4(中等强度结合剂MUC-001)。这些结果证实了IMA950候选疫苗和MET-005衍生的MET-001的所有HLAI类肽均对HLA-A*02具有结合亲和力。

测试原理

稳定HLA/肽复合物包括三种分子：HLA重链、β-2微球蛋白(b2m)和肽类配体。变性重组HLA-A*0201重链分子的活性便可进行保存，使之功能与“空载HLA-A*”相当。被稀释为包含b2m和相应肽的水缓冲液后，这些分子以完全肽依赖方式迅速有效地折叠。这些可用的分子用于基于ELISA的检测方法中，来衡量肽和HLA-I类分子相互作用间的亲和力(Sylvester-Hvid等，2002)。

纯化的重组HLA-A*0201分子与b2m、不同等级剂量的肽一起培养。与不具备HLA-I类结合能力的全长MET-005相反，通过自然抗原加工、MET-005体内产生并被证实的A*0-结合产物MET-001被纳入分析。从头折叠HLA/肽复合物的量用定量ELISA法测定。解离常数(KD值)使用从校准HLA/肽复合物稀释液中记录的标准曲线进行计算。

结果

结果如图2所示。较低的KD值反映了对HLA-A*0201具有较高的亲和力。大多数IMA950肽对HLA-A*0201都具有相似的较强亲和力，范围为0.1(HBV-001，强力结合剂)到44.4nM(MUC-001，中等强度结合剂)。因而，所有IMA950I类TUMAP均对MHC分子A*02具有中等至较强的亲和力。

8.本发明HLAII类限制肽与HLA-DR的结合

II类TUMAP激活辅助性T细胞，辅助性T细胞在协助I类限制TUMAP引发的CTL功能中起到了至关重要的作用。IMA950II类肽与集中不同的HLA-II类分子结合(混杂结合)对于确保多数接受候选疫苗IMA950的患者能够从支持性辅助T细胞反应中获益非常重要。例如，最显性表达的人类HLA-II类分子HLA-DR具有高度多态性，含有数百种已知等位基因。基于HLA-DRB1单体型的已知等位基因频率和完善的结合算法，可预测，IMA950——IMA-BIR-002和IMA-MET-005——中的HLAII类配体均是混杂HLA-DR结合肽。具体来说，对于两种IMA950II类TUMAP，HLA-A*02-阳性白种人表达至少一种适当的HLA-DR等位基因的概率大于90％。至于其余的人II类等位基因HLA-DQ和HLA-DP，由于缺乏频率数据或结合预测算法，从在此计算中忽略，实际混杂比例很有可能更高。对于已知的泛DR表位(PADRE，基因型频率Fproiected＝93.1％)，两种IMA950OII类TUMAP计算所得的混杂性范围相同。此外，这些肽的混杂结合在实验中通过体外结合方法进行了确认。另外，对于IMA-BIR-002，证实了体内高免疫原性(见前文)。总而言之，这些结果确认了MET-005和BIR-002是混杂HLA-DR结合肽。

结合预测定律

使用了HLA-A*02阳性白种人人群中的已公布的HLA-DR单体型频率(Morietal.，1997)以及高清晰度单体型频率(Chanocketal.，2004)(见表2)。该单体型频率是个体染色体上独特等位基因的频率。由于哺乳动物细胞内的二倍体染色体组，该等位基因的基因型出现频率较高，可以使用Hardy-Weinberg定律进行计算(基因型出现频率F中的单体型频率Gf结果(F＝2Gf-Gf2])。

已知SYFPEITHI矩阵的DRB1-单体型频率和A*02+白种人人群中的已知个体频率之和为47.8％。因此，预计II类TUMAP与这些等位基因的结合分布为剩余的52％DRB1等位基因，这些数据尚未获得。

最后，混杂结合被定义为一种肽与几种HLA-DR等位基因结合，并且其中之一在白种人群中表达的概率至少为50％。

体外结合检测方法原则(ProImmuneREVEALTM)

IMA-BIR-002和IMA-MET-005与HLA-DR宽抗原(HLA-DR1至DR7，也包括分裂抗原HLA-DR11至-DR15(Morietal.，1997))集合，并使用REVEALTMMHC：肽结合分析方法(ProImmune，Oxford，UK)以确定合并入MHC分子的水平。在此检测方法中，结合力与合格/不合格对照结合剂、以及每种HLA-DR抗原阳性对照肽的结合力进行比较。

根据SYFPEITHI算法预测，IMA-BIR-002和IMA-MET-005可能分别与含已知结合基序的7/8、8/8HLA-DR等位基因结合(表11)。对于IMA-BIR-002或IMA-MET-005，HLA-A*02阳性白种人表达至少一种适当的HLA-DRB1等位基因的概率分别为92.6％和接近100％。因此，两种IMA950II类肽被预测为是混杂HLA-DR结合剂。

如果结合HLA-DRB1等位基因的单体型频率通过本方法的第二个因数被估计过高，则其在IMA950中对于所有II类TUMP的基因型发生率仍然高于50％。此外，IMA-BIR-002与HLA-DR1、3、4和11的混杂结合的实验性确认通过体外结合数据进行(图3)。覆盖完整序列的两种重叠15聚体的IMA-MET-005体外结合数据表明与HLA-DR11结合；然而，ProImmuneREVEALTM旨在作为一种确认潜在HLAII类表位的筛选工具。用此检测方法，性能良好速度慢的HLA-DR结合剂可报告为假阴性并且为非结合剂。因此，从ProImmuneREVEALTM体外阴性数据中不能推导出IMA-MET-005体内HLA-DR结合的非混杂性。因此，很可能在基于IMA950的免疫接种中，有IMA-MET-005的混杂性HLA-DR结合。由于缺乏其它II类基因位点、HLA-DQ和-DP的结合性质和频率方面的数据，这些分子在计算中忽略。然而，这些分子对于IMA950II类TUMAP有进一步的结合机会。

由于在针对含不同HLA-DR等位基因的前列腺癌患者的临床试验中已经证明IMA-BIR-002具有广谱免疫原性，该II类肽的混杂性已在体内得到明确证实。总之，IMA950包含的这两种II类肽的HLA-DR结合特性的电脑模拟分析以及体外检测和BIR-002临床试验的其它实验证据强有力地表明，这些TUMAP是人II类HLA分子的混杂结合剂。

表11：IMA950II类TUMP与含已知结合基序的HLA-DR等位基因的结合分数。表中显示的是白种人群中最常见HLA-DRB1等位基因的SYFPEITHI结合分数。p为HLA-A*02阳性白种人的单体型频率。如果分数等于或大于18，则肽被视为与HLA分子结合。结合DRB1等位基因的p值累积为最小单体型频率pmin。所有DRB1等位基因(包括含不完全结合预测矩阵或频率数据的等位基因)的这些频率的外推法获得了与基因型出现频率Fprojected对应的预计单体频率pprojected。n.d.＝无数据

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机译：采用基于纳米粒子的癌症疫苗接种的组合治疗，用于治疗手术后肿瘤复发

机译：肿瘤治疗和冷等离子体的组合对抗癌症

机译：肿瘤裂解物与肽负载树突细胞疫苗接种策略的结合，用于积极的癌症免疫治疗。