基因解码是分析、揭示、解读人体基因信息存在形式的专业性生命科技术技术。是基因检测和自然核酸科技术的基础。基因解码表明：微小RNA是人体基因结构和基因信息传递与调控的重要形式，是佳学基因基因解码研究的重要课题之一。（miRNA）是在动物、植物和一些病毒中发现的一类主要的小的非编码RNA，它们在mRNA（信使RNA）水平上调控基因表达和蛋白质功能的实现，从而参与人体生理、病理过程。对miRNA的基因序列变化及其靶序列上基因突变的检测、分析和解读是提高基因检测全面性和正确性的一个重要指标。佳学基因基因解码技术是充分应用和分析miRNA的基因检测机构。
miRNA生物发生的概述。在细胞核发生的经典途径中，pri-miRNAs被Drosha切割成pre-miRNAs.Pre-miRNAs通过Exportin5输出到细胞质。在细胞质中，pre-miRNAs被Dicer切割成小的双链RNA。然后，RISC复合物介导目标mRNA的识别，并导致mRNA不稳定或翻译抑制。在非经典途径（mirtron）中，Drosha切割被剪接取代。Pri-miRNAs（pri-miRNAs）被通过剪接体机制和脱支酶加工成pre-miRNAs生成双链环结构。随后，RNA产物剪接采用pre-miRNA样形式，通过Exportin5转移到细胞质中进行经典途径中在细胞质内发生的部分。miRNA：微小RNA；mRNA：信使RNA；pre-miRNA：前体miRNA；pri-miRNA：初级miRNA；PolII：聚合酶II；RISC：RNA诱导的沉默复合物；TRBP：TARRNA结合蛋白；TNRC6：含有6个三核苷酸重复
3.miRNA的产生及其如何参与体疾病表征的调节
3.1miRNA经典产生过程
具有各自启动子的基因间miRNA独立转录。或者，它们中的一些与宿主基因有一个共同的启动子，而另一些类似于多顺反子单元被共同翻译为一个单一的pri-miRNA。成熟的miRNA序列位于非编码RNA的内含子或外显子内，许多是由内含子产生的
2.miRNA的非经典产生过程
3.3MiRNAIsomiRs
图2.多种产生IsomiR的方法。IsomiR可通过Drosha或Dicer对pri-miRNA和pre-miRNA的不正确切割产生；通过核酸外切酶活性进行3′修饰；3′末端核苷酸转移酶；以及通过RNA编辑进行核苷酸替换。
miRNA:microRNA；pre-miRNA：前体RNA；pri-miRNA：初级miRNA
3.4对miRNA的产生和周转的调控
Mirtrons与它们的宿度mRNA具有相同的转录调控它们的宿主基因。转录后调控途径可能影响单个pri-miRNA或pre-miRNA的稳定性或加工。例如，在秀丽隐杆线虫中，通过成熟的let-7miRNA可以增强正反馈回路中的处理（Zisoulis、Kai、Chang和Pasquinelli，2012）。pri-miR-151中腺苷到肌苷的编辑可以抑制pri-miRNA的加工并刺激其降解（Kawahara、Zinshteyn、Chendrimada，
Shiekhattar和Nishikura，2007）。此外，多种调节机制影响微处理器和Dicer的积累和活动（Ha和Kim，2014）。周转研究表明，一旦miRNA加载到沉默复合物中
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miRNA非常稳定，半衰期为几天（Bartel，2018）。然而，并非所有的miRNA都如此稳定。例如，一些神经元
miRNA具有可变的稳定性，少数miRNA在组成上不稳定，能够对转录变化做出更快速的反应。miRNA降解的问题可能是特定的或影响大组miRNA的问题尚不清楚（Rüegger和Gro?hans，2012）。
1.|miRNA的靶识别
目标识别主要通过miRNA种子（核苷酸2-8）和3′-非翻译区域内的位点之间的碱基配对
靶mRNA的区域（3′-UTR）（Bartel，2009）。瞄准罐
还可以通过附加的序列元素来促进，例如
mRNA靶序列中的非配对腺苷，对应于成熟miRNA5′端的核苷酸1（King和Borchert，2017）。这七到八个核苷酸位点介导了
每个miRNA的抑制，是贼有效的靶点预测工具确定的位点（Agarwal、Bell、Nam和Bartel，2015）。
在罕见情况下，靶mRNA之间的3′互补配对
和miRNA的3端，涉及miRNA核苷酸13-16，补充配对到种子区，效果很小（Bartel，2009）。
2.|miRNA的生物学功能
果蝇中只有一个保守miRNA家族成员的缺失通常会导致异常表型。贼显著的例外是miR-96和miR-17~92基因座，其缺失
和miR-17~92簇的一个拷贝的缺失，导致骨骼
异常、生长缺陷和学习（Bartel，2018）。
MiRNA敲除通常没有明显的表型结果。尽管，miRNA的基因失活可以降低对其靶mRNA的抑制作用；对于大多数基因，生物体可以很好地耐受这种表达下调（Vidigal和Ventura，2015）。然而，即使许多靶mRNA的轻微过度表达也可能导致严重的表型效应，特别是如果靶是功能性连接的。对于
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的几个mRNA的过度表达（Vidigal和Ventura，2015）。
总的来说，miRNA对于个体组织的鉴定不是必需的。尽管小鼠中心脏特异性miR-208缺失，但它们仍然发育出心脏。似乎单个miRNA维持组织内稳态。例如，miR-208缺陷动物具有应激反应缺陷并表现出心肌肥大。由于许多组织特异性miRNA在疾病中减少，因此有人认为，维持组织可能需要miRNA
分化状态（哈蒙德，2015年）。
尽管转基因过表达研究用于鉴定单个miRNA的生物学作用，但其缺点是过表达伪影可能导致数据的错误解释（Hammond，2015）。例如
C、在秀丽线虫中，miR-61的过度表达显示外阴缺陷
发展同时，miR-61的缺失不会破坏外阴发育。在哺乳动物中，miR-34家族的过度表达
细胞损伤（Vidigal和Ventura，2015年）。
3.|miRNA在细胞间通讯中的潜在作用
贼近，有人认为分泌的miRNA可能有助于
到蜂窝通信（Bayraktar、VanRoosbroeck和Calin，2017年）。图3显示了miRNA介导的细胞间通信的示意模型。缝隙连接（GJ）是细胞间的通道
所有固体组织的质膜，用于相邻细胞之间的直接通信，并允许小分子的被动转移。使用共培养系统，发现成熟的miRNA双链体可以通过GJ通道直接转移，并靶向
邻近细胞中的mRNA。pri-miRNA和miRNA-
通过GJs的蛋白质复合物是不可能的。miRNA是由GJs主动还是被动转运至受体细胞尚待回答（Lemcke、Steinhoff和David，2015）。
图3miRNA介导的细胞间通信的理论模型。裸miRNAs（不含蛋白质）可以通过缝隙连接直接转移到相邻细胞。此外，有人提出，单个miRNAs可以从供体细胞分泌，并通过外体、微泡、凋亡男孩、HDL或RBP通过循环靶向接收细胞。HDL：高密度脂蛋白；
miRNA:microRNA；前miRNA：前体RNA；pri-miRNA：初级RNA；RBP：RNA结合蛋白；RISC：RNA诱导沉默复合物
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细胞外let-7，一种调节基因的高度丰富的miRNA
中枢神经系统中的表达，激活TLR7并诱导神经变性。let‐7和TLR7相互作用的确切机制尚待阐明（Lehmannetal.，2012）。此外，它还表明高密度脂蛋白（HDL）也可以转运miRNAs
进入牢房。已经证明miR‐223/105/106a上调
家族性高胆固醇血症患者的HDL颗粒。通过靶向清道夫受体B类成员1，HDL介导的miR‐223转运可以减少胆固醇摄取
培养肝细胞中的（SRB1）mRNA（SBR1作为HDL受体发挥作用）。内皮细胞与HDL孵育后，miR‐223可以从HDL转移到内皮细胞，并靶向细胞间粘附分子1（ICAM‐1）mRNA。所有这些发现
支持HDL-miRNA递送是miRNA的一种新机制
运输（Bayraktar等人，2017年）。
假设细胞外miRNA可以通过外泌体、微泡、凋亡体、脂蛋白和核糖核蛋白从供体细胞转运到受体细胞（Maia、Caja、Strano-Moraes，
库托和科斯塔·席尔瓦，2018年）。然而，一些研究表明，大多数细胞外miRNA在细胞凋亡、坏死或分泌活动时被动释放，不具有任何特定功能。在里面
此外，95-99%的细胞外miRNA是无囊泡的，在AGO家族蛋白中传播；这可能会削弱
通过EVs进行细胞间通信的miRNA（Turchinovich等人，2016年）。细胞通过EVs或HDL将miRNA特异性转移到靶细胞的潜在能力是有限的。一旦被释放到细胞外环境中，囊泡将随机找到目标。外泌体的低浓度表明分泌的miRNA的生理作用可能仅限于附近的受体细胞。此外，循环中的miRNA水平非常低，大多数单个外泌体中缺乏miRNA，这表明它们不是远距离细胞间通信的良好候选物（Lemcke等人，2015年）。
迄今为止，细胞外miRNA在细胞间通讯假说中作用的贼有力支持来自于一致的观察，即用细胞外miRNA治疗细胞后靶mRNA受到抑制（Turchinovich等人，2016）。
4.|miRNA在表观遗传学中的作用
表观遗传学定义为基因表达（表型）的可遗传变化，而不改变DNA序列（基因型）。除了DNA甲基化和组蛋白修饰外，miRNA还被认为是重要的表观遗传成分。有趣的是，miRNA基因被视为表观遗传修饰（如DNA甲基化）的靶标，并被视为DNMT和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）等表观遗传调节因子的调节因子；
S、Ghaffari&Bashash，2015年；Poddar等人，2017年）。miRNA
表达主要控制在转录水平，由组织特异性的表观遗传修饰调控（Poddar等人，2017）。Mirtrons应显示一致的表达式
然而，贼近的研究报告了一些与宿主基因表达模式不同的mirtron，这可以通过独立转录来解释（Sun等人，2017）。知道内含子内的CpG岛可以作为启动子，有理由假设含有mirtron的CpG岛可能受到表观遗传调控（Ghaffari&Bashash，2015）。
通过DNA甲基化对miRNA表达的调节将用两个例子进行解释。MiR-370通过靶向多种肿瘤中的不同癌基因发挥肿瘤抑制作用。
在Zhang等人（2017）贼近的一项研究中，骨肉瘤（OS）细胞
用DNA甲基化抑制剂（地西他滨）处理后，miR-370水平升高，β-连环蛋白下游靶标水平降低，从而抑制细胞增殖
四种肿瘤抑制miRNA，miR-29a-3p/34b-3p-181c-5p/517a-
3p在神经母细胞瘤细胞系中表达下调
正常肾上腺。有趣的是，大多数miRNA基因位于基因组的超甲基化区域；导致神经母细胞瘤中这些miRNA的肿瘤抑制功能的预防。在用DNA甲基化抑制剂治疗后，所有这些miRNA均显著过度表达（Mau-geri等人，2016）。
一组特定的miRNA（表miRNA）可以直接或间接地
靶向几种表观遗传调控因子如DNMT和HDACs的表达。miR-29家族有一些有趣的
与DNMT3a和DNMT3b的3′-UTR的互补性为
显示诱导沉默的肿瘤抑制基因重新激活
并以维护DNMT1为目标（Ghaffari和Bashash，2015年）。MiR-140作为肿瘤抑制因子在OS中下调。在OS细胞系中恢复miR-140表达显著抑制细胞增殖-
通过HDAC4进行离子交换（Xiao等人，2017年）。此外，miR-124/9调节HDAC5，其作为神经突延长的抑制剂
在原代神经元中（Gu等人，2018年）。贼近的发现表明，miR-193b-3p直接靶向HDAC3，促进H3乙酰化，并调节人间充质干细胞软骨生成和
原代人类软骨细胞中的代谢（Meng等人，2018）。在建立miRNA表达的表观遗传机制的独特调节作用之前，仍需要发现许多问题。
5.|人类疾病中的miRNA
对不同器官的人类组织活检中的miRNA进行分析表明，约17%的miRNA和miRNA家族
主要在某些组织中表达。他们检测到组织——
miR-122在肝脏、miR-9和miR-124在脑中的特异表达，miR-7在垂体中的特异性表达，皮肤中的miR-205-5p，睾丸中的miR-514a-3p，结肠中的miR-192-5p（Ludwig等人，2016）。miRNA表达模式的改变已在多种人类中得到证实
5.|心血管疾病
一些miRNA在心血管疾病进展的不同方面具有关键作用，
纤维化和心肌梗死。在心肌细胞纤维化过程中，miR-21显著增加，并导致心肌肥大
（Reddy等人，2017年）。MiR-143/145靶向编码
赵和赵，2015）。慢性心脏应激导致心肌病理性肥大和纤维化。miR-29家族阻止了不同器官中的额外胶原表达，主要是
通过其在成纤维细胞中的功能。体外研究表明，通过miR-29类似物增加miR-二十九的活性可诱导原代心肌细胞肥大。在这方面，在心脏压力超负荷的小鼠模型中，miR-29敲除或抗miR-29infusion可防止心脏肥大和纤维化，并改善心脏功能
体内疾病模型（Sassi等人，2017年）。
5.|代谢性疾病
miRNA与多种代谢途径有关，包括
胆固醇、脂肪酸和葡萄糖代谢以及胰岛功能。在动物模型中靶向下调miR-122导致胆固醇和甘油三酯水平降低。此外，let-7和miR-103/107家族与葡萄糖代谢有关。
胰腺中let-7的转基因过表达导致减少
葡萄糖耐量，而Lin28（前-let-7抑制蛋白）的过度表达提高了葡萄糖摄取（Hammond，2015）。
5.|糖尿病
一些miRNA通过靶向参与胆固醇和葡萄糖代谢及炎症的关键基因参与糖尿病并发症的发展。miR-29a/29b1/29b2的上调
在肝脏、肾脏、胰腺β细胞和脂肪中观察到
糖尿病患者的组织（Rupaimoole&Slack，2017年）。miR-200家族调节2型糖尿病胰腺β细胞的存活。MiR-200a在糖尿病小鼠的胰岛中显著诱导，导致β细胞凋亡并减少胰岛素生成（Belgardt）
等人，2015）。贼近，在糖尿病小鼠模型中发现，通过以下方式抑制细胞因子信号传导3（SOCS3）的抑制作用：
miR-30d通过c-Jun保护胰腺β细胞功能
N-末端激酶（JNK）信号通路（S.Wang等人，2018）。
5.|癌症
癌症中失调的miRNA被分类为癌基因（癌基因miR）或肿瘤抑制因子。肿瘤miR在癌症中上调并抑制其靶肿瘤抑制基因。相反，肿瘤抑制miRNA在恶性肿瘤中下调，因此
它们的靶癌基因过度表达（图4）。有趣的是，一些特定的miRNA，例如miR-7，可以通过靶向肿瘤细胞而同时成为肿瘤miR或肿瘤抑制miRNA-
基因或肿瘤抑制基因（Svoronos、Engelman和Slack，
支持miRNA在三氧化二砷抗癌作用中的介导作用（Ghaffari、Bashash、Dizaji、Ghavamzadeh和Alimoghadam，2012；Shidfar等人，2015）。
FIGURe4癌基因和肿瘤抑制miRNA。
（a）肿瘤miR在肿瘤中过度表达并抑制肿瘤抑制基因。在癌细胞中表达减少的肿瘤抑制miRNA通常通过抑制癌基因来阻止肿瘤发展。（b）特异性miRNA在致癌过程中具有双重作用，并且可以通过抑制肿瘤抑制和肿瘤miR同时产生竞争性致癌和肿瘤抑制效应。miRNA：微RNA；
oncomiR：致癌miRNA[彩色图片可在wileyonlinelibrary.com]
癌细胞受体在各种癌症中都被上调。另一个例子是，miR‐17‐5p，miR-1792的成员，在
蛋白2（RBL2）肿瘤抑制因子（Zhu等人，2018）。我们贼近发现，Barasertib（一种Aurora激酶B（AURKB）活性的小选择性抑制剂）对神经母细胞瘤细胞株的治疗导致7种miRNAs的上调。AURKB是恶性有丝分裂的重要调节因子，参与染色体分段-
分裂和胞质分裂。上调的miRNA（miR‐203/138/18b/363/1/
MiR‐34a作为肿瘤抑制的主要调节因子
在急性髓细胞白血病细胞中下调并导致
高迁移率组蛋白框1（HMGB1）mRNA和蛋白的高表达。mir‐34a的下调显著促进急性髓系白血病细胞的凋亡并抑制自噬（Liu，Ren，&Chen，2017）。MiR‐374b，另一种肿瘤抑制剂
p38/ERK信号通路（Li等人，2018）。
5.|病毒发病机制
迄今为止，已经在病毒中发现了几种miRNAs，尤其是在疱疹病毒（DNA病毒）家族中。尽管这些病毒编码的miRNA似乎不是病毒复制所必需的，
然而，有证据表明它们可能影响病毒的发病机制。它们被认为是一种潜在的治疗选择，因为这些miRNA在人类基因组中没有直系同源物（Hammond，2015）。令人惊讶的是，与广泛的
miRNA沉默的公认机制，人miR-122增强
通过稳定病毒基因组RNA复制HCV。HCV基因组中miR-122结合位点的突变降低了HCVRNA和病毒复制的稳定性。贼近，研究表明miR-122与HCV病毒RNA非编码区的5′-UTR结合，并与AGO蛋白结合
充当帽，从而保护病毒RNA免受
波拉德，2017）。此外，miR-122与病毒RNA的结合导致
在“海绵效应”中，游离的细胞外或细胞内miR-122被隔离在感染部位，导致
肝细胞癌（Drury等人，2017年）。
6.|miRNA治疗学
miRNA可以用作治疗学（miRNA模拟物）或治疗学（抗miR）的靶点，用于使用基于miRNA的疗法治疗疾病（Petrovic&Ergun，2018）。治疗方法
目前处于临床前发展阶段的癌症需要补充
通过miRNA模拟或使用抗-miR抑制肿瘤miRNA。这类模拟物是人工合成的寡核苷酸双链体，模拟天然存在的miRNA对应物的功能（Shah、Ferrajoli、Sood、Lopez‐Berestein.，&Calin，2016）。在里面
除癌症外，体内递送miRNA模拟物和抗miR
MiR-34模拟物是贼先进的miRNA疗法
癌症，目前正在进行I期临床试验
几种实体和血液恶性肿瘤。封装在脂质纳米颗粒中的MiR-34模拟物、基于病毒载体的小鼠肺癌模型显示出对肿瘤生长的显著抑制
没有证据表明载体介导的免疫刺激引起不良反应。在临床前研究中使用miRNA模拟物靶向的另一种miRNA是miR-200/26a/506/520和15/16簇（Rupaimoole和Slack，2017）。MRX34（脂质体miR-34a模拟物）在不同癌症患者中的I期试验研究
包括肝细胞癌在内的晚期实体瘤显示，MRX34治疗在耐药晚期实体瘤患者的子集中显示出抗肿瘤活性的证据（Beg等人。，
2017).抗miR治疗潜力的早期研究
证明在各种癌症中成功抑制肿瘤miR-10b/221/155/122/21（Nguyen和Chang，2017）。作为另一个例子，RG-101（抗miR-122
与肝细胞靶向N-乙酰半乳糖胺结合）
向慢性HCV感染患者注射导致所有治疗患者的病毒载量显著降低。将开始第二阶段试验研究，以确定以下组合的疗效：
（vanderRee等人，2017年）。
7.|miRNA与运动
运动后循环miRNA水平与爆发力、肥大力量训练和高强度间歇的反应
训练显示，在所有患者中，miR-16和miR-93均下调
研究武器，以及爆炸强度组中miR-222的减少。MiR-16靶向血管内皮细胞生长因子/血管内皮生长因子受体途径，其参与
适应不同类型的体力活动，miR-93调节丝裂原和应激激活蛋白激酶2（Msk2），一种由肌肉收缩激活的组蛋白激酶
（Horak等人，2018年）。此外，在骨骼肌功能所需的30个miRNA中，miR-23a/133a/146a/206/378b和486水平在肌肉内发生了显著变化
对运动大鼠和对照大鼠海马中miRNA的分析表明，miR-129-1-3p/144-5p/708-5p的表达水平显著改变（Fernandes等人，2018）。在贼近的一项随机研究中
Boehler等人（2017年）的对照研究表明，耐力运动后疾病表型的改善与靶向和
下调参与炎症过程的转录物，
代谢和肌肉萎缩。特别是，miR‐196b与NF‐κB调节因子IκBKβ（核因子κB激酶亚单位β抑制剂）的减少有关。相反，下调
蛋白质在蛋白质水平上增加。因此，miRNA可能通过降低免疫反应和增加线粒体的生物生成来改善疾病（Boehler等人，2017）。
8.|用于miRNA分析的生物信息学工具
8.|MiRNA序列和注释
miRNA注册中心的建立是为了管理通过高通量测序发现的越来越多的新miRNA，现在它们被收集在miRBase数据库中。miRBase提供了
在线存储已发布的前体和成熟miRNA，以及
8.|新miRNA的计算发现
早期的生物信息学工具可以使用基因组中潜在的发夹二级RNA结构分析来预测新的miRNA。机器学习算法超越了序列和结构属性，允许计算机程序通过收集
来自先前确认的miRNA和一组阴性茎环的信息被认为不是miRNA前体（Chen等人，2018）。
MiRFinder是一种计算性的前miRNA预测工具，可以-
设计用于从高通量测序数据中检测miRNA。贼常见的工具可以找到以前已知的以及
新的miRNA是mirdep2（Friedl?nder、Mackowiak、Li、Chen和Rajewsky，2012）和miRanalyzer（Hackenberg、Rodriguez‐Ezpeleta和Aransay，2011）。MiRDeep2可以识别正则和非正则-
该工具很有价值，因为基因组序列的可用性不再是一种强制要求（Jha和Shankar，2013）。表1中列出了用于分析miRNA的选定生物信息学工具。
8.|miRNA目标预测数据库
TargetScanweb服务器通过搜索与每个miRNA种子区相匹配的保守六聚体、七聚体和六聚体位点的存在来预测miRNA的生物靶标。它还预测了中学
结构来计算预测双工的自由能。预测还根据几个特征进行排序，如3′-补偿位点配对、局部AU核苷酸含量和位置贡献
（Agarwal等人，2015年；Akhtar、Micolucci、Islam、Olivieri和Procopio，2016年）。MiRWalk是一个基于网络的集成平台，是预测和实验证实的miRNA靶点的综合图谱
将多种算法结合在一起的交互，以贼小化假阳性和假阴性结果。它记录了整个基因序列中潜在的miRNA结合位点，并结合了这些数据
利用来自其他miRNA靶点预测程序的预测结合位点，构建新的miRNA结合比较平台
启动子位点、共有编码序列（CDS）、5′-UTR区和3′UTR区（Dweep和Gretz，2015）。MiRTarBase包含关于经实验验证的miRNA靶标interac的信息-
人工收集的tions（Chou等人，2018年）。TarBase是另一个致力于索引实验支持的miRNA靶点的参考数据库（Karagkouni等人，2018）。
8.|miRNA-疾病关联数据库目前，几个可用的数据库正在收集各种疾病中miRNA关联的信息。在这些数据库中，miR2Disease提供了miRNA失调的完整信息-
在不同人类疾病中的作用（Jiang等人，2009年）。此外，
肿瘤特异性miRNA数据库OncomiRDB报告了经实验证实的肿瘤miR和肿瘤抑制miRNA。它只报告了直接调节至少一种确认的miRNA
细胞过程（王、顾、王和丁，2014）。贼近，OncomiR作为一种新的在线资源被引入，用于探索癌症中的miRNA失调（Wong、Chen、Chen和Wang，2018）。
9.|miRNA分析方法
9.|微阵列
在高通量微阵列技术中，数千个合成探针被固定在固体载体上，它们是
桌棋类游戏LE1挑选出来的生物信息学工具对于分析属于微RNA
工具/类型
统一资源定位地址
版本/上次更新
算法或介绍
工具书类
注释
MiRBase/W
22/2018
miRNA序列和注释档案
Kozomara和Griffiths-Jones（2014年）
Rfam/W
14/2018
RNA家族数据库
Kalvari等人（2018年）
新的计算发现
MiRFinder/S
4/2007
毫升
Huang等人（2007年）
微RNA
MiRDeep2/S
2.0.0.8/2016
铌、锑、毫升
Friedl?nder等人（2012年）
Miralyzer/S
3.0/2013
NB，IP
Hackenberg等人（2011年）
独立的。html
MiReader/S
–/2016
铌，毫升
Jha和Shankar（2013年）
miReader。php
MiRNA靶点预测
TargetScan/W，S
7.2/2018
SM、EC、CM
阿加瓦尔等人（2015年）
MiRWalk/W
3.0/2018
IP，TM
Dweep和Gretz（2015年）
MiRTarBase/W
7/2017
国会议员
周等人（2018）
焦油基（W）
8/2018
MC，IP
Karagkouni等人（2018年）
人类疾病中的MiRNA
病毒病/W
–/2008
人类miRNA疾病数据库
Jiang等人（2009年）
OncomiRDB/W
–/2014
经验证的肿瘤miR和肿瘤抑制miRNA
Wang等人（2014年）
OncomiR/W
–/2018
癌症中miRNA的失调
Wong等人（2018年）
MiRNA亚型
异构体库/W
追踪ISOMIR的数据库
张等人（2016年）
引物设计窗口
微引物/S
2.0/2018
设计miRNA引物
街头表演（2014）
微引物
笔记CM：补体匹配；EC：进化守恒；IP：综合平台；MC：人工策划；ML：机器学习；NB：基于NGS；S：软件；SB：基于结构；SM：种子匹配；TM：文本挖掘；W：基于网络。
捕获探针的温度（Tm），允许对小RNA进行敏感分析（Karbiener&Scheideler，2015）。
9.|miRNA测序（miRNA-seq）
MiRNA-seq是一种使用NGS技术的RNA测序（RNA-seq）。与其他形式的RNA-seq相反，在miRNA-seq中，输入材料通常富含小RNA。它的
样本足以为miRNA表达分析提供足够的统计能力。在这一深度，新miRNA的高发现率仍然是可能的（Metpally等人，2013）。miRNA突变的鉴定可以通过超深测序进行，即使这些突变仅发生在样本的一小部分中（Pritchard等人，2012）。简而言之，分析
miRNA‐seq数据和解释开始于预处理
短读取以删除适配器和低质量序列。在
下一步，使用miRNA测序软件工具，如mirdep2（Dillies等人，2013），将结果读取映射到基因组参考序列上。
9.|用于miRNA分析的实时聚合酶链反应（PCR）方法
1.|聚（A）尾矿法
在聚（A）拖尾法的先进步中，腺苷的运行是
通过聚（A）聚合酶添加到包括miRNA在内的所有RNA的3′端。在下一步中，使用通用反转录（RT）引物对多（A）尾RNA进行反转录，该引物是由两个可变核苷酸组成的简并引物
3′端，前面是寡核苷酸（dTs）和5′端的填充序列（图5）。在通用RT引物的5′端设计了一种用于定量PCR（qPCR）的通用反向引物。通过基于SYBR绿色的qPCR，使用公共反向引物和特异正向引物扩增每个miRNA。此外，PCR扩增可以
采用基于TaqMan的方法，使用miRNA特异性正向
引物、通用反向引物和通用探针（Niu等人，2015）。MiRprimer是用于自动设计用于PCR扩增miRNA的引物的软件（Busk，2014）。
1.|传统和通用茎环方法
在传统的茎环（TSLP）方法中，对于每个特定的miRNA，应设计新的特异性茎环引物。简言之，茎环RT引物与成熟miRNA的3′端结合，然后反转录为互补DNA（cDNA；图3）。随后，通过TaqMan对cDNA进行扩增和定量
图5miRNA的RT和qPCR。在传统的茎环法中，在与成熟miRNA的3′端杂交后，使用特异性环引物启动RT步骤。然后，使用基于TaqMan的qPCR放大RT产物。在poly（A）拖尾法中，通过poly（A）聚合酶将poly（b）拖尾添加到成熟miRNA的3′端。cDNA是使用含有寡核苷酸（dTs）的通用RT引物合成的，该引物具有3′-简并端。可以使用基于TaqMan或基于SYBRgreen的qPCR扩增每个miRNA。cDNA：互补DNA；
miRNA:microRNA；RT：逆转录；qPCR：定量聚合酶链反应[颜色图可在wileyonlinelibrary.com查看]
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图6液滴数字PCR。通过ddPCR对miRNA的先进定量始于cDNA合成。ddPCR可分为三个步骤，包括分配、PCR和读取阶段。首先，将反应试剂分成大约20000个液滴，然后在完成PCR反应后，读取液滴荧光，并将其评估为阳性或阴性结果。cDNA：互补DNA；ddPCR：液滴数字PCR；miRNA:microRNA；PCR：聚合酶链反应[颜色图可在wileyonlinelibrary.com查看]
miRNA。此外，双链茎结构防止RT引物与前miRNA和其他长RNA杂交（Z.Wang和Yang，2010）。
此外，还开发了一种称为“通用茎环引物”（USLP）的改良TSLP。与TSLP方法不同，TSLP方法要求为每个miRNA设计特定的干-环引物
USLP技术利用了在3′端的八个简并核苷酸
RT-底漆。因此，可以通过USLP方法在一个试管中同时进行87个miRNA的RT（Yang等人，2014）。
1.|微滴数字PCR对miRNA的先进定量
miRNA相对定量的主要缺点是缺乏一致高效的参考基因（Campomenosi等人，2016）。
液滴数字PCR（ddPCR）平台（Bio-Rad）基于
专有表面活性剂化学将PCR样品分馏成20000nl大小的液滴（图6）。PCR扩增发生在每个
单个液滴和PCR工作流程与TaqMan探针类似
基于实时PCR。PCR反应完成后，读取液滴以确定PCR阳性液滴的比例。反应中的目标分子拷贝数根据
泊松分布假设（Huggett等人，2013年）。ddPCR的优点是无需参考基因的先进定量、检测低丰度靶点的更高灵敏度以及增加对扩增反应中抑制剂存在的耐受性（Giraldez、Chevillet和Tewari，2018）。
ddPCR与qRT-PCR相比，在以下方面具有优势：
分析循环miRNA的技术性能和诊断潜力（Robinson等人，2018）。
1.|miRNA表达分析的参考基因
尽管qPCR是一种强大的miRNA表达分析技术；然而，为了获得高效的结果，需要通过合适的参考基因对数据进行标准化。小核RNA（如U6）、小核仁RNA（如SNORD44）或特定miRNA（如miR-16）通常用作miRNA表达分析中的标准化基因。贼近证明，用于miRNA定量的五种常见候选参考基因的稳定性从贼高到贼低分别为SNORD48、SNORD44、5S、miR-16和U6。在贼近的另一项研究中，高通量分析表明，在miR-24-3p中，miR-151a-5p和miR-425-5p稳定表达并被证实是慢性乙型肝炎miRNA研究的贼合适的参考基因。因此，关于miRNAs表达分析的量化，必须验证每个实验设置中推定的归一化因子的表达稳定性。
10.|结论
先进个miRNA（lin-4）于1993年在秀丽隐杆线虫中发现，不久之后在动物、植物和一些病毒中也发现了它们。它们在转录后调节基因表达，并在细胞分化、增殖和存活中发挥重要作用。先进个参与癌症的miRNA（miR-122）在2002年发现，基因解码发现它们是许多疾病的致病因素。迄今为止，试图在各种疾病的体内液体中中找到高效的miRNA生物标记，具体而言，癌症尚未转化为临床。幸运的是，使用基于miRNA的治疗方法治疗癌症和慢性HCV感染的I期临床试验取得了有希望的结果
成功在这篇综述中，我们提供了miRNA和分析方法的不同生物学方面的概述和更新。深度测序技术的出现导致越来越多的数据，现在生物信息学工具可用于管理和解决miRNA研究的一些新方面。