F81细胞(猫肾传代细胞)由上海市动物疫病预防控制中心兽医实验室保存。猫三联灭活疫苗(猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、泛白细胞减少症)(批号：D286389A)购自硕腾(上海)企业管理有限公司；DMEM细胞培养液(批号：2126865)、0.25%浓度胰酶消化液(批号：2042303)均购自GIBCO公司；胎牛血清(批号：2418)购自Sigma公司；核酸提取试剂盒(批号：MDII14-01)购自Magen公司；PrimeScriptTMRT-PCRKit(批号：AJ62323A)、LAPCRTMKitVer.2.1(批号：AK5301)、PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2(DyePlus)(批号：AKE0559A)购自宝生物工程(大连)公司；猫疱疹病毒1型荧光PCR检测试剂盒(批号：FHV20210504)、猫细小病毒荧光PCR检测试剂盒(批号：FPV20210604)购自上海尔创生物科技有限公司。
F81细胞常规消化传代，待长成单层且贴壁率达到90%时，将细胞按照1∶3的比例消化传代，同时将上述病料同步接种到细胞中，37℃，5%CO2浓度培养箱中培养，每6h观察细胞病变1次，70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，将培养液冻融3次，收集细胞上清。
1.5.2形态学鉴定将分离病毒株第3代培养物接种F81细胞，待70%细胞出现CPE后反复冻融3次收毒，将收获的细胞液冻融3次后，10000r·min－1离心1h，除去细胞碎片，随后上清液与终浓度为10%的聚乙二醇8000(PEG8000)混合过夜。在4℃下12000r·min－1离心2h后，用Tris缓冲盐溶液(TBS)重悬，经2%磷钨酸负染后进行透射电镜观察。
1.5.3外源病毒检测对13株分离株进行猫疱疹病毒1型(FHV-1)和猫细小病毒(FPV)两种外源病毒检测。根据猫疱疹病毒1型荧光PCR检测试剂盒和猫细小病毒荧光PCR检测试剂盒要求，对分离病毒株第3代培养物进行FHV-1和FPV荧光PCR检测。
1.7.1分离株有限稀释纯化将FCV-SH202101和FCV-SH202113分离病毒株第3代培养物用细胞培养液进行10倍的倍比稀释，共稀释11个稀释度，将稀释液与消化好的细胞悬液按照体积比1∶3加入至6孔板中，第12孔加细胞悬液作阴性对照，每孔体积为2mL。37℃，5%CO2浓度培养箱中培养，每6h观察细胞病变1次。待70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，收获出现细胞病变的最大稀释度孔的上清进行二次有限稀释纯化，共稀释纯化6次，测定纯化后病毒液的TCID50，－80℃保存备用。
1.7.2攻毒试验将6只健康中华田园猫(3只2~3月龄幼猫，3只2岁左右成年猫，均未免疫过猫三联灭活疫苗)分为A组、B组和对照组，每组均为2只，包括1只幼猫和1只成年猫。A和B组猫均采用滴鼻和口服方式分别接种108.73TCID50·mL－1的FCV-SH202101和1010.26TCID50·mL－1的FCV-SH202113分离株病毒液，接种剂量为滴鼻和口服各1mL·只－1；对照组猫接种相同剂量的DMEM细胞培养液。不同感染组隔离饲养，自由采食、饮水，每日监测猫的临床症状和死亡情况，同时采集眼、口、鼻拭子用于排毒情况的检测。
对13株FCV分离株进行FHV-1和FPV两种外源病毒荧光PCR检测，结果均为阴性。
2.6.1分离株与国内外参考株VP1基因同源性及遗传演化分析将13株FCV分离株与国内外参考株VP1基因进行同源性分析。结果显示，13株上海分离株之间的核苷酸序列相似性为74.3%~99.8%，其中，FCV-SH202103株与FCV-SH202104株相似性最高，为99.8%；FCV-SH202108株与FCV-SH202111株相似性最低，为74.3%。与国内外强毒株相似性为73.8%~82.9%，其中，FCV-SH202113株与FCV-5株相似性最高，为82.9%；与国内外经典株相似性为73.4%~80.1%，氨基酸序列分析显示，FCV-SH202102株与FCV-YH-16株的相似性高达91.9%，FCV-SH202108株与FB-NJ-13株的相似性最低，为82.1%；与疫苗株相似性为73.2%~79.8%，氨基酸相似性FCV-SH202103株与F4株高达89.4%，FCV-SH202102株与F4株最低，为82.7%。
2.7.1病毒液TCID50的测定测定FCV-SH202101株和FCV-SH202113株细胞半数感染量分别为108.73和1010.26TCID50·mL－1。
2.7.2感染猫的临床症状FCV202101株和FCV2021131株感染中华田园猫后，48h内幼猫陆续出现杯状病毒上呼吸道症状，如眼屎增多、气喘、咳嗽等，体温最高升至39.5℃，5d后幼猫均濒临死亡。A组成年猫1周后出现眼屎增多现象，11d后猫濒临死亡；B组成年猫1周后无明显的临床症状，2周后出现临床症状，精神沉郁、不食、发烧、眼屎大量增多，18d后死亡。
从采样宿主临床症状、VP1进化树和VS-FCV特征性氨基酸位点进行分析，选择FCV-SH202101株和FCV-SH202113株进行动物感染试验，研究表明，FCV-SH202101株和FCV-SH202113株感染中华田园猫后均可导致发病和死亡，病毒的潜伏期为1~2d，接种后第3天即可检测出排毒，不同年龄段猫的病程不一致，幼猫5d后可导致死亡，成年猫病程可持续11~18d，说明FCV-SH202101株和FCV-SH202113株可能为VS-FCV中国分离株，但VS-FCV的确诊还需要进一步研究病毒复制病例各脏器FCV的分布和滴度、病理变化以及可否造成感染猫的群体性发病与死亡等。
本研究从临床呼吸道症状猫分离到13株能在F81上形成CPE的病毒，经测序和电镜观察鉴定为FCV，VP1序列分析表明上海地区FCV流行株主要来自国内北方地区，少数毒株来自国外地区，动物感染试验表明2株FCV具有VS-FCV致病性特征，为VS-FCV毒株的筛选提供了有力的证据，也为FCV疫苗的研究提供了技术支持。