基因重组范文

导语：如何才能写好一篇基因重组，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

说起“电蟒云音响”这款产品，可以说是电蟒科技一群满怀互联网情怀的“大叔”们历经三年潜心研究的成果，也是这群人尝试跨界整合，用互联网思维的方式，对音响市场、产品、企业价值链乃至整个商业生态进行重新审视，并集成大数据分析技术，为“不将就”的用户们打造一个“越听越懂你”的智能音乐平台。

对于这款产品为何受到市场如此热捧，电蟒科技董事长赵辉曾对“电蟒云音响到底卖给谁”做了回应：“人在面对事情时，分三种本质：不将就、将就、犹豫。对于音乐需求，我们不考虑给犹豫的人做产品，搞来搞去不知道要什么，也不考虑给将就的人做产品，而这个市场很大，例如低端的蓝牙音响、多媒体音响等，很多人已经做得很好了，我们就不要做小三了，我们只能为一种人做产品，就是不将就的人。”

好产品，不将就

3年前，以互联网电视为突破口的互联网产品的概念开始兴起。对于第一代的电蟒音响，纯属于机缘巧合之做，或者说是整合资源的结果。电蟒科技首席营销官蔡伟杰也对《执行官》表示，现在推出的电蟒云音响已经是他们团队的第四代产品了。

“在之前的三代，第一代音质好，但是Linux系统兼容和扩展性差，系统体验不好，被否定了；第二代系统使用安卓，却没有显示屏幕；第三代有屏幕，体验也好，但是触控屏位置体验差，原木外观不接地气，也被否定了；直到现在成型的铝合金，过程中废弃了上百万的模具，应用现成的控制方案不易用，就自己开发了C-Play播放平台。”蔡伟杰说，当时产品在第四代的时候，因为考虑到年轻人是否喜欢的问题，单是内部测试就征集了800多个年轻人的建议。“互联网产品需要突出‘人’，如果电蟒的使用需要复杂的过程才能实现，那么就是失败的。”

据说，腾讯高级执行副总裁在试用电蟒云音响的软件体验和发烧音质后，对其有着极高的评价。电蟒云音响作为新的品类却可以得到热捧，的确有着其差异化优势的一面。“从产品上看，没有一家企业在做云音响，因为同行都在做手机WIFI音响。而电蟒云音响不用连接手机或者其他播放器，一个音响满足用户所有播放需求。”作为一款智能化产品，电蟒的体验性、友好性优势十分突出。“电蟒的试用跟手机的使用一样，非常容易操作，甚至不需要说明书。”蔡伟杰认为，电蟒在技术产异化、尖叫的价格和音质上赢得了市场的青睐，做到了“alinone”。

对于“电蟒”的名字由来，也颇具互联网味道。“我们的产品在功能和外观上可以让人尖叫，但是名字却太过普通。现在的互联网品牌不是水果就是动物，于是我们想到了‘电蟒’，令人过目不忘。”对于“天韵”这个“好听不好记”的名字，被这群“大叔”果断放弃了。于是，第四代音响产品正式命名为“电蟒”。

从2011年开始，一批技术公司的加入，让电蟒拥有了核心的技术能力。“任何数字音乐都有音质和压缩的难题，为了保证音质和音频细节的高质量，我们邀请了国内最成功的数码公司加入。”蔡伟杰说，“华为的优势在于有自己的核心技术，这是其他国产品牌手机无法比拟的。电蟒在成立之初也考虑到核心技术的问题，所以才想到了基因重组的方法，把最顶级企业的整合到供应链中。”

据了解，电蟒云音响之所以品质稳定，有赖于这些传统制造业龙头企业的支持。“因为供应链不存在问题，核心技术我们也掌握了，制造能力也很强大。对于我们基因中的传统老牌企业，工艺领先，产品质量稳定可靠，这样生产的产品才可以说互联网产品。真正的互联网产品不是尖叫一下，而是让消费者尖叫一辈子！”蔡伟杰说。

【关键词】基因重组染色体转化

高中生物关于基因重组，有这样的定义：基因重组是指在生物体进行有性生殖过程中，控制不同形状的基因的重新组合。这样的定义是依据高中学生的知识水平及教材的篇幅而给出的，虽说这句话本身不错，但作为定义，却又失严谨性和科学性，他易给高中生带来片面的理解。

基因重组是自然界普遍发生的一种遗传现象，它可发生在同种生物之间，也可发生在有一定关系的异种生物之间，且随科学水平提高，人们可以打破物种间的限制，在人工条件下实现不同物种间的基因重组。因此，基因重组按其发生原因大致分为自然界的基因重组与人工条件下的基因重组两大类。

一、自然界的基因重组

自然界发生的基因重组非常复杂，有同种生物间的基因重组，有不同种生物间的基因重组，有病毒与原核生物及真核生物间的基因重组。

1.真核生物的基因重组。高中生物学重点讲述了有性生殖中的基因重组，主要表现在减数分裂时同源染色体间交叉时互换及非同源染色体间自由组合中的基因重组，它是导致同种生物多样性的主要原因。

2.原核生物的基因重组。在原核生物中，其基因重组的方式主要有转化、转导和接合几种形式。

（1）转化。转化是受体菌直接吸收来自供体菌DN段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，在经过复制使其变成一个转化子，它是同种或异种菌株间存在的普遍现象。

（2）转导。通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把吧供体细胞DNA小片段携带到受体细胞，通过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象称为转导。转导现象在原核生物中普遍存在，在低等生物进化中，是一种产生新基因组合的重要方式。

3.转座导致基因重组。在原核生物和真核生物中，还存在转座现象，它是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座中转座单位称转座子，存在于DNA上并可自主复制与位移，根据转座中转座子是否复制把它分为复制型转座子与非复制型转座子，前者是通过复制而拷贝一个新的转座子，而将原始转座子常留在原来位置，拷贝转座子出现于新位点而导致基因的重组；后者是不经复制，原始转座子作为一个可移动实体直接被移到新位点，同样导致基因重组。

转座作用发生频率低，但生物学意义很大，可说明细菌中发现许多基因缺失或倒转现象，转座现象出现于细菌、酵母、果蝇和玉米等不同生物中，导致这些生物体基因组中基因数目不固定。

二、人工条件下的基因重组

自然界的基因重组是生物体在长期进化过程中经过自然选择过程而形成的，它体现在同种生物之间和有一定关系的不同生物之间。但随科学水平的提高，人们已能超越生物体在长期进化中形成的基因重组，按人们的意愿来实现多数生物在自然界所不能完成的基因重组。

1.原生质体融合导致基因重组。通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，成为原生质体融合。现在原生质体融合的重组频率已大于1/10，可在属间、种间甚至更远缘的微生物或高等生物等生物体的细胞间实现融合，从而达到基因重组。

2.各种人工育种中体现基因重组。随着科技水平的提高，自然界不能结合的异种性细胞，在人工条件下，使其结合而达到培育新品种的目的，这一切都是基因重组的结果。例如，无芒抗病类型水稻及三倍体西瓜的产生。诱变育种是通过基因突变而实现，因其产生新基因，相对于邻近基因也发生了基因重组。例如，“黑农五号”“卫星87—2青椒”“航宇1号水稻”“豫麦13”的产生。

3.基因工程导致基因重组。基因工程是人们在分子生物学理论指导下的一种自觉的、可事先设计与控制的育种新技术，是人工的、离体的、分子水平上的一种遗传重组的新技术，是一种可完成超远缘杂交的育种新技术。基因工程中有条件作为载体的，对原核受体细胞，有细菌质粒与噬菌体两类；对真核动物细胞，主要有SV40病毒；对植物细胞来说，主要是Ti质粒。其中目的基因与载体DNA在体外完成重组，形成一个完整有复制能力的环状重组载体—嵌合体，然后导入相应的受体细胞。

【关键词】乙型肝炎病毒；，RNA干扰；，腺病毒；，基因治疗

PreparationofrecombinantadenovirusmediatedsiRNAtargetingHBVxgeneanditssuppressiveeffectonHBVxgeneexpression

【Abstract】AIM:ToconstructtherecombinantadenovirusvectorsforsiRNAtargetingHBVxgene（HBx）andtoevaluatetheinhibitiveeffectontheexpressionofHBxgeneinhumanhepatomaHepG2cellline.METHODS:TheshuttlevectorpShuttleHBxwascotransfectedintoE.coliBJ5183withadenovirusbackboneplasmid.ThehomologousrecombinantsweretransfectedintoHEK293packagingcellsandadenoviruswaspackagedandamplified，followedbyinfectionoftheHepG2cellstransfectedwithHBxgene.TheexpressionlevelsofHBxweredeterminedbyRTPCRandWesternBlotafterthetotalRNAandproteinwerecollected.RESULTS:TherecombinantadenoviralvectorscontainingsiRNAtargetingHBxgeneweresuccessfullyconstructed，whichwereconfirmedbyrestrictionenzymedigestion.RTPCRresultsdemonstratedthattheHBxmRNAwasmarkedlydecreasedandWesternBlotresultsshowedthattheexpressionofHBxproteinwasalsosignificantlyreducedinHepG2cellline.CONCLUSION:AdenovirusbasedsiRNAtargetingHBxgenecaninhibitHBxexpressionwithgreatpotencyandspecificityinvitro.

【Keywords】hepatitisBvirus;RNAinterference;adenovirus;genetherapy

【摘要】目的：构建针对乙型肝炎病毒x基因（HBx基因）的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒表达载体，并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法：重组腺病毒穿梭载体pShuttleHBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体，后者转染HEK293细胞，包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2，收集细胞总RNA和总蛋白，采用RTPCR和WesternBlot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果：经限制性内切酶酶切鉴定，证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RTPCR和WesternBlot方法证实，在HepG2细胞中，HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论：腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.

【关键词】乙型肝炎病毒；RNA干扰；腺病毒；基因治疗

0引言

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

1.2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的构建

经XbaI和HindIII双酶切反应，从pSUPERHBx2，pSUPERHBx5质粒获取RNAi表达框片断HBx2和HBx5（大小300bp左右），将两目的片断回收后亚克隆入同样经XbaI和HindIII双酶切的腺病毒穿梭质粒pShuttle，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用XbaI和HindIII双酶切，10mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.获得含小干扰RNA(shortinterferingRNA，siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.

1.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5载体的构建

将pShuttleHBx2，pShuttleHBx5质粒用PmeI酶切线性化，与pAdeasy1按10∶1的比例电转化至BJ5183感受态细菌.卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取较小的克隆扩增培养，提取质粒.用PmeI酶切鉴定质粒，将鉴定正确的重组质粒再次转化DH5α感受态细胞，扩增阳性克隆并大量提取质粒，得到含针对HBx干涉表达框的重组腺病毒质粒.（阴性对照质粒AdeasyH1为带有H1启动子的pAdShuttle质粒，用PmeI酶切线性化后与pAdeasy同源重组得到）.

1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定

①包装细胞培养：含100mL/L胎牛血清的HDMEM培养基，37℃，50mL/LCO2培养箱中培养HEK293细胞，当细胞汇合度达70%~80%时转染.②重组腺病毒质粒转染HEK293细胞：重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用PacI酶切线性化后回收，按照LipofectAmineTM2000说明书转染6孔培养板中的HEK293细胞，37℃，50mL/LCO2培养箱中孵育，10~12d后收集细胞，液氮与37℃两个温度下反复冻融4次，裂解细胞以收获原始病毒，病毒感染HEK293细胞使病毒大量扩增.重复上述步骤，最终收集3轮扩增的病毒液，分装保存于-70℃.③病毒滴度的测定：用TCID法检测病毒滴度后，得到1×1010pfu/mL的病毒工作液.

转贴于

1.2.4RTPCR检测

重组腺病毒对HBx基因mRNA的降解作用制备的重组腺病毒感染人肝癌细胞株HepG2，同时转染表达HBx基因的质粒pCNDA3.1HBxmyc和pCDNA3EGFP，后者用来监测各组转染效率，对照组转染只含有H1启动子的质粒AdeasyH1.37℃，50mL/LCO2培养箱中孵育，48h后，分别收集细胞总RNA和蛋白.通过RTPCR检测HepG2细胞HBx转录水平的变化：提取实验组和对照组HepG2细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，取5μg总RNA按照SuperScriptTMⅡ说明书进行cDNA第一链的合成，以反转录得到的cDNA为模板在PE2400型DNA扩增仪上进行PCR反应.HBxPCR条件为：95℃变性5min，再95℃30s，57℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸5min.反应产物为HBx基因片段，长度为464bp；内参照βactin基因扩增条件为：95℃变性3min后，95℃30s，55℃30s，72℃45s，共20个循环，最后72℃延伸5min，扩增片断大小为438bp；EGFP基因PCR反应参数为：95℃变性5min，再95℃30s，58℃45s，72℃30s，共27个循环，最后72℃延伸5min，反应产物为538bp.10mL/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，比较干涉组与对照组mRNA水平表达差异.

1.2.5WesternBlot检测

重组腺病毒对HBX蛋白表达的影响用100μL的细胞裂解液裂解上述各组细胞，4℃10000g离心20min，收集上清液，加入等量2×SDSLoadingBuffer，煮沸5min，每孔上样30μL，蛋白样品经SDSPAGE分离后，电转移到硝酸纤维素膜上.依次加入5g/L脱脂奶粉（室温封闭2h），1∶200myc标签抗体和EGFP抗体（室温孵育2h），1∶2000的HRP酶标羊抗兔二抗（室温孵育1h）.用TBST缓冲液洗涤后，加入底物发光剂ECL1mL，反应5min后吸干发光剂，用单层透明薄膜包裹后曝光，X光胶片显影.

2结果

2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5载体的鉴定

用XbaI和HindIII双酶切构建的腺病毒穿梭质粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5，得到6300bp及300bp左右的片断（图1），与预期大小一致，证明穿梭质粒构建成功.

2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5载体的鉴定

用PmeI分别酶切重组质粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5，得到23000bp和4300bp两个片断（图2），结果与预期一致，证明骨架质粒同源重组成功.

2.3重组

pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5腺病毒的包装含重组腺病毒的质粒转染包装细胞HEK293，培养1wk后，显微镜下可见特征性圆球状及葡萄串样聚合的细胞病理性改变；电镜下可见病毒感染后的死细胞，胞体肿胀，胞膜不完整，细胞内充满病毒颗粒（图3A，图中箭头所示即为病毒颗粒），以及感染细胞的胞核，内有成堆的病毒颗粒（图3B，图中箭头所示为病毒颗粒）.第10日，可见大部分包装细胞肿胀脱落，细胞出现细胞病理反应（cytopathologicaleffect，CPE）样变化.

A：病毒感染的包装细胞×4000；B：包装细胞胞质内的病毒颗粒×40000.

2.4共转HepG2细胞观察HBx基因表达情况

包装完成的病毒颗粒以30MOI感染人肝癌细胞株HepG2，48h后，分别收集细胞总RNA和蛋白，检测其变化.RTPCR结果表明，与未处理组和转染空载体组细胞相比，感染腺病毒组细胞的HBx基因mRNA量明显降低（图4A）；WesternBlot结果显示，感染腺病毒可使细胞HBX蛋白的表达量显著减少（图4B）.

3讨论

目前，在我国广泛应用的抗HBV药物主要有两类，即α干扰素和核苷类药物如拉米夫定等.但疗效均不理想，新型有效的抗HBV药物仍在探索中.RNAi用于HBV治疗在理论上具有以下优点［7］：特异性降解HBVmRNA，从而阻止病毒复制，对已整合入宿主细胞基因组的前病毒及无复制活性的病毒，RNAi也可以起到有效的抑制作用，这是通常抗病毒药无可比拟的.其次，RNAi可以针对病毒基因保守区发挥作用，从而限制病毒产生逃避突变株的能力.因而，RNAi技术为各类慢性HBV感染开辟了新的途径.有学者认为RNAi技术应用于抗HBV治疗，有望成为治疗乙型肝炎的革命性新方法，将有巨大的社会价值［8］.腺病毒载体是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一.由于腺病毒载体宿主范围广，感染效率高，可插入外源基因片段大，可介导外源基因短时呈高水平表达和不整合到感染细胞的基因组中等特点［9］.

实验中我们使用RTPCR，WesternBlot的方法在mRNA水平和蛋白质水平证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒有效地抑制了HBx基因的表达.

本实验表明腺病毒是一种有应用前景的抗HBV感染的基因治疗载体，其可为慢性HBV感染以及HBV感染后发生的肝细胞肝癌的基因治疗提供新思路.

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作者：姜立马文丽柯杰兵彭翼飞李晋徐兵郑文岭

【摘要】目的构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶（OAZ）突变基因，重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。方法采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位碱基T碱基缺失，使核糖体的阅读框+1移位，连续表达OAZ基因的ORF2部分。测序鉴定后，重组质粒转化BL21菌，进行突变基因的蛋白表达。结果重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失，其余碱基序列无变化。重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ全长蛋白，SDS-PAGE分析在相对分子质量45900左右出现新的蛋白条带。结论成功构建人OAZ突变基因重组质粒，转化BL21后表达出融合的OAZ全长蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。

【关键词】鸟氨酸脱羧酶抗；突变；蛋白表达

1.1试剂大肠杆菌DH5α、BL21和表达质粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild质粒由本实验室保存。QuikChange定点突变试剂盒购自Stratagene公司。质粒纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶均购自TaKaRa公司，其余生化试剂均为国产分析纯。引物根据OAZ基因所需点缺失碱基处进行设计2条反向互补引物对P1与P2。P1：5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′；P2：5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。

1.2.1反向PCR扩增以pET-32a-OAZ-wild质粒为模板进行PCR反应:将pET-32a-OAZ-wild质粒(10mg/L)1μl、dNTP1μl、10×Buffer5μl、P1与P2引物(100mg/L)各2.5μl、PfuTurboDNA多聚酶(2.5×106U/L)1μl、双蒸馏水37μl加入PCR管;95℃预变性30s后，95℃30s、55℃1min、68℃6min，共18个循环。PCR产物置于冰上2min，加入1.5μlDpnⅠ内切酶(106U/L)，37℃水浴2h，酶解模板DNA。

1.2.2转化大肠杆菌DH5α取感受态大肠杆菌50μl，加入上述DpnⅠ处理液10μl，轻轻混匀，冰浴30min42℃热休克45s冰上2min，加入预热的LB培养液0.5ml，置于37℃恒温摇床中，200r/min振摇1h。

1.2.3质粒扩增、提取及鉴定取200μl菌液铺到LB琼脂培养板(含Amp)上，37℃培养12～16h。挑取单菌落，提取质粒。取质粒5μl，选取插入片段两端的酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶进行分析鉴定。含目的基因的质粒经测序验证目标碱基缺失后，命名为pET-32a-OAZ-mutation。

1.2.4重组蛋白表达将含有pET-32a-OAZ-mutation的质粒转化BL21菌，铺板挑阳性菌落并酶切鉴定为阳性菌落后，接种至含5mlLB培养基中（含氨苄青霉素）振培过夜。次晨取100μl接种至新的5mlLB培养基中，37℃振培3～4h，至D值约为0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5mmol/L，继续培养2h和4h后取菌液1ml，进行15%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物，以转染空pET-32a质粒的BL21菌在同等条件下用IPTG诱导为阴性对照。

2.1pET-32a-OAZ-mutation测序图PCR扩增后，DpnⅠ酶切产物并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，鉴定含有目的基因后，抽提质粒，以T7启动子序列为测序引物序列于ABI3730测序仪进行DNA序列测定，确定OAZ基因的TGCTCCTGATGCC(196~208)处的202位T已缺失，其余序列没有变化(测序图中的第312~323号序列为TGCTCCGATGCC，显示T已缺失)。见图1。

2.2重组pET-32a-OAZ-mutation在BL21宿主菌中的蛋白表达SDS-PAGE分析结果显示，经IPTG诱导的含重组质粒BL21与对照菌相比，在相对分子质量为45900位置上出现1条新带。见图2。图1T7启动子测序结果图

图2表达产物SDS-PAGE图

MMarker；1BL21菌；2转化pET-32a质粒的BL21菌；3转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后2h；4转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌，经IPTG诱导后4h

细胞的生命活动需要多聚胺(polyamine)类物质，包括腐胺(putrescine)、亚精胺(spermidine)和精胺(spermine)。多聚胺几乎是所有活细胞的必要组分，它们的缺失将导致细胞生长减少甚至死亡，但是当它们的含量升高时也会有致癌作用并且可以诱导细胞凋亡［6-7］。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达除了能降低细胞内多胺水平，还能抑制细胞的生长。而OAZ能够特异地拮抗ODC的催化活性，减少细胞内多胺的生成，因此成为研究抑制肿瘤细胞恶性增殖的切入点［8］。

从最初哺乳类动物细胞中克隆出OAZ基因至今，已陆续发现有OAZ1、OAZ2和特异性的OAZ3基因。其中OAZ1，也就是通常所说的OAZ基因，其表达的蛋白产物对于ODC有特异性的拮抗作用。OAZ的的抑制作用不是直接降解ODC，而是OAZ与ODC结合后，通过26S蛋白酶降解ODC，是一种在翻译后水平调节酶活性的机制。ODC是一个二聚体酶，亚基间的聚合与解聚非常迅速。OAZ对于ODC单体蛋白有非常高的亲和力，形成AZ∶ODC的蛋白聚合体，促进ODC被26S蛋白酶降解［7～11］。人OAZ蛋白是由两段ORF的表达框所翻译表达，在第一个表达框的终止密码子处，有一个核糖体移位位点，在精胺诱导下，出现程序性的阅读框的移位。越过终止密码子，继续住下游翻译，直至第2个表达框的终止密码子处。全部蛋白共由228个氨基酸所组成，其中ORF1编码N末端68个氨基酸，ORF2编码C末端160个氨基酸。ORF2编码的C末端氨基酸序列是真正发挥抗酶活性的肽链区段，但是该区段的蛋白表达需要在精胺的诱导下才能出现，因此增加了对于OAZ全长蛋白调控机制的研究难度。

故此，本研究通过定点突变技术，成功地使OAZ基因ORF1与ORF2间的核糖体移位位点发生缺失，也就是使ORF1的终止密码子的TCCTGATGCC的T发生缺失，使核糖体按照随后GATGCC的三联体顺序进行翻译，无需精胺的诱导即可表达出完整的OAZ蛋白。由于选用质粒pET-32a作为原核表达载体，OAZ蛋白表达的同时，还在其C末端携带有多聚组氨酸的标签，可通过His标签蛋白进行纯化，为进一步研究其在肿瘤细胞中的调控机制提供了条件，为开发其临床应用奠定了基础。

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[关键词]SFRP2；腺病毒；增生性瘢痕；成纤维细胞

成纤维细胞作为创伤愈合时的主要效应细胞，在包含增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在内诸多以过度增生为特征的病变中，常常表现为凋亡抑制，进而引发一系列连锁反应造成创面修复失控并最终导致过度纤维化而形成增生性瘢痕[1]。我们过去运用从基因芯片中筛选出一个具有抑制细胞凋亡作用、在早期增生性瘢痕中呈显著高表达的基因SFRP2[2-3]，该基因可能在增生性瘢痕形成的过程中起着重要作用。但是目前SFRP2调控增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制尚不明了，有必要进行进一步研究。

本实验利用pAd-Easy腺病毒载体系统[4]，通过PCR扩增SFRP2基因，克隆到腺病毒载体pAdEasy共转染293细胞，构建携带SFRP2基因的重组腺病毒，在体外感染人增生性瘢痕成纤维细胞以观察SFRP2基因表达情况，为进一步研究该基因的功能奠定理论和实验基础。

1.1材料：pGBKT-SFRP2质粒（袁顺宗博士惠赠）。感受态菌株及293细胞株（我院烧伤研究所）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Haclon公司）。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶、pMD18-T载体、DNAMarkerDL2000、DNAMarkerDL15000（Takara公司）。Lipofectamine2000（Invitrogen公司）。Trizol及RT-PCR试剂（美国Invitrogen公司）。逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）。兔抗人SFRP2多克隆抗体（美国CST公司）。

1.2.1增生性瘢痕成纤维细胞的分离培养：采用组织块法[6]进行增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养，具体方法如下：将手术中取下的增生性瘢痕标本仔细切除皮下脂肪组织和表皮，用加有青霉素和链霉素的消毒蒸馏水洗涤3次，再用消毒生理盐水漂洗3次；在少量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中用锋利的刀片将组织切割成约1mm大小的块，并接种于25ml的培养瓶中，置于37℃，5%CO2的孵箱中培养，待长成致密层以后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化传代，实验所用的是第3～6代的细胞。

1.2.2SFRP2编码序列的扩增：采用Primer5.0软件设计扩增人SFRP2基因氨基酸区域编码序列的特异性引物，并在引物5'端引入保护性碱基和限制性酶切位点，其中，上游引物序列为：5'-GAAGATCTATGCTGCAGGGCCCTGGC-3'，下游引物序列为：5'-TTGTCGACCTAGCACTGCAGCTTGCGGATG-3'（画线部分分别为BglII和SalI酶切位点）。以pGBKT-SFRP2质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系组成为：5μl10×PCR缓冲液、1μl10mmol/LdNTPs、pGEX-IL-24重组质粒模板2μl、10μmol/L引物各1μl及DNA聚合酶1μl，用双蒸水补足至50μl。扩增程序为：94℃变性5min，然后用逐步程序94℃30s，56℃30s，72℃1min完成30个循环，最后72℃延伸7min。

1.2.3SFRP2重组腺病毒表达载体的构建：2%琼脂糖凝胶回收SFRP2扩增产物，与pMD19-T载体连接并转化到DH5α菌中，蓝白斑初步筛选，挑取单菌落提粒，BglII和SalI双酶切及PCR鉴定，鉴定正确的质粒经BglII和SalI双酶切，胶回收SFRP2目的片段，与线性化的pAdTrack-CMV载体相连接，转化DH5α菌，BglII和SalI双酶切鉴定并进行测序。测序正确的重组载体命名为pAdTrack-CMV-SFRP2。PmeⅠ单酶切消化10μgpAdTrack-CMV-SFRP2重组质粒，纯化回收后获得线性化载体，然后与0.1μg骨架质粒pAdEasy-1在2.5kV，200Ω，25μF条件下电穿孔共转化20μlBJ5183感受态细胞，卡那霉素抗性平板37℃培养16h，挑取针尖大小的克隆，PacⅠ酶切鉴定正确后，再转化DH5α菌中扩增。鉴定正确的重组载体命名为Ad-SFRP2，进行扫描获取图像。

1.2.4SFRP2重组腺病毒的包装与制备：按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，取10μgPacⅠ酶切线性化的Ad-SFRP2转染HEK293细胞。转染后7～10天荧光显微镜观察，根据绿色荧光蛋白GFP和细胞病变效应判断病毒产生。收集细胞，磷酸盐缓冲液重悬，-80℃和37℃反复冻融4次，12000r/min离心10min，收集病毒上清，-80℃保存，取部分病毒上清液，再次感染HEK293细胞扩增腺病毒，按TCID法测定病毒滴度。

1.2.5SFRP2重组腺病毒感染增生性瘢痕成纤维细胞：原代培养的增生性瘢痕成纤维细胞经第3次传代后，在150mL/LDMEM中培养24h。将Ad-SFRP2纯化病毒按其TCID50值加入到细胞培养基中，每15min轻摇1次，共4次，4h后换液。

1.2.6RT-PCR检测SFRP2表达水平：按Trizol试剂盒说明书分别提取Ad-SFRP2感染24h后的实验组和阴性对照组增生性瘢痕成纤维细胞的总RNA。RT-PCR反应按照Fermentas反转录PCR试剂盒说明书进行操作，利用PrimerPrimer5.0设计SFRP2的鉴定引物：上游5'-TGGGGGAAACGGTCGCACTC-3'，下游5'-GGCCACGAGACCATGAAGGAGG-3′。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃40s，35个循环；最后延伸72℃5min。以GAPDH作为内参照（退火温度55℃，25个循环），GAPDH上游引物5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'，下游引物5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'（上海生物工程技术服务有限公司合成），PCR反应结束后取10μL反应产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳观察目的条带。

1.2.7Westernblot检测SFRP2表达水平：分别收集感染Ad-SFRP224h后和对照组细胞，提取蛋白。BCA法进行蛋白定量，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水浴5min，按照蛋白定量结果进行加样，行120g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干法将蛋白转移至硝酸纤维素（NC）膜上。NC膜用50g/L脱脂奶封闭1h，加入SFRP2pAb（1∶500）或GAPDHmAb（1∶1000）工作液，4℃过夜，兔抗人二抗（1∶4000）于室温下孵育1h，用ECL发光，胶片显色，分析结果，以GAPDH作为内参照。

2.1PCR扩增产物电泳结果：以pGBKT-SFRP2质粒为模板，PCR扩增产物为单一条带，大小约904bp，见图1。

2.2SFRP2重组腺病毒载体的构建：将扩增产物克隆入pMD19-T载体，BglII和SalI双酶切和PCR鉴定确认获得阳性重组克隆（图2）。进而将SFRP2片段亚克隆至pAdTrack-CMV载体，BglII和SalI双酶切鉴定并经测序确认获得阳性重组克隆，命名为pAdTrack-CMV-SFRP2（图3、图4）。线性化的pAdTrack-CMV-SFRP2质粒与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组，PacⅠ酶切鉴定阳性重组子，可见1条约30kb的片段和1条4.5kb的小片段（图5），表明同源重组成功，获得SFRP2重组腺病毒载体，命名为Ad-SFRP2。同时，采用同样方法，将pAdTrack-CMV空载体与骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，重组子命名为Ad-EGFP。

2.3SFRP2重组腺病毒的包装扩增及鉴定：用脂质体转染293细胞有大量GFP表达，并可见细胞变圆呈串珠样聚集（图6），裂解粗提物中提取重组病毒DNA，PCR鉴定证实重组病毒基因组中含有目的基因SFRP2，提示重组质粒在293细胞转染成功。收集病毒液，反复转染293细胞最终得到滴度约为2.0×1010pfu/mL的重组腺病毒。

2.4RT-PCR检测结果：感染的增生性瘢痕成纤维细胞中提取mRNA的RT-PCR电泳结果显示，以GAPDH为阳性对照，未感染病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2、感染空病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2与感染SFRP2腺病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2表达一致。其产物为904bp特异条带，且SFRP2腺病毒感染增生性瘢痕成纤维细胞后SFRP2基因表达明显增高（图7）。

2.6Westernblot检测结果：用SFRP2多克隆抗体进行Westernblot检测，以GAPDH为阳性对照，结果证实感染重组腺病毒载体在增生性瘢痕成纤维细胞中SFRP2有较高的稳定表达（图8）。

SFRP2是一个位于4号染色体q31.3，其全长约2kb，编码大小约34kD的可溶性蛋白质，表达于胞浆，但也可分泌至胞外发挥作用。SFRP2蛋白所属的SFRP家族具有富含半胱氨酸的结构域，该结构域同源于细胞表面卷曲受体（Frizzledreceptors）的Wnt结合位点，但是SFRP2缺乏跨膜结构[5]。目前的研究表明，SFRP2通过调控Wnt信号为主要途径的方式发挥其调节细胞抗凋亡的作用。表现为：①心肌修复过程中，SFRP2通过阻断Wnt3a信号途径、增加细胞核内β-catenin表达以对抗缺氧/复氧诱导的凋亡作用，从而调控心肌细胞修复[6]；②胃癌中过表达的SFRP2通过下调β-catenin-TCF/LEF的下游靶基因如LEF1，cyclinD1，MMP-7等来抑制Wnt信号，调节癌细胞的增殖与凋亡[7]；③乳腺癌中SFRP2主要通过活化NF-κB或抑制JNK信号来发挥其抗凋亡作用。同时SFRP2还可以通过与促进ECM中的纤维连接蛋白-整合素受体复合体（fibronectin-integrinreceptorcomplexes）形成从而活化黏附斑激酶（FAK）及其下游信号途径PI-3K-Akt来抑制细胞凋亡[8]。

除了抑制凋亡之外，SFRP2对细胞增殖、分化和运动也还具有一定的调节作用，并且SFRP2基因的甲基化被认为可用来作为粪便中结直肠癌的筛选标志[9-12]。文献复习还提示SFRP2的高表达可以促进结缔组织生长因子（CTGF）的基因表达水平增高[6]，而CTGF在HS组织中既可以促进Fb增生，又可以促进Fb-肌Fb转分化和胶原合成[13]。

本研究构建SFRP2重组腺病毒载体，在293细胞中表达、包装、纯化病毒后成功构建了携带SFRP2重组腺病毒。并且初步研究结果表明该重组病毒在体外能有效感染正常增生性瘢痕成纤维细胞，受感染细胞能高效稳定的表达重组蛋白，为下一步研究SFRP2对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因表达与调控、细胞凋亡等过程的机制奠定了基础。

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【摘要】

目的构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的逆转录病毒载体，将其导入包装细胞PT67，检测基因在细胞中的表达。方法PCR法扩增GDNF基因及IRES2EGFP基因，测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接，构建重组逆转录病毒质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。EcoRI酶切鉴定重组质粒。脂质体Lipofectamine2000介导下转染包装细胞PT67，G418筛选并检测病毒滴度。流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达。结果PCR扩增得到大小约558bp和1308bp的特异性条带，测序证实，获得正确的人GDNF序列和EGFP序列。经EcoRI酶切鉴定，成功构建重组质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达，流式细胞仪检测转染效率为24.4%。结论正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSNIRES2EGFPGDNF质粒。基因转染包装细胞PT67获良好表达。

【关键词】胶质细胞源性神经营养因子；逆转录病毒；脂质体；基因转染

帕金森病(PD)临床疗效不佳，有学者将骨髓间充质干细胞（MSCs）定向移植入PD鼠模型的黑质纹状体区，发现其能够存活并分化为酪氨酸羟化酶（TyrosineHydroxylase，TH）表型神经元，从而改善PD大鼠症状，但不能阻止神经细胞的进一步死亡。于是有学者探索将神经营养因子体外转染靶细胞，通过立体定向的方式移植入鼠的黑质纹状体区，发现可促进PD大鼠的黑质纹状体神经通路的结构和功能的恢复。本课题拟在以上研究的基础上，应用人胶质细胞源性神经营养因子（glialcelllinederivedneurotrophicfactor，GDNF）重组逆转录病毒体外转染MSCs，立体定向移植入PD大鼠模型的黑质纹状体区，通过对相应指标的测定，分析逆转录病毒介导GDNF基因转染MSCs移植治疗PD的可行性及其疗效。本文为实验的第一部分，旨在构建一个携带有治疗基因GDNF同时携带报告基因加强型绿色荧光蛋白(enhancegreenfluorescentprotein，EGFP)的逆转录病毒重组质粒，转染包装细胞PT67后，检测基因的表达及转染效率，为下一步转染MSCs、进一步深入探讨GDNF基因在神经系统疾病基因治疗中的作用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料、试剂和仪器

人神经胶质细胞瘤标本，由山东省立医院神经外科提供。逆转录病毒载体pLXSN质粒、携带pIRES2EGFP基因片段的质粒、PT67、NIH3T3细胞由山东省立医院中心实验室保存并提供。PCR试剂盒、pMD18T载体试剂盒、限制性内切酶XhoI、BamHI、BglⅡ、EcoRI、T4连接酶均购自大连TAKARA公司；中量质粒抽提试剂盒购自Omega公司；GDNF基因片段及pIRES2EGFP基因片段上、下游引物，由上海博亚生物技术有限公司合成；Lipofectamine2000、OptiMEM无血清培养基购自Invitrogen公司；G418、DMEM培养液购自Gibco公司；Polybrene购自Sigma公司。

1.2.1GDNF基因、IRES2EGFP基因的克隆及测序

参照《分子克隆实验指南》，从人神经胶质细胞瘤组织中提取总RNA后逆转录生成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增GDNF基因片段。同时，以含有IrES2序列及EGFP基因片段的质粒为模板，PCR扩增EGFP基因片段。扩增程序：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃1min，10个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，20个循环；72℃7min充分延伸；4℃，保持。GDNF基因引物序列（上游5′TACTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG3′，下游5′CGAGATCTTCAGATACATCCACACCTTTTAGC3′）；IRES2EGFP基因引物序列（上游5′TTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′，下游5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′）。引物设计时分别引入XhoI、BamHI、BgⅢ酶切位点。扩增产物纯化回收后克隆入T载体，筛选阳性克隆，使用测序仪进行测序。

1.2.2pLXSNIRES2EGFPGDNF重组体的构建及鉴定

XhoI和BamHI分别双酶切pLXSN质粒及pIRES2EGFP，T4连接酶连接酶切后产物，得到pLXSNIRES2EGFP；XhoI和BglⅡ分别双酶切pLXSNIRES2EGFP及PMD18TGDNF，T4连接酶连接酶切后产物，构建pLXSNIRES2EGFPGDNF重组质粒，EcoRI酶切鉴定。

1.2.3病毒转染包装细胞PT67

酶切鉴定初步证实质粒构建成功后，按照质粒中量抽提试剂盒说明，中量抽提pLXSNIRES2EGFPGDNF重组质粒，测量浓度及纯度。复苏并培养包装细胞PT67，培养液为含10%胎牛血清的DMEM液。转染前1d，胰酶消化PT67细胞并计数接种于6孔板内，使用含血清不含抗生素的培养基培养，控制其在转染当日密度达到90%左右。第2天，以OptiMEMI培养基各250μl分别稀释5μgpLXSNIRES2EGFPGDNF重组质粒和15μlLipofectamine2000，将稀释的DNA和稀释的Lipofectamine2000混合，室温保持20min后，转染1孔，其他孔按此重复。37℃，5%CO2孵箱内培养24h后，将细胞消化传代，新鲜培养基继续培养。2d后加入G418筛选。按照预实验结果，先从200μg/mlG418浓度开始，根据细胞生长情况酌情增量，至500μg/ml为止。当绝大多数细胞死亡，只余小部分有丝分裂相细胞时，将G418浓度下调至300μg/ml继续培养。当细胞达到50%左右汇合时，胰酶消化，按照1∶10比例传代，300μg/mlG418继续培养。待出现单细胞克隆后，用克隆环挑出10个大而边界清楚的克隆，收集病毒，-70℃冻存。

1.2.4滴定病毒滴度

复苏NIH3T3细胞并以含10%胎牛血清的DMEM液培养，用于测病毒滴度。测滴度前1d，将NIH3T3细胞胰酶消化后重新铺于6孔板，细胞密度保持在0.5×105～1×105/孔，每孔加入2ml完全培养液。测滴度当日，将20ml完全培养液与60μlPolybrene（4mg/ml)混合，简称溶液1。将方法1.2.3中得到的病毒储存液经0.45μm醋酸纤维膜滤器过滤。备6只1.5mlEP管，做标记后分别加入1.35ml溶液1，将过滤好的病毒储存液150μl加入第1管后混匀稀释。将稀释后的病毒液吸取150μl加入第2管混合稀释，依此类推加至第6管，病毒最终被稀释106倍，第6管溶液简称溶液2。每孔加1ml溶液2，最终孔内的Polybrene的终浓度为4μg/ml。感染细胞24h后，更换含300μg/mlG418的完全培养基培养。1w后，肉眼计数形成的抗性细胞克隆，计算滴度。病毒滴度=细胞克隆数×病毒液稀释倍数（106）。将高滴度病毒液-70℃冻存备用。

1.2.5荧光显微镜及流式细胞仪检测

将方法1.2.3中筛选出的细胞培养达到50%～60%融合后，胰酶消化接种于6孔板内，300μg/mlG418继续培养。6孔板内挑选2孔预先放入无菌载玻片。待细胞贴壁后，培养2～3d，4%多聚甲醛固定。以未经转染的PT67细胞为背景荧光标准，488nm波长光线激发下荧光显微镜观测并照相。其余孔内，胰酶消化细胞成单细胞悬液，PBS洗涤2遍。取109/ml的单细胞悬液1ml以预冷的无水乙醇固定，以同时传代未转染细胞作为对照，行流式细胞仪检测。

2.1pLXSN质粒图谱质粒大小约为5.9kb，见图1。

2.2目的基因PCR扩增、测序

扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果示：扩增出一条约500～600bp的GDNF基因条带，和一条约1200～1500bp的EGFP基因条带，见图2。

应用美国ABI全自动序列仪检测GDNF（558bp）和pIRES2EGFPDNA（1308bp）序列，结果通过DNASIS软件与GenBank中的序列进行同源性序列分析，pIRES2EGFP的片段与GenBank中序列完全一致。GDNF片段在前蛋白的片段上出现了一个碱基突变，经查证属同义突变，不会影响GDNF蛋白质的表达，与完整序列（636bp）比对，有78bp的碱基缺失(图3中黑框部分)，见图3。

2.3pLXSNIRES2EGFPGDNF双表达载体的构建

经酶切、连接等步骤，构建pLXSNIRES2EGFPGDNF重组质粒。利用EcoRI进行酶切鉴定。酶切后电泳后可见2条带，一条约250bp，另一条约6000～8000bp，与预期一致，可初步判断重组质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF已经构建成功，见图4。

2.4包装细胞病毒滴度测定

挑选的10个阳性细胞克隆，其病毒滴度最高为2.5×106cfu/ml，将其细胞扩增并冻存，以备后续实验。

2.5荧光显微镜及流式细胞仪检测

在荧光显微镜下可观察到，电转染PT67细胞后，大量的PT67细胞胞质内含EGFP的目的基因片段在蓝色荧光激发下(波长408nm)，发出明亮的绿色荧光(波长508nm)，见图5。经流式细胞仪检测，以未经转染的PT67细胞做空白对照，转染效率约为24.4%，见图6。

目前已证实GDNF对神经具有营养、保护作用，同时还可抑制由毒素、环境等原因诱发的神经元变性、坏死〔1〕。目前认为PD的主要病理特征为中脑黑质中多巴胺能（DA）神经元进行性变性减少，致纹状体中DA含量下降。Smith等〔2〕发现GDNF可通过抑制活性氧损伤和细胞毒物质的生成来保护DA能神经元，Zeng等〔3〕研究发现：GDNF可以逆转细胞凋亡所致的DA能神经元坏死，提高TH阳性神经元的存活率。于是，如何应用外源性GDNF治疗PD成为人们研究的又一热点。本研究从人脑胶质细胞瘤中提取GDNF基因片段，期望探索GDNF基因转移高效率表达的方法，为今后进一步应用于临床研究奠定基础。

本研究最终得到GDNF基因片段为558bp，测序后结果与GenBank中完整序列（636bp）比对，有78bp的碱基缺失。Grimm等〔4〕检查了大鼠B49细胞系和人胚肾HEK293细胞系中GDNF的表达状况，发现这些细胞均表达558bp和636bp片段。也有学者证实，两种GDNF前体在胚胎鼠的表达部位一致，生物学活性相同。本实验得到的GDNF基因，通过DNASIS软件与GenBank中的序列进行同源性序列分析，发现在前蛋白的片段上出现了一个碱基突变，但属于同义突变，故不影响GDNF蛋白质的表达。自此，人GDNF基因成功被克隆。

由于GDNF不能直接通过血脑屏障，故如何将其移植入生物体内且发挥作用是个关键的问题。有学者尝试过不同的方法，如：GDNF直接向纹状体、黑质或脑室内注射；将胚胎中脑组织用GDNF处理后植入脑内等。本研究采用将GDNF基因克隆入逆转录病毒载体的方法，同时克隆入载体的还有带IRES序列的报告基因EGFP。这样做的优势在于：①逆转录病毒载体pLXSN，含有指导特异性整合的信号，插入的外源基因整合后仍是完整的，能保证基因插入质粒后正确表达，保留基因的生物特性〔5〕。②逆转录病毒载体转染细胞后，能够在逆转录酶的作用下形成与之互补的前病毒DNA，在int基因的作用下整合至靶细胞的基因组中，在子代细胞中形成稳定的基因表达。稳定的表达有利于持续观察GDNF基因对神经元的修复、保护作用。③构建IRES序列连接的GDNF和EGFP基因的双表达载体，同时转录，但翻译各自独立，由于两者共用一个启动子，因此所有表达EGFP的转染细胞必然也同时表达目的基因GDNF，在荧光显微镜下观测到亮绿色的荧光蛋白，即等于观测到了GDNF的表达，为观察提供方便。

本研究成功构建了pLXSNIRES2EGFPGDNF重组质粒，脂质体Lipofectamine2000介导下转染包装细胞PT67，G418筛选出高滴度细胞克隆，为下一步转染骨髓间充质干细胞奠定了基础，在探索PD动物模型的基因治疗方面又前进一步。

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【摘要】目的:观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Adpten)体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞后的表达，并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用.方法:利用AdEasy腺病毒载体系统构建Adpten，体外转染高转移卵巢癌HO8910PM细胞，荧光显微镜检测Adpten的转染效率.Western印迹检测pten在HO8910PM细胞中的表达；MTT实验观察pten对细胞生长的影响；HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响；细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用；Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO8910PM细胞凋亡的诱导作用.结果:外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO8910PM细胞，Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达，当感染复数MOI为100时，体外转染效率高达90%以上.pten显著抑制HO8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移.结论:重组腺病毒是高效的基因转移系统，能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO8910PM细胞中，对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用，并能抑制其迁移.

【关键词】卵巢肿瘤；基因治疗；pten基因；腺病毒；细胞凋亡；迁移抑制

1.1材料人高转移卵巢癌HO8910PM细胞和人胚肾细胞293T购自中国科学院上海细胞生物学研究所；野生型pten表达质粒（wtpten）为美国加州大学FrankFurnari教授惠赠；AdEasy腺病毒表达载体系统由美国休斯霍华德医学院及JohnHopkins肿瘤中心BertVogelstein教授惠赠，其中穿梭载体pAdTrackCMV带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)，在表达外源基因同时也能单独表达gfp，用于重组腺病毒的快速筛选以及转染率的测定；抗PTEN抗体为美国SantaCruz公司产品;HRP标记羊抗鼠IgG抗体和马抗山羊IgG均购自北京生物技术有限公司；MTT为美国Amerson公司产品.Hoechst33258细胞凋亡染色试剂盒购于武汉碧云天生物技术公司.

1.2.1重组腺病毒载体的构建及细胞培养应用细菌内同源重组的方法，构建携带野生型pten基因的重组腺病毒Adpten及阴性对照Adgfp［8］.HO8910PM细胞培养于含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的RPMI1640培养液中，置50mL/LCO2，37℃孵箱培养.

1.2.2Adpten转染效率的测定取指数生长期的高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104/孔接种于6孔培养板中，24h后吸弃培养基，换无血清RPMI1640培养基，用25，50，100感染复数(multiplicityofinfection，MOI=病毒颗粒数/转染的细胞数)的腺病毒感染，培养6h后，换完全培养液继续培养.24h后在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞百分率.确定HO8910PM细胞转染所需的MOI值，使得转染效率＞90%.

1.2.3WesternBlot检测转染细胞表达的PTEN蛋白取对数生长期细胞，按2×106接种于25cm2培养瓶中.常规条件培养24h后，按MOI=100加入病毒，设Adpten组和Adgfp组，培养6h后，换完全培养液继续培养.48h后提取细胞总蛋白；以Bradford酶标仪蛋白定量法测定蛋白含量，然后作SDSPAGE（12g/L），于4℃冰箱中90mA恒流电转过夜，使目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭液于4℃封闭过夜，将膜转至新的封袋中，按0.1mL/cm2加入适量的一抗稀释液（小鼠抗人PTEN单抗按1∶300封闭液稀释，山羊抗人Actin多抗按1∶500封闭液稀释），封口后，室温下平缓摇动反应4h.TBS洗涤后加入二抗稀释液（PTEN，Actin的二抗均按1∶2000封闭液稀释），同条件反应1h.大量TBS洗涤去除未结合的二抗.ECL（化学发光）处理，暗箱中以X光胶片曝光，显影、定影.

1.2.5HE染色观察细胞形态取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，以5×104接种于35mm培养皿中，24h贴壁后，加入Adpten或Adgfp感染，并设加PBS为空白对照；病毒感染方法同1.2.4，24h后弃培养基，生理盐水漂洗，950mL/L乙醇固定15min，苏木素染色3～10min，自来水冲洗5～8min，5～10mL/L盐酸酒精分化数分钟，自来水冲洗5～8min，然后加温热水5～10min显蓝，自来水充分冲洗，伊红复染2min，再次用自来水充分冲洗，普通光学显微镜下观察.

1.2.6细胞划痕试验取指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞，按2×104/孔接种于6孔培养板，用RPMI1640完全培养基孵育24h后，用移液枪枪尖在细胞培养基表面划一条痕迹（长约2cm），用PBS洗3次后加入无血清RPMI1640培养基，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，继续培养48h后镜下观察.

1.2.7Hoechst33258凋亡染色取对数生长期HO8910PM细胞2×104/孔接种于6孔板，病毒感染方法同1.2.4，设加PBS为空白对照，48h后用固定液固定10min，PBS洗2次，Hoechst33258染色5min，荧光显微镜下观察.

统计学处理:本实验采用SAS8.0统计软件进行统计分析，用单因素方差分析(ANOVA)，P

2.1Adpten对HO8910PM细胞体外转染效率的测定Adpten在体外感染人高转移卵巢癌HO8910PM细胞具有较高的转染效率.在MOI=100时可以达到90%以上（图1）.

A:荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;B:同一视野下光学显微镜观察.

图1Adpten(MOI=100)感染HO8910PM细胞的效果×200

2.2Western检测转染后PTEN蛋白的表达Western印迹分析结果表明，Adgfp感染后的HO8910PM细胞未见特异性条带；而Adpten感染后的HO8910PM细胞，则见到特异性条带，而且Pten蛋白表达量也较高（图2）.

图2WesternBlot检测PTEN蛋白的表达

2.3Adpten对HO8910PM细胞增殖的影响以MOI=100病毒感染后24，48，72h，通过吸光度值计算，Adpten的抑制率分别为(89.76±1.49)%，(91.11±1.38)%，(92.38±1.78)%，而Adgfp感染组分别为(8.14±2.16)%，(7.82±2.32)%，(6.16±2.86)%，二者比较，差异有统计学意义（P

2.4Adpten对HO8910PM细胞形态的影响重组腺病毒Adpten感染及非病毒感染(对照)的3组HO8910PM细胞，经HE染色光镜下观察可见，正常对照及Adgfp处理组细胞成片生长，细胞间隙紧密，胞质舒展，核分裂现象明显.Adpten处理组细胞则细胞间隙变大，胞质红，核固缩，易见凋亡小体(图3).

A:PBS对照组;B:Adgfp处理组;C:Adpten处理组.

图3Adpten感染对HO8910PM细胞形态的影响HE×400

2.5Adpten对HO8910PM细胞迁移能力的影响重组腺病毒Adpten感染后的指数生长期高转移卵巢癌HO8910PM细胞与对照组(PBS空白组和Adgfp组)比较，Adpten能有效地抑制HO8910PM细胞的迁移（图4）.

2.6Adpten诱导HO8910PM细胞凋亡Hoechst33258荧光染色结果显示，重组腺病毒Adpten感染HO8910PM细胞48h后，Adpten感染组出现典型的凋亡形态学改变，可见胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩，还可见膜包裹的凋亡小体.而PBS对照组和Adgfp组的细胞均未发生形态学的改变（图5）.

随着分子生物学及分子遗传学的发展，癌基因的激活和抑癌基因的突变失活，是目前较为公认的肿瘤发生发展的重要原因之一.本文研究的抑癌基因pten，其突变和缺失常见于多种恶性肿瘤，与肿瘤的发生发展有着密切关系.目前普遍使用的肿瘤的基因治疗方法是导入外源性野生型抑癌基因补充或替代突变的抑癌基因.我们选用重组腺病毒载体导入抑A0，A1:PBS对照组;B0，B1:Adgfp处理组;C0，C1:Adpten处理组;A0，B0，C0:0h;A1，B1，C1:感染后48h.

癌基因pten，其极少发生插入突变，载体操作方便、宿主广泛、容易繁殖，并具有携带外源基因容量大，可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点，已广泛用于多种疾病的体内基因治疗.国外报道的AdEasy系统［9］除具有腺病毒载体的一般优点外，还具备以下优点：①在细菌体内完成同源重组，重组效率高，周期短；②利用含不同抗生素筛选重组子，简化了筛选工作；③经重组的腺病毒带有gfp基因，可直接通过荧光显微镜监测病毒的生成，病毒滴度的测定和对宿主细胞的转导效率的检测都较传统方法简便易行.我们利用AdEasy腺病毒载体系统构建了携带野生型pten基因的重组腺病毒，导入人高转移卵巢癌HO8910PM细胞，证实pten基因在HO8910PM细胞中能高效地表达.通过MTT比色检测，发现Adpten对HO8910PM细胞具有显著的增殖抑制作用，能有效地抑制该癌细胞生长.细胞划痕实验证明Adpten能有效地抑制该癌细胞的迁移.Hoechst33258凋亡染色结果也表明pten具有诱导该癌细胞凋亡的作用.

本研究结果表明，携带野生型pten基因的重组腺病毒是一种高效的基因转移系统，能将pten目的基因转移到受体细胞中，对人高转移卵巢癌HO8910PM细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导效应，并能抑制该癌细胞迁移，为进一步的基因治疗卵巢癌的研究奠定了基础.

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Keywords：bonetissueengineering;bonemorphogeneticprotein;fusiongene;adenoassociatedvirus;bonemarrowstromalcells

骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)具有诱导骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)向成骨或成软骨细胞分化、促进新骨形成的作用。BMPs家族已发现20余种成员，以BMP2、BMP4、BMP7的活性最强，它们可促进软骨和新生骨形成。在促进骨及脊柱融合的实验中已取得了成功的经验［1］，其中BMP4，7均表现出不同的促进骨和脊柱融合的作用［2，3］。人体内BMPs多为同源二聚体，也存在少量的异源二聚体，如BMP2／7，BMP4／7等。文献报道BMPs异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍［4，5］。

1.1实验材料

引物设计根据pGEMBMP4／7质粒为测序模板，用pGEM两侧特异的引物进行测序。

1.2实验方法

（1）兔BMSCs的体外培养：取健康新西兰大白兔13只(由哈尔滨医科大学附属第一医学院中心实验室提供)，雄性，体重20kg左右，2.5个月龄，按全骨髓法分离培养BMSCs，进行原代培养，待细胞汇合成单层后，消化传代，取生长状态良好的第3代细胞进行转染实验。

（2）pGEMBMP4的构建及鉴定：根据GeneBank中和hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoRI位点，下游引入BamHI位点，从胎盘组织中，RTPCR一步法扩增BMP4成熟肽序列，将BMP4基因克隆入pGEMT载体中，获得重组质粒pGEMBMP4，然后用EcoRI和BamHI酶切pGEMBMP4质粒，回收酶切片断。T4连接酶16℃过夜，转化大肠杆菌，DH5α感受肽细胞，筛选阳性克隆，获得pGMEBMP4，EcoRI、BamHI双酶切，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR引物扩增鉴定，以pGEM多克隆位点两侧特异引物进行测序，与GeneBank中的BMP4成熟肽序列比对。

(5)AAVBMP4／7转染对细胞形态学的影响：取生长状态良好的第3代细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，接种到24孔板，每孔均匀接种105个细胞，培养至70％融合，进行病毒感染，实验按照AAV转染细胞感染复数(Multiplicitofinfection，MOI)值，按梯度选取4组不同MOI值，分别为5×104vg／cell，1×105vg／cell，5×105vg／cell，1×106vg／cell，每组6孔，按不同的MOI值，将各孔所需要的病毒量及血清DMEM，加入各孔，转染2h后，吸出病毒液，加入普通DMEM，常规培养，转染后每24h观察细胞学改变。

(6)AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响取MOI值为1×105vg／cell的病毒转染兔BMSCs(转染组)2h，取未转染的BMSCs为对照组(非转染组)。将细胞消化收集后，按1×104／孔接种于96孔板，于接种后12、24、48、72、96h，行MTT法测定细胞活性(λ630nm)，并描记细胞生长曲线，比较两组细胞增殖情况，观察AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响。

(7)AAV病毒的转染效率：取生长状态良好的第3代细胞，以1×105vg／cellMOI值转染2h后，行流式细胞仪检测绿色荧光表达，计算细胞转染效率(实验重复6次)，5×104vg／cellMOI值为对照。

(8)AAVBMP4／7转染对细胞成骨活性的影响:以AAVBMP4／7转染细胞2h(实验组)后，培养7、14d，在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变，观察成骨分化，以AAVEGFP为对照病毒，进行相应实验对照(对照组)(每组样本量为6份)。于转染后培养7、14d，分别收集两组细胞上清液，按ALP检测试剂盒说明处理上清，比色仪测定(520nm，1cm光镜比色)，计算上清液中ALP的含量；另于转染后培养7、14d，分别收集两组细胞上清液，按照试剂盒说明检测OC值，收集细胞培养液100μl，与125I标记的OC抗体100μl混合后，4℃下放置24h，加入分离剂混匀后，室温放置，4℃离心弃去上清检测沉淀物放射剂量，计算各组平均OC含量。

1.3统计学处理

应用SPSS11.5统计学软件包进行分析，数据用±s表示，组间比较采用两组独立样本的t检验，P

2.1pGEMBMP4及pGEMBMP7的构建与鉴定

从阳性克隆中提取pGEMBMP4质粒及pGEMBMP7质粒，经双酶切后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR引物扩增鉴定，分别可见374、451bp亮带(图1，2)测序结果与GeneBank中报道的BMP4基因和BMP7基因成熟肽序列完全符合。

2.2AAVBMP4／7的构建与鉴定

图1BMP4重组质粒双酶切鉴定图2PCR产物及BMP7重组质粒酶切鉴定图3融合基因克隆载体鉴定M：DNAMarker1.PGEM／BMP4，PGEM／BMP7，融合基因2.PCR片断图4PBV222／BMP4／7表达质粒酶切鉴定1．丸DNA分子量标准2．EcoRI与PstI酶切质粒AAVBMP4／73．BamHI、PstI切质粒AVVBMP4／74．EcoRI与BamHI酶切质粒AAVBMP4／75．BMP7PCR片断6．BMP4PCR片断M：DNAMarker

2.3AAVBMP4／7转染对细胞学形态学的影响

以不同的MOI值分别转染兔BMSCs细胞，转染后24h，各组均可观察到细胞形态变化，长梭形细胞收缩，边缘不规则，72h后上述改变明显，部分细胞失去BMSCs典型细胞形态，排列不规则，呈多角形或无规矩形。上述改变随着MOI值地增大而显著，5×104vg／cell基本无明显变化，1×105vg／cell变化较轻，1×106vg／cell组影响最明显，部分细胞崩解(图5)。

图5AAVBMP4／7转染72h后细胞改变5a5×104vg／cell细胞无明显变化5b1×105vg／cell变化明显，长梭形细胞收缩，边缘不规则5c5×105vg／cell细胞进一步变化5d1×106vg／cell部分细胞崩解(×200)2.4AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响

转染组和非转染组细胞于接种后12、24、48、72、96h行MTT(λ=630nm)法测定细胞活性，绘制生长曲线，结果表明两组细胞倍数增殖期均出现于24h，转染组活性略低于未转染组，但细胞增殖活跃，提示AAV对细胞生长曲线的影响小(图6a、b)。

图6AAVBMP4／7转染对细胞增殖活性的影响及转染BMSCs细胞的转染效率6aMOI值1×105vg／cell转染6bMOI值5×104vg/cell转染

2.5AAVBMP4／7转染效率检测

取生长状态良好的第3代细胞，以MOI值1×105vg／cell转染，流式细胞仪计算转染效率，平均转染效率为72％，MOI值时对细胞形态影响较小，而转染效率强于5×104vg／cell(59.38％)。(x2=15.58，P

2.6AAVBMP4／7对细胞成骨活性的影响

(1)倒置相差显微镜观察：取AAVBMP4／7转染组及AAVEGFP转染组细胞，于转染后7、14d，倒置相差显微镜观察，可见AVBMP4／7组于转染后7d，细胞形态发生明显改变，起初细胞分布不均匀，出现局部密集，局部疏松，细胞呈多角形，高倍视野下可见胞浆内出现棕褐色颗粒，呈现明显的成骨改变。14d后可见细胞呈复层生长，胞浆内棕褐色颗粒更加明显，可见细胞性钙结节形成。AAVEGFP组仅见细胞收缩，边缘不规则，无成骨细胞分化的特异改变(图7)。

图7AAVBMP4／7转染后倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化7a转染7d细胞分布不均匀；扫现局部密集，局部疏松，细胞呈多角形，町见胞浆内出现棕褐色颗粒(×200)

7b转染14d细胞呈复层生长，胞浆内棕褐色颗粒更加明显(×200)7cAAVEGFP转染组细胞无明显变化(×200)

(2)ALP含量测定：取两组细胞转染后，7、14d细胞上清液，计算ALP含量，AAVBMP4／7组分别为：67.2±8.4金氏单位，106.5±12.1金氏单位，AAVEGFP组分别为：10.1±2.7金氏单位，23.6±4.8金氏单位，两组间差异有统计学意义(t=896.88，P

(3)OC含量测定：取两组细胞转染后7、14d的细胞上清液，计算OC含量，AAVBMP4／7组分别为0.289±0.014ng／ml，0.363±0.076ng／ml；AAVEGFP组分别为0.011±0.007ng／ml，0.017±0.010ng／ml，两组间差异有统计学意义(t=543.24，P

AAV基因组可以整合入宿主细胞的基因组DNA中，保证了外源基因长期稳定表达。AAV末端重复序列中的转录元件方向不指向宿主DNA，插入突变的可能性很小。该病毒载体还可整合入分裂及非分裂期细胞，宿主范围较宽［11，12］，因而在应用基因工程技术解决重组基因获得持续表达的问题中，AAV可作为较合适的病毒载体，是目前基因治疗基础和临床研究中最常用的载体之一。

目前文献中报道AAV转染细胞的MOI值差异很大，从1×104～1×106vg／cell，均有报道［12，13］。本实验通过采用不同梯度的MOI值转染细胞发现，1×105vg／cell对细胞形态影响较小，对细胞增殖活性无明显影响，转染效率为72％，明显高于文献中报道的脂质体感染率20%～30％。有学者报道5×104vg／cell即可达到良好的转染效率(55%～65％)，对细胞增殖活性影响也较小［14］。本实验结果认为，1×105vg／cellMOI值转染效率高于5×104vg／cellMOI值，前者可作为常规选取的MOI值，既保证了一定的转染病毒量，同时也保证了良好的转染效率，经统计学分析，与文献［14］报道的转染效率间差异无统计学意义(P>0.05)。

综上，本实验成功将BMP4、BMP7连接并构建了融合基因BMP4／7，通过AAVBMP4／7转染BMPSs，初步探讨了AAVBMP4／7对靶细胞生物学行为的影响，结果表明，BMP4／7有生物学活性，可通过AAV在靶细胞内高效表达，可加速BMSCs向骨表型转化，促进骨形成。本实验为骨组织工程的基因治疗提供了一个新的思路，为尝试用BMPs的融合基因有效提高成骨活性，提供实验研究基础。

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本研究探讨转染survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC进行诱导培养，以AdSVV转染DC，用Westernblot鉴定Survivin的表达，用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，用混合淋巴细胞反应（MLR）测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，以ELISA法检测上清中的细胞因子IL12含量。结果表明：在MLR中，刺激应答比（S/R）为1∶5、1∶10、1∶50和1∶100时，转染AdSVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力；转染AdSVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组；转染病毒后第2天，转染AdSVV的DC组的IL12分泌水平高于对照DC组。结论：含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应，对CA46细胞有明显的杀伤作用。

【关键词】survivin基因树突状细胞CA46细胞系淋巴瘤细胞毒性T细胞免疫治疗

InductionofAntilymphomaCytotoxicTCellEffectbyDendriticCellsTransfectedwithRecombinantAdenovirusVectorsCarryingSurvivinGene

Abstract

Thisstudywaspurposedtoinvestigatetheimmunologicaleffectsofmodifieddendriticcells(DCs)ininducingcytotoxicTcells(CTLs)effectagainstlymphomacells.TheDCswerederivedfromhumanperipheralbloodandtransfectedwithrecombinedadenovirusvectorcarryingsurvivingene，Westernblotwasusedtodetecttheexpressionofsurvivin，thelactatedehydrogenase(LDH)releasetestwasusedtodeterminethecytotoxicityofCTLs，themixedlymphocytereaction(MLR)wasusedtomeasuretheabilitytoproleferateallolymphocytebyDCs，ELISAwasusedtoassayIL12levelinsupernatant.

TheresultsshowedthattheexpressionofsurvivinintransfecteddentriticcellswasconfirmedbyWesternblotanalysis.InMLRassay，DCstransfectedwithAdsurvivincouldinducehigherallogeneiclymphocytesreactionattheratiosof1∶5，1∶10，1∶50and1∶100.DCstransfectedwithAdsurvivinhadmuchhigheractivityofCTLtoCA46cellsthancontrolDCs.ThelevelsofIL12ofsupernatantscontainingDCstransfectedwithAdsurvivinweresignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup.ItisconcludedthatDCstransfectedwithAdsurvivincaninduceCTLresponseinvitroagainstlymphomacells.

Keywords

survivingene；dendriticcell；CA46cellline;lymphoma;cytotoxicTcell;immunotherapy

树突状细胞(dendriticcell，DC)作为机体内功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用，而survivin（存活蛋白，SVV）基因是肿瘤组织较为特异的基因，其编码的蛋白survivin成为肿瘤较理想的靶抗原之一。因此，我们以重组腺病毒介导SVV基因修饰DC，观察诱导产生的特异性抗淋巴瘤免疫效应，为以DC为基础肿瘤免疫治疗提供实验依据。

材料和方法

材料

表达survivin蛋白的重组腺病毒（AdSVV）由本所构建、包装［1］，滴度为：AdSVV2.65×109pfu/ml；恶性淋巴瘤细胞株CA46为本室保存株。总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国Pierce公司产品；兔抗人survivin多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品；辣根标记山羊抗兔IgG、Westernblottinglunimol试剂（ECL）为SantaCruz公司产品。Cytotox96NonRadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒购自Promega公司。细胞因子IL12检测试剂盒购自深圳晶美生物公司。

中国实验血液学杂志JExpHematol2007;15(3)转染存活蛋白基因的树突状细胞抗淋巴瘤免疫的研究DC的分离、培养和病毒感染

人外周血DC的分离和培养参照文献［1］，收集培养第7天的DC，按MOI为100加入重组腺病毒，分为3组：转染AdSVV的DC组(AdSVVDC)、空载体转染DC组（AdCMVDC）和未转染DC组（NDC），并补充生长因子GMCSF、IL4（终浓度均为1000U/ml）。于37℃5%CO2，培养箱继续培养48小时(第9天)收集细胞。

Survivin蛋白表达的Westernblot鉴定

收集第9天转染AdSVV的DC组和空载体转染DC组的DC，进行蛋白质抽提，SDSPAGE电泳，Westernblot鉴定外源基因SVV蛋白的表达［1］。

同种混合淋巴细胞反应(MLR)测定

取培养第9天的AdSVVDC和NDC，分别加入丝裂霉素C，使其终浓度为50μg/ml，在37℃，5%CO2的培养箱中培养45分钟，作为刺激细胞。分别以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔将DC加入96孔板中，以T淋巴细胞供者自身的PBMC为对照组，每组设3个复孔。每孔均加入1×105的T淋巴细胞，刺激反应细胞之比（S/R）分别为1∶5，1∶10，1∶50，和1∶100，终体积200μl，于37℃，5%CO2的培养箱中培养96小时。终止培养前4小时加入MTT20μl（5mg/ml），培养终止后加DMSO200μl，充分混匀后静置。选择波长为570nm处测OD570值。计算刺激指数（SI），结果以3孔的均值表示。

刺激指数（SI）=实验孔OD均值/对照孔OD均值

CTL细胞体外杀伤活性的检测

效应细胞的制备取培养第9天的AdSVVDC组细胞和NDC组细胞各5×105，作为刺激细胞，加入到24孔培养板中，按5×106/孔加入经T细胞尼龙毛柱分离的T淋巴细胞（反应细胞）；同时以不与DC共孵育的自体淋巴细胞为对照，每组设3个复孔。加入IL2（500U/ml），于37℃、5%CO2的培养箱培养。以后隔天半量换液，并补充IL2，继续培养至第14天，作为效应细胞。

CTL的活性测定以1×104∕孔加靶细胞（CA46）到96孔板中，再分别按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）加效应细胞到各孔中，每组设3个复孔。同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组。按Cytotox96NonRadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒说明书检测CTL反应，以对靶细胞的杀伤率表示CTL活性。

细胞杀伤率(%)=［（实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放）］×100%

细胞因子的检测

收集培养AdSVVDC以及NDC的当天、第2天、第4天上清，按试剂盒说明书方法进行IL12含量检测。

统计学处理

本实验数据应用SPSS11.5统计软件进行方差分析。

结

果

存活蛋白的表达

经Westernblot检测，转染AdSVV的DC在16.5kD处可见一阳性条带（附图），提示经基因转导的DC可有效表达SVV蛋白，而未转导基因的DC未检出SVV蛋白表达。

Figure.ExpressionofSVVproteindetectedbyWesternblot.M:marker.Lane1:AdCMVtransfectedDC.Lane2:AdSVVtransfectedDC.

刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力

在不同的S/R（刺激细胞/应答细胞为1∶5、1∶10、1∶50、1∶100）比值时，转染AdSVV的DC与未转染的DC比较，具有更强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力（P

CTL杀伤活性的检测

在效靶比（E/T）为5∶1、10∶1和20∶1时，转染AdSVV的DC（AdSVVDC）所诱发的CTL活性均值分别为23.48％、38.24％和46.76%，未转染的DC（NDC组）诱发的CTL活性为7.32%、8.83%、14.72%，两组间的CTL活性有显著性差异（P

在转染病毒后第2天、第4天，AdSVVDC组和NDC组的IL12分泌水平分别为50.7±3.2pg/ml和56.4±2.7pg/ml及36.5±1.8pg/ml和42.3±2.6pg/ml。AdSVVDC组的IL12分泌水平高于NDC（P

讨

论

非霍奇金淋巴瘤（NHL）的发病率及死亡率均有上升趋势，传统治疗难以彻底消灭肿瘤细胞，因此如何进一步提高疗效并最终根治本病，已成为目前研究的热点和难点。近年来，对树突状细胞在肿瘤抗原呈递和肿瘤免疫中重要作用的揭示，开拓了肿瘤免疫治疗的又一新领域。肿瘤疫苗即肿瘤的特异性主动免疫治疗，近年来取得了可喜进展，其中尤以DC疫苗的进展最为瞩目［2，3］。

Survivin基因是一个抗凋亡基因，它在大多数肿瘤组织中表达，而在正常成人组织中不表达。业已证明，HL60、K562、CA46、U266等血液肿瘤细胞系均高表达survivin［4，5］。因此，应用靶向survivin的免疫治疗有望成为一种重要的抗肿瘤疗法。Schemitz等［6］将自身DC与可溶性重组survivin共培育，诱导出survivin特异性的CD8+CTL，首次证实了survivin可作为一种潜在应用价值的肿瘤疫苗抗原。

本实验用重组腺病毒介导SVV基因转染DC，通过检测证实DC能够表达SVV抗原蛋白，转染后成熟DC仍具有较强刺激同种异体T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子的能力。此研究结果说明Ad能够高效介导目的基因感染DC，重组腺病毒不影响DC的成熟及其功能，是目前基因治疗研究中较为理想的载体。

在研究靶细胞毒性实验中，我们应用CytoTox96非放射试剂盒测量乳酸脱氢酶（LDH）在细胞裂解后的释放量，结果表明转染survivin基因的DC在体外能诱导特异性CTL，杀伤淋巴瘤细胞。这提示用重组腺病毒载体介导survivin基因的DC疫苗可能是抗淋巴瘤治疗中有效的方法。

1朱雄鹏，陈志哲，林旭等.存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达.中国实验血液学杂志，2006；14：791-794

2SteinmanRM，CohnZA.Identificationofanovelcelltypeinperipherallymphoidorgansofmice.IMorphology，quantitation，tissuedistribution.JExpMed，1973;137:1142-1162

3BanchereauJ，BriereF，CauxC，etal.Immunobiologyofdendriticcells.AnnuRevImmunol.2000;18:767-811

4ZeisM，SiegelS，WagnerA，etal.GenerationofcytotoxicresponsesinmiceandhumaninpidualsagainsthematologicalmalignanciesusingsurvivinRNAtransfecteddendriticcells.JImmunol，2003;170:5391-5397

作者：张惠中范清宇杨安钢

【关键词】逆转录病毒载体

关键词:逆转录病毒载体;包装细胞;集落形成单位

Keywords:retroviralvector;packagingcell;colony-formingunits

Abstract:AIMTooptimizethemethodsofmanufacturingretroviruscontainingsupernatantofPA317packagingcelllinefortheuseintheretroviral-mediatedgenetransfer.METHODSStudieswereconductedusingpSLXCMVretro-viralvector.Thecolonyformingunit（cfu）influencefactorsincludingpackagingcelldensity，incubationtemperature（32℃and37℃），incubationtimeanddifferentpurificationmethodwerecompared，respectively.RESULTSResultsdemonstratedthat1.2×106PA317packagingcellsseededin100mmplatewiththeincubationconditionat37℃for24hourscouldgetthehighestcfutiterofretroviralcontainingsupernatant.Asforpurification，therewasnosignificantdif-ferencebetweenfilterandcentrifugationmethods.CONCLUSIONTheseresultswillbeusefulforthosewhouseretrovi-ralvectorforexvivogenetherapyexperiment.

在目前众多的基因治疗临床试验方案中，逆转录病毒载体仍是被广泛应用的载体之一［1-4］.作为目的基因转运过程中的逆转录病毒载体和包装细胞，其本身的分子生物学特性已被广泛研究，但对于包装后这些含目的基因的重组逆转录病毒之生物、物理学特性（如病毒对温度的敏感性、纯化方法等的影响）的研究却较少.为此，我们对产生重组逆转录病毒的包装细胞系的建立过程及其上清中重组逆转录病毒集落形成单位（colonyformingunit，cfu）影响因素进行了比较性研究.

1.1材料本实验所用表达载体为含有新霉素磷酸转移酶基因（neo）的鼠白血病源性逆转录病毒表达载体pSLXCMV，PA317包装细胞及Swiss小鼠成纤维细胞NIH3T3培养于含100mLL-1小牛血清（GIBCO-BRL）的DMEM培养液中.

1.2.1逆转录病毒载体包装及包装后cfu滴度测定以标准的磷酸钙共沉淀法（Promega，Inc.Kit）转染20μgpSLXCMV质粒到PA317细胞14h，换液继续培养24h，换含500mgL-1G418（Geneticin）的培养液直至抗G418的集落形成，挑选60个克隆，扩大培养，测定包装细胞上清中病毒的cfu;接种2.5×105NIH3T3细胞，次日移出培养液，加入10-2，10-4，10-6稀释的含重组逆转录病毒的包装细胞上清1mL.4h后加入5mL完全DMEM培养液继续培养18～24h.换含有500mgL-1G418培养液继续培养7～10d，直至抗性集落形成.结晶紫染色，计算三个梯度中的cfu（Fig1）.

图1略

1.2.4离心及过滤纯化对包装细胞上清中病毒cfu影响选择高cfu滴度的包装细胞克隆用以制备含重组逆转录病毒的细胞上清，分别用1500g离心10min纯化及Acrylic.45Micron滤器（CorningInc）纯化，测定cfu，比较它们之间cfu滴度的变化.

在以pSLXCMV质粒转染的PA317细胞中挑选60个G418抗性细胞集落，并分别于培养1wk和10wk测定cfu.其中4个克隆#17，#19，#28，#34于1wk的cfu分别为2.8，3.3，1.8，2.2（coloniesL-1），而在10wk测得的cfu分别为1.6，2.7，0.9，0.8（coloniesL-1）.

图2略

目的基因导入靶细胞是整个基因治疗过程中一个重要环节，其效率的高低将直接影响整个基因治疗的效果甚至成败，而包装后逆转录病毒滴度的高低是重要参数之一.我们从逆转录病毒载体转染的PA317包装细胞中挑选了60个G418抗性细胞集落，经测定仅有4个集落cfu>106.经1W至10W传代培养后测定cfu，所有4个在1Wcfu很高的细胞集落经10W传代培养后其cfu滴度均有所下降，其中#28及#34的cfu

［1］DanosO，MulliganRC.Safeandefficientgeneratiionofrecom-binantretroviruseswithamphotropicandecotropichostranges［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1988;85（17）:6460-6464.

［2］MillerAD，MuttlmoreS.Redesignofretroviruspackagingcelllinestoavoidrecombinationleadingtohelpervirusproduction［J］.MolCellBiol，1986;6（8）:2895-2902.

［3］MillerAR，SkotzkoMJ，PhoadesK，RhoadesK，BelldegrunAS，TsoCL，DabooR，McbrideWH，JacobsE，KohnDB，MoenR.Simultaneoususeoftworetroviralvectorsinhumangenemarkingtrials:Feasibilityandpotentialapplications［J］.HumGeneTher，1992;3（6）:619-624.

［4］MuenchauDD，FreemanSM，CornettaK，ZwiebelJA，Ander-sonWF.Analysisofretroviralpackaginglinesforgenerationofreplication-competentvirus［J］.Virology，1990;176（1）:262-265.