徐韶棠1，杨轶浠1，2*，王艺瑾1，郭育涛1，刘雅宁1，张佳敏2，覃小颖3，张珏1
（1.成都大学食品与生物工程学院，四川成都610106；2.成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川成都610106；3.四川良源食品有限公司，四川巴中636000）
关键词：抗氧化活性；赶黄草；分心木；青蒿；代代花；总黄酮；总酚
据报道，植物的抗氧化活性成分主要有黄酮类、多酚类、皂甙类、鞣质类、维生素类、褪黑素类等[7]。其中黄酮和多酚类化合物是许多植物提取物的主要抗氧化活性成分，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗过敏等多种生物活性及药理作用[8-9]。因植物提取物在对抗氧化应激所引起的神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、炎症和糖尿病等各疾病的发病机制中起着重要作用[10]，故对植物的抗氧化活性研究具有重要意义。
分心木是核桃内的木质隔膜，性味苦涩，具有很高的药用价值和良好的抗氧化作用。但是经常被当作垃圾丢弃，造成很大的浪费[11]。2020年，赶黄草通过国家食品安全风险评估中心审查，批准为新食品原料，成为药食同源植物之一，其食用安全性受到认可。赶黄草作为一种药食同源植物，具有极高的药用价值，甚至被赋予了“神仙草”的美誉[12]。代代花分布广泛，资源丰富，同时具有很高的药用价值，但是有关于代代花的研究报道较少[13]。青蒿作为一种常见的植物，从青蒿中提取的青蒿素可以用来治疗疟疾，因此具有极高的药用价值[14]。这4种提取物据报道均含有多糖2.48%～17.12%、黄酮类2.54%～16.40%、多酚类2.39%～6.56%、氨基酸1.00%～3.21%等物质[15-19]，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗过敏等多种生物活性及药理作用。
因此本研究将分心木、赶黄草、代代花、青蒿4种可食用植物及其副产物进行提取，通过DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、铁离子抗氧化能力法3种体外抗氧化能力测试，对4种植物提取物的抗氧化能力进行评价，并将所得到结果与各植物提取物的总黄酮和总酚含量建立联系，以期为天然产物的开发和利用提供依据。
赶黄草（PenthorumchinensePursh）：四川省古蔺县桂花乡臣相赶黄草种植专业合作社；分心木（DiaphragmajuglandisFructus）、代代花（CitrusaurantiumL.）：中国北京同仁堂（集团）有限责任公司；青蒿（ArtemisiaannuaL.）水提取物：长沙中仁生物科技有限公司。
总抗氧化能力（totalantioxidantcapacity，T-AOC）检测试剂盒（ferricreducingabilityofplasma，FRAP微板法）：上海源叶生物科技有限公司；芦丁和亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠（分析纯）：西安化学试剂厂；2，2-二苯基-1苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力检测试剂盒、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6磺酸）[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]自由基清除能力检测试剂盒、没食子酸、福林-酚（Folin-Ciocaileu）试剂（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；试验用水为超纯水。
精密电子天平（AL-104型）：上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；粉碎机（BJ-300A型）：德清拜杰电器有限公司；数控超声波清洗器（KH5200DE型）：昆山禾创超声仪器有限公司；旋转蒸发仪（RV10DS96型）：广州仪科实验室技术有限公司；冷冻干燥机（FDU-2110型）：东京理化器械株式会社；酶标仪（FLEXA-200型）：杭州奥盛仪器有限公司；恒温水浴锅（HH.S21-8型）：上海博迅实业有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9030B型）：上海森信实验仪器有限公司；超纯水制备仪（EPED-EZ-10TJ型）：南京易普易达科技发展有限公司；离心机（5425型）：德国艾本德公司。
1.3.1样品制备
赶黄草、分心木、代代花经晾晒干燥，将样品粉碎后过60目筛待用。
1.3.2植物提取物的制备
分心木的提取参考肖敏等[20]的方法并稍作修改。准确称取粉碎后的分心木粉末40g，以60%乙醇提取活性成分，料液比为1∶30（g/mL），53℃超声辅助提取55min，抽滤，残渣反复提取3次。合并滤液后，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到约5g浅棕色粉末即分心木提取物。
赶黄草的提取参考郭建敏等[21]的方法并稍作修改。准备称取粉碎后的赶黄草粉末60g，以70%乙醇提取活性成分，料液比为1∶25（g/mL），55℃超声辅助提取40min，抽滤，残渣反复提取3次。合并滤液后，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到约6g浅棕色粉末即赶黄草提取物。
代代花的提取参考郝可欣等[22]的方法并稍作修改。准确称量粉碎后的代代花粉末50g，以60%乙醇提取活性成分，料液比为1∶20（g/mL），55℃超声辅助提取40min，抽滤，残渣反复提取3次。合并滤液后，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到约5g棕色粉末即代代花提取物。
青蒿提取物以纯水煮沸回流，按照料液比1∶10（g/mL）提取，经旋转蒸发仪浓缩，并冷冻干燥后即可得到棕黄色粉末即青蒿水提取物。
1.3.3总黄酮含量的测定
参考《中国药典》[23]的方法，并加以改进。精密称定样品各0.15g，加入30%乙醇定容至25mL，超声处理后过滤。精密量取上述滤液2mL，加水定容至25mL作为供试品溶液。分别从供试品溶液中取1mL置于25mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液1mL摇匀，放置6min，加NaOH试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，按照紫外可见分光光度法，在500nm的波长处测定吸光度。
用无水乙醇将于120℃干燥至恒重的芦丁对照品稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL。按上述方法进行操作，以吸光度为纵坐标（y）、浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。
各提取物的总黄酮含量参考芦丁（rutin，RT）标准曲线用芦丁当量（每克样品中黄酮类化合物相当于芦丁的毫克数，mgRT/g）表示，根据公式（1）计算，每个提取物平行测定3次。
式中：c为标准曲线算得被测液中总黄酮浓度，mgRT/mL；v为各待测样品提取液总体积，mL；k为待测样品提取液稀释倍数；m为提取物粉末质量，g。
1.3.4多酚含量检测
参考章林[24]的方法，并加以改进。精密称定样品0.2g加水定容至100mL为待测液。取0.1mL待测液于10mL容量瓶中，加入1.0mL福林-酚试剂，再加入3mL浓度为100g/L的Na2CO3溶液，定容后混匀。然后室温下避光放置反应2h，在765nm处测吸光度。
精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL没食子酸标准溶液（100μg/mL）于10mL容量瓶内，加1.0mLFolin-Ciocaileu试剂，再加入3mL浓度为100g/L的Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀。然后室温下避光放置反应2h，在765nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标（y）、浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。
各提取物的总酚含量参考没食子酸（gallicacid，GA）标准曲线用没食子酸当量（每克干样品中酚类化合物相当于没食子酸的毫克数，mgGAE/g）表示，根据公式（2）计算。每个提取物平行测定3次。
式中：c为标准曲线算得被测液中总酚浓度，mgGAE/mL；v为各待测样品提取液总体积，mL；k为待测样品提取液稀释倍数；m为提取物粉末质量，g。
1.3.5DPPH自由基清除能力检测
将4种植物提取物以纯水为溶剂，配制成一定浓度的样品，10000r/min室温离心3min，取上清液作为待测液。将DPPH母液与无水乙醇按照体积比4∶21的比例配成DPPH工作液。按照DPPH自由基清除能力试剂盒说明书进行加样，混匀后室温避光静置30min后，测定515nm处的吸光度。空白孔、对照孔和测定孔的吸光值分别记为A空白、A对照和A测定。DPPH自由基清除率计算公式如下。
1.3.6ABTS+自由基清除能力检测
将4种植物提取物以纯水为溶剂，配制成一定浓度的样品，10000r/min室温离心3min，取上清液作为待测液。根据比例配成ABTS工作液。按照ABTS+自由基清除能力试剂盒说明书进行加样，充分混匀后室温避光静置6min后，测定405nm处的吸光度。空白孔、对照孔和测定孔的吸光值分别记为A空白、A对照和A测定。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
1.3.7总抗氧化能力检测（FRAP法）
将4种植物提取物由纯水配制成一定浓度，10000r/min室温离心3min，取上清液。将FRAP缓冲液、氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TPTZ）溶液、氯化铁溶液按照体积比10∶1∶1配制FRAP工作液。
标准曲线绘制：用纯水将亚铁标准溶液（10mmol/L）稀释至0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5mmol/L。按照T-AOC试剂盒说明书进行加样，置于37℃水浴锅保温30min后，测定593nm处吸光度值。以系列Fe2+浓度（mmol/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，作出标准曲线。
准确称取提取物以纯水为溶剂，配制成不同的浓度。按照上述方法进行加样，用酶标仪检测593nm处吸光度。样品最终的总抗氧化能力以Fe2+的当量浓度（FRAP值）表示。
式中：cFe2+当量为标准曲线算得提取物相对应的Fe2+浓度，mmol/L；c提取物为提取物浓度，mg/mL。
表1不同植物提取物中的黄酮和多酚含量Table1Contentsofflavonoidsandpolyphenolsindifferentplantextracts
注：同一列字母不同表示差异显著，P<0.05。
植物提取物总黄酮含量/（mgRT/g）总酚含量/（mgGAE/g）分心木21.87±0.55a10.43±0.78b赶黄草17.43±1.41b14.78±0.95a青蒿9.65±0.41c3.45±0.71c代代花5.91±0.72d10.39±0.40b
由表1可知，4种植物提取物中分心木提取物的总黄酮含量最高，为（21.87±0.55）mgRT/g，其次是赶黄草提取物，而青蒿和代代花提取物的总黄酮含量最低；赶黄草提取物的总酚含量最高，为（14.78±0.95）mgGAE/g，分心木和代代花提取物总酚含量之间无显著差异，而青蒿提取物的总酚含量最低。
DPPH自由基清除率的测试是作为判定样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于天然产物、食品、保健品及药品的抗氧化能力研究[25-26]。4种植物提取物对DPPH自由基的清除作用见图1。
图14种植物提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.1DPPHfreeradicalsacvengingactivitiesoffourplantextracts
由图1可知，在一定浓度范围内，4种植物提取物对DPPH自由基的清除率与浓度成量效关系，DPPH自由基的清除率均随浓度的升高而增大。分心木和赶黄草提取物对DPPH自由基的清除率略低于VC，青蒿和代代花提取物对DPPH自由基清除率明显低于VC，这说明了分心木和赶黄草具有较强的抗氧化能力。
对植物提取物浓度和相应的DPPH自由基清除率进行线性回归分析，并通过回归方程得到了不同提取物清除率的IC50。IC50值越小则说明该物质对自由基的清除率达到50%时所需要的物质浓度越小，对DPPH自由基的清除能力强，反之则说明对DPPH自由基的清除能力弱[27]。根据线性回归方程可计算出各提取物的IC50值分别为分心木（38.85μg/mL）、赶黄草（45.88μg/mL）、青蒿（397.50μg/mL）、代代花（634.23μg/mL）。4种提取物DPPH自由基清除能力的大小顺序为分心木＞赶黄草＞青蒿＞代代花。
ABTS法可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定，是使用最广泛的间接检测方法[28]。4种植物提取物对ABTS+自由基的清除作用见图2。
由图2可知，4种植物提取物对ABTS+自由基的清除率与浓度成量效关系，在一定浓度范围内，浓度越大对ABTS+自由基的清除率越大。4植物提取物对ABTS+由基清除率均小于VC，但也表明了4种植物提取物均具有一定的抗氧化活性。
图24种植物提取物对ABTS+自由基的清除作用Fig.2ScavengingeffectoffourplantextractsonABTS+freeradical
各提取物的IC50值，分别为赶黄草0.81mg/mL、分心木1.41mg/mL、青蒿2.16mg/mL、代代花4.03mg/mL，4种提取物ABTS+自由基清除能力的顺序为赶黄草＞分心木＞青蒿＞代代花。
FRAP法是一种通过铁离子还原反应的能力来测定总抗氧化能力的方法[29]。总抗氧化能力标准曲线的线性拟合方程：y=1.6483x+0.1413，R2=0.995，线性关系良好。4种植物提取物的总抗氧化能力见图3。
图34种植物提取物的总抗氧化能力Fig.3Totalantioxidativecapacitiesoffourplantextracts
由图3可知，4种植物提取物的总抗氧化能力大小顺序为分心木[（3.12±0.14）mmol/g]＞赶黄草[（2.74±0.18）mmol/g]＞青蒿[（0.45±0.01）mmol/g]＞代代花[（0.42±0.03）mmol/g]，与对DPPH自由基清除能力的IC50值保持一致。
注：*表示在P＜0.05水平上差异显著。
指标总黄酮含量总酚含量DPPH自由基清除能力0.977*0.526ABTS+自由基清除能力0.8740.473总抗氧化能力0.968*0.651
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InvitroComparationonAntioxidantActivitiesofExtractsfromFourPlantSpecies
XUShao-tang1，YANGYi-xi1，2*，WANGYi-jin1，GUOYu-tao1，LIUYa-ning1，ZHANGJia-min2，QINXiao-ying3，ZHANGJue1（1.CollegeofFoodandBiologicalEngineering，ChengduUniversity，Chengdu610106，Sichuan，China；2.KeyLaboratoryofMeatProcessinginSichuanProvince，ChengduUniversity，Chengdu610106，Sichuan，China；3.SichuanLiangyuanFoodLimitedCompany，Bazhong636000，Sichuan，China）
Keywords：antioxidativeactivity；PenthorumchinensePursh；DiaphragmajuglandisFructus；ArtemisiaannuaL.；CitrusaurantiumL.；totalflavonoids；totalphenol
DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2022.24.010
基金项目：西藏自治区科技计划项目重点研发计划（XZ202201ZY0031G）；四川省科技厅“三区”人才项目；成都市科技局技术创新研发项目（2021-YF05-00358-SN）；川菜发展研究中心规划项目（CC21Z03）；四川省肉类加工重点实验室开放基金项目（16R-10）
作者简介：徐韶棠（1995—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物。
*通信作者：杨轶浠（1984—），女（汉），副研究员，硕士，研究方向：天然产物、食品化学。
引文格式：
徐韶棠，杨轶浠，王艺瑾，等.4种植物提取物的体外抗氧化活性比较[J].食品研究与开发，2022，43（24）：66-72.
XUShaotang，YANGYixi，WANGYijin，etal.InvitroComparationonAntioxidantActivitiesofExtractsfromFourPlantSpecies[J].FoodResearchandDevelopment，2022，43（24）：66-72.