吴芳丽,王月,尚跃勇,严桂珍,孔辉,胡梦红,吕为群,王有基
(上海海洋大学水产与生命学院,上海201306)
摘要：水生无脊椎动物的血淋巴细胞是机体免疫防御屏障的重要组成部分,但对不同水生无脊椎动物的血淋巴细胞分类和功能的研究整体上比对脊椎动物的研究落后。本研究中系统地归纳和综述了贝类、甲壳类、棘皮动物等水生无脊椎动物血淋巴细胞的分类及其免疫功能的研究进展,贝类血淋巴细胞的分类主要以染色后细胞质中颗粒物质的有无作为指标,一般分为颗粒细胞(granulocyte)和透明细胞(hyalinocyte),其防御机制主要通过包囊作用、伤口修复、吞噬作用等方面体现;甲壳动物血淋巴细胞的分类主要依据血淋巴细胞的形态特征和胞质中颗粒物质的有无、大小和密度等特征,一般将其分为无颗粒细胞(hyalinecell)、小颗粒细胞(semi-granularcell)和大颗粒细胞(granularcell),透明细胞和小颗粒细胞共同介导吞噬作用,小颗粒细胞还介导包囊作用,大颗粒细胞主要介导细胞毒作用;棘皮动物的细胞免疫主要由体腔细胞即变形吞噬细胞或颗粒细胞完成。建议未来应使用多种方法和技术以及结合血淋巴细胞表面受体对水生无脊椎动物血淋巴细胞进行分类和功能研究。
关键词：水生无脊椎动物;甲壳类;贝类;血淋巴细胞;免疫
1.1贝类血淋巴细胞的分类
近年来,对贝类血淋巴细胞的分类已进行了大量研究,但由于其分类方法因人而异,特别是不同种贝类的血淋巴细胞在形态上存在较大差异,迄今为止仍无严格统一的标准[7]。分类方法上多采用显微镜和电镜观察并结合细胞染色技术,对各类细胞在形态大小和嗜酸碱性上进行分类,或借助流式细胞术对大小和粒度存在差异的血淋巴细胞进行分类[8]。基于以上常见分类法,研究者综合应用一些技术和方法对血淋巴细胞的分类提出了新见解,为贝类血淋巴细胞的分类研究开启了新的局面。目前,已有的分类方法包括单克隆抗体技术、流式细胞术、密度梯度离心法、免疫探针技术、植物凝集素标记法、酶细胞化学技术等。
1.1.1基于化学染色的分类通过细胞化学染色方法,Bayne等[9]将加州贻贝Mytiluscalifornianus的血淋巴细胞分为大嗜碱性透明细胞、小嗜碱性透明细胞和嗜酸性颗粒细胞3个细胞亚群。一般来说,嗜酸性颗粒细胞具有吞噬能力,而嗜碱性透明细胞无吞噬能力;Xing等[10]将栉孔扇贝Chlamysfarreri的血淋巴细胞分为颗粒细胞和透明细胞;根据血淋巴细胞对染色反应和超微结构的不同,Moore等[11]将紫贻贝Mytilusedulis血淋巴细胞分为有颗粒的嗜酸性细胞和无颗粒的嗜碱性细胞(可细分为吞噬性巨噬细胞和小淋巴细胞)2个亚群,且分析认为嗜碱性无颗粒细胞也具有吞噬能力,这与Bayne等[9]的观点不一致。通过细胞化学染色方法对海湾贝类血淋巴细胞分类可以发现,一般海湾贝类血淋巴细胞可分为透明细胞和颗粒细胞两大类,但对于嗜酸性颗粒细胞和嗜碱性无颗粒细胞是否均具有吞噬能力尚不能确定,现阶段大部分学者认为颗粒细胞具有较强的吞噬能力。
1.1.4基于单克隆抗体技术的分类利用单克隆抗体技术,Nol等[28]研究认为,贻贝血淋巴细胞的亚群至少可以区分出3种不同类型;Dyrynda等[29]将紫贻贝血淋巴细胞分为嗜酸性颗粒细胞、嗜碱性粒细胞和透明细胞3种类型;Carballal[30]将地中海贻贝Mytilusgalloprovincialis血淋巴细胞分为小颗粒细胞、大颗粒细胞和透明细胞3种类型;利用单克隆抗体技术结合流式细胞术,Renault等[31]将欧洲扁牡蛎血淋巴细胞也分为颗粒细胞、大透明细胞和小透明细胞3种类型,这与Xue等[22]利用流式细胞术对欧洲扁牡蛎血淋巴细胞的分类结果完全一致。基于单克隆抗体技术对海湾贝类分类的研究成果可以发现,分类结果与前两种并无很大的差别,单克隆抗体具有特异性高、抗原专一性等特点,鉴定分类敏感可靠,并且对于细胞膜表面结构具有深度识别作用。
1.1.5基于其他方法的分类通过密度梯度离心法,Xue等[27]将欧洲扁牡蛎血淋巴细胞分为小透明细胞、大透明细胞和颗粒细胞3种类型。利用酶细胞化学技术,并结合光镜和电镜技术,Russell-Pinto等[32]也将欧洲鸟尾蛤科的一种贝类Cerastodermaedule的血淋巴细胞分为3种类型:第一类,体积较大且具伸展性,表面褶皱,细胞核偏离中心,细胞质内含有细胞器,对酸性磷酸酶和酯酶呈阳性的Ⅰ型细胞;第二类,呈球形、表面光滑、细胞核位于中心,细胞质内少有细胞器,对酸性磷酸酶和酯酶呈阴性的Ⅱ型细胞;第三类,呈圆形,细胞核较小且偏离中心,胞质中含有充满颗粒性物质囊泡的Ⅲ型细胞。
综上所述,在贝类血淋巴细胞分类中,以染色后细胞质中颗粒物质的有无作为主要的分类指标,贝类血淋巴细胞可分为颗粒细胞(granulocyte,含有颗粒物质,即含大量颗粒或少量颗粒)和透明细胞(hyalinocyte,不含颗粒物质或所含颗粒物质极少),这2种主要的细胞类型得到广泛认可。然而,在贝类血淋巴细胞的类型中也有特例出现,如扇贝的血淋巴细胞类型中就缺少颗粒细胞[33],故并不是所有的贝类血淋巴细胞均可分为颗粒细胞和透明细胞两类。Hine[33]认为,将双壳类血淋巴细胞简单划分为颗粒细胞和无颗粒细胞限制了人们对血淋巴细胞功能的认识,笔者认为,对每种贝类血淋巴细胞的分类应该单独对待,不设统一标准。透明细胞在几个贝类种中也无明确定义,有的称之为无颗粒细胞,且同一血淋巴细胞的功能不能简单推广到其他种。在不同种贝类的血淋巴细胞分类中,由于不能保证所研究的细胞系处于相同的发育阶段,可能出现用形态学手段不能相对准确区分的现象,因此,贝类血淋巴细胞的分类不应仅局限于上述两类细胞,在其研究中综合运用多种方法和技术很有必要。另外,在血淋巴细胞分类分析过程中,应进一步对各种生理、环境影响因素进行单一变量分析,以增加分类依据的严谨性。
1.2贝类血淋巴细胞的免疫功能
贝类由于其滤食的特性,体内容易积累大量的细菌和异物,易成为一些病原体的载体,而贝类缺乏特异性免疫功能,主要靠先天性的细胞免疫和体液免疫来进行免疫防御[34]。参与贝类细胞免疫的细胞为血淋巴细胞[35],它们是贝类免疫系统的“骨干”[36],是贝类体内抵御外来病原微生物侵袭的主要“屏障”[37]。贝类血淋巴细胞的防御机制主要通过包囊作用、伤口修复、吞噬作用等方面体现[38-40]。细胞凋亡也是贝类血淋巴细胞防御机制中的一个重要作用,可防止一些病原体的传播,减弱炎症反应对周围组织的伤害[41]。有研究发现,贝类对环境压力做出反应的能力在很大程度上取决于其体内的细胞免疫功能[42],且一些环境因素,如温度[43]、盐度、营养物质和有毒物质[44]可直接影响贝类血淋巴细胞的免疫功能[45],其中,农药等污染物可以对贝类组织及细胞产生直接或间接的毒害作用,并能诱导其免疫系统改变[46]。另外,气候变化导致的海水酸化(pH降低)和温度升高也会对贝类血淋巴细胞的防御机制产生影响[23,47]。
1.2.3伤口修复作用伤口修复是贝类血淋巴细胞的另一重要作用。因为贝类没有血管、血小板和体液凝固因子,其循环系统为开放式循环系统,所以有别于脊椎动物的凝血修复系统。贝类的伤口修复是血淋巴细胞在受伤组织处大量聚集,形成血栓,由其产生的胞外基质逐渐替代受伤组织,再由血淋巴细胞发挥吞噬作用,将坏死组织清除,最后慢慢生长出新的组织的过程[54]。
2.1甲壳类血淋巴细胞的分类
自1885年Halliburton[57]对甲壳动物血淋巴细胞的研究开始,国内外学者对其分类及免疫特性的研究逐渐增多,但受染色技术、仪器等条件所限,进展较为缓慢。
2.1.1基于化学染色的分类根据螯龙虾Homarusanericanus血淋巴细胞的染色特性、核质比和细胞质所含颗粒物质的折光特性及形态特征,Cornick等[58]将其血淋巴细胞分为4种类型:细胞质中含有数目可变的小颗粒物质的嗜伊红颗粒细胞、个体最小的前透明细胞、细胞质内充满较大颗粒物质的嫌色细胞和含有少量颗粒物质的透明细胞。
利用吉姆萨染色和光镜,Sawyer等[59]根据蓝蟹Callinectessapidus血淋巴细胞的形态特征、颗粒物质的有无及大小将其血淋巴细胞分为4种类型:细胞体积最大、细胞内含有的颗粒物质最多且颗粒较大的粗颗粒细胞;细胞质中含有一些细颗粒物质的细颗粒细胞;细胞质中含有少量颗粒物质且呈透明状的细颗粒透明细胞;细胞体积最小且细胞质中没有颗粒物质并呈透明状的无颗粒透明细胞。
2.1.2基于透射电镜技术的分类利用透射电镜技术,Bodammer[60]根据蓝蟹血淋巴细胞的形态特征和细胞质中颗粒物质的数量及大小将其分为3种类型:含有大量的颗粒物质且颗粒体积较大的颗粒细胞;不含或含有少量颗粒物质且颗粒体积较小的透明细胞;含有的颗粒物质数量适中且颗粒体积较小的半颗粒细胞。这与Parrinello等[61]利用电镜和光镜相结合的技术对北黄道蟹Cancerborealis和黄道蟹Cancerpagurus两种食用蟹的分类研究一致[61]。
2.1.3基于密度梯度离心法的分类利用密度梯度离心法,李光友等[62]和Martin等[63]根据血淋巴细胞的形态特征及免疫功能,将中国对虾Penaeuschinensis和两种单肢虾(Penaeuscaliforniensis、Si-cyoniaingentis)的血淋巴细胞分为3种类型:细胞质内含有大颗粒物质的大颗粒细胞;细胞质内含有小颗粒物质且敏感易脱颗粒,并被认为是免疫防御反应关键的小颗粒细胞;细胞质内几乎不含颗粒物质且具有吞噬能力,但缺乏酚氧化酶活性的透明细胞。
2.1.4基于其他方法的分类利用光镜、梯度离心、细胞化学染色与透射电镜相结合的技术,叶燕玲等[64]根据血淋巴细胞及胞质内颗粒的特征,将中国对虾的血淋巴细胞分为颗粒细胞、小颗粒细胞和透明细胞3种类型,其细胞质内颗粒含量、体积和细胞大小依次递减。根据分类标准及对血淋巴细胞的具体描述可知,颗粒细胞即为李光友等[62]和Martin等[63]所定义的大颗粒细胞,无颗粒细胞即透明细胞;在大、小颗粒细胞上出现微管束,大颗粒细胞仅含电子致密大颗粒,透明细胞有一些亚显微结构并含变化颗粒(如匀质颗粒、条纹颗粒等),而小颗粒细胞则两者均有。其中,条纹颗粒的条纹由微管组成,Hearing等[65]认为,条纹颗粒的出现与凝血有关。
目前,十足目甲壳动物血淋巴细胞的命名与分类逐渐有了标准,其分类主要依据血淋巴细胞的形态特征和胞质中颗粒物质的有无、大小和密度等特征,一般将其血淋巴细胞分为3种类型:细胞质内含有大量且体积较大颗粒的颗粒细胞或大颗粒细胞(granularcell,GC);细胞质内含有数量适中且体积较小颗粒的小颗粒细胞(semi-granularcell,SGC);细胞质内几乎没有或含有微量且体积较小颗粒的透明细胞或无颗粒细胞(hyalinecell,HC)。
2.2甲壳类血淋巴细胞的免疫功能
在甲壳类动物的非特异免疫防御中,血淋巴细胞随着血液循环分布到身体各处并发挥着重要作用,其对外来异物和病原的清除主要通过吞噬、凝集、包囊、结节形成、胞吐、修复、合成与释放免疫因子及一些物理屏障等途径来实现,其免疫系统缺乏免疫球蛋白,属先天免疫系统[66]。甲壳动物的血淋巴细胞既是细胞免疫的主要承担者[67],又可为体液免疫提供相应的免疫因子[68]。目前,大量对虾蟹类甲壳动物的血淋巴细胞的研究表明,其血淋巴细胞主要可分为3类:透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞,且不同类型的血淋巴细胞在其免疫系统中所起的作用不同[55,63,68-71]。透明细胞和小颗粒细胞共同介导吞噬作用,小颗粒细胞还介导包囊作用,大颗粒细胞主要介导细胞毒作用[68]。甲壳动物血淋巴细胞最重要的免疫防御机能是由透明细胞和小颗粒细胞介导的吞噬作用,具体包括异物的识别、黏连、聚集、摄入、清除等吞噬过程。
2.2.2胞吐作用Sderhll等[72]认为,在机体的免疫防御过程中透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞间具有协同作用。大颗粒细胞和小颗粒细胞均可在异物刺激下引发胞吐、脱颗粒,释放活化的酚氧化酶,促进无颗粒细胞的吞噬能力,从而在机体的免疫反应中发挥作用。因小颗粒细胞具有活跃的识别异物的能力,当细菌或病毒等异物感染机体时,小颗粒细胞可对异物进行快速识别,并与异物表面异己信号物质相互作用使其快速发挥胞吐作用,与βG(β-1,3-glucan,β-1,3葡聚糖)或微生物多糖(脂多糖)结合进行脱颗粒,所产生的活化的酚氧化酶不仅可以促使小颗粒细胞和大颗粒细胞进行脱颗粒,还可以增强透明细胞的吞噬能力,从而使机体的免疫防御机制产生重要作用。
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Currentprogressofresearchonclassificationandimmunityofhemocytesinaquaticinvertebrates:areview
WUFang-li,WANGYue,SHANGYue-yong,YANGui-zhen,KONGHui,HUMeng-hong,LüWei-qun,WANGYou-ji(CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)
Keywords：aquaticinvertebrate;crustacean;mollusc;hemocyte;immunity
中图分类号：Q25
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.019
收稿日期：2016-04-01
基金项目：国家自然科学基金资助项目(31302207);上海市自然科学基金资助项目(13ZR1455700)
作者简介：吴芳丽(1993—),女,硕士研究生。E-mail:1033543663@qq.com
通信作者：吕为群(1967—),男,博士,教授。E-mail:wqlv@shou.edu.cn
王有基(1981—),男,博士,副教授。E-mail:yj_wang@shou.edu.cn