菜籽粕（rapeseedmeal,RSM）：购自御康农业科技有限公司。发酵菜籽粕（fermentedrapeseedmeal,FRSM）：将RSM与麦麸按7:3的比例混合，然后接种10％的微生物混合菌液，菌液活菌数≥1×10９CFU·mL-1，蔗糖1％，料水比1:1.2。将上述物质混合均匀后，装至发酵桶密封，厌氧发酵72h以上，当可以明显嗅到酸香味即发酵结束。菌种：短乳杆菌和短小芽孢杆菌均为本实验室保藏菌种，菌种比例为1:2。取发酵菜籽粕于65℃烘箱内烘干，制备发酵菜籽粕风干样品，用于营养成分检测和代谢试验发酵菜籽粕组饲粮配制。
（2）试验设计与饲粮
采用单因子试验设计，用顶替法测定消化率。选择16头体重（71.25±1.23）kg的健康“杜×长×大”去势公猪，随机分成4组，每组4个重复，每重复1头。Ⅰ组：基础饲粮，Ⅱ组：RSM饲粮，Ⅲ组：FRSM饲粮，Ⅳ组：无氮饲粮。饲粮参照NRC（2012）生长育肥猪营养需要配制。基础饲粮是玉米-豆粕型饲粮，两种替代饲粮分别用RSM和FRSM等氮替代35％基础饲粮中的氮，无氮饲粮主要由玉米淀粉配制。试验饲粮组成及营养水平见表1。
（3）饲养管理
代谢试验在重庆市畜牧科学院双河实验基地进行，所有试验猪采用代谢笼单独饲养，预试期3d，正试期4d。粉料饲喂，每天饲喂3次（09：00、13：00、17：00），自由饮水，并观察动物的采食和健康状况。每头猪试验期的日采食量为预试期的平均日采食量。
（4）样品采集与处理
①饲料样品采集于发酵第1天（即发酵菜籽粕混合物制作完成时）和发酵第5天分别取发酵菜籽粕混合样，用于测定发酵前后pH、营养和抗营养物质含量；采集代谢试验用RSM、FRSM及4组试验饲料样各300g左右，于4℃保存待测营养成分。
②粪、尿样采集正式试验期间，采用全收粪尿法，随排随收，每天08:00计算前1天的粪样和尿样。粪样按照重量的5％加入10％硫酸，尿样按照体积的2％加入10％硫酸，将混匀的粪样和尿样置于-20℃冰箱保存。试验结束时，将每头猪4d的尿样混匀，置于-20℃冰箱保存，待测。每头猪的4d粪样混合均匀后，按Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组取样50％，Ⅳ组全取，于65℃烘干，制备风干样，待测。
（5）测定指标及计算方法
①测定指标及方法干物质（drymatter,DM）：参照GB/T6435-2014采用DHG-9246A鼓风干燥箱测定；
粗蛋白质（crudeprotein,CP）：参照GB/T6432-1994采用FOSS2300自动凯氏定氮仪测定；
水溶性蛋白质（watersolubleprotein,WSP）：称取2g（精确至0.001g）样品置于150mL三角瓶中，用移液管加入25mL的pH为6.75±0.05的四硼酸钠－磷酸二氢钠缓冲液（缓冲液于39℃水浴锅中预热），在39℃下震荡水浴1h，用快速滤纸过滤，用移液管取5mL滤液置凯式管中，然后参照GB/T6432-1994采用FOSS2300自动凯氏定氮仪测定；
酸溶性蛋白质（acidsolubleprotein,ASP）：准确称取样品1g（精确至0.001ｇ），加入体积分数为15％的三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容至50mL，静置5min后过滤；吸取10.00-25.00mL滤液，然后参照GB/T6432-1994采用FOSS2300自动凯氏定氮仪测定；
异硫氰酸酯（isothiocyanate,ITC）和噁唑烷硫酮（Oxazolidinone,OZT）参考文献［15］中的紫外法进行检测；
粗灰分（crudeash,Ash）：参照GB/T6438-2007测定；
钙（calcium,Ca）：参照GB/T6436-2002测定；
磷（phosphorus,P）：参照GB/T6437-2002采用TU-1901紫外分光光度计测定；
能量（energy）：参照GB/T213-2008采用6400氧弹量热仪测定；
氨基酸（aminoacid,AA）：参照GB/T18246-2000采用L-8900氨基酸自动分析仪测定。
②待测营养物质消化率计算公式饲粮营养物质消化率参照全收粪法计算，公式：
营养物质表观消化率（％）＝［（食入营养物质-粪中营养物质）/食入营养物质］×100；
无氮饲粮用于估测内源氮和内源氨基酸损失，计算公式：
氮真消化率（％）＝｛［食入氮-（粪氮-内源粪氮）］/食入氮｝×100；
氮表观利用率（％）＝［（食入氮-粪氮-尿氮）/食入氮］×100；
氮真利用率（％）＝｛［食入氮-（粪氮-内源粪氮）-（尿氮-内源尿氮）］/食入氮｝×100；
氨基酸真消化率（％）＝｛［食入氨基酸-（粪中氨基酸-内源氨基酸）］/食入氨基酸｝×100；
菜籽粕和发酵菜籽粕营养物质消化率通过下面公式计算：
D＝［100×（A-B）/F］＋B；F＝C1×f/［C1×f＋CO×（1-f）］
式中：D为待测饲料中某营养物质的消化率（％）；A为试验饲粮中某营养物质的消化率（％）；B为基础饲粮中某营养物质的消化率（％）；F为试验饲粮营养物质中待测原料营养物质所占的比例（％）；f为试验饲粮中掺入待测原料的比例；CO为基础饲粮中某营养物质的含量；C1为待测原料中某营养物质的含量。
（6）数据统计与分析
采用SPSS22.0软件对试验数据进行统计分析，用LSD法进行差异显著性比较。分析结果用“平均值±标准误”表示。
2结果
（1）发酵菜籽粕混合物发酵前后营养物质和主要抗营养因子含量比较
麦麸通常用作固态发酵培养基，一方面为微生物提供碳氮源，另一方面使培养基质地疏松，同时可以吸附住培养基中水分，有利于微生物的生长。本研究按照实验室所筛选的发酵菌种和发酵工艺，将RSM与麦麸按7:3的比例混合制作发酵菜籽粕混合物，并比较其发酵前后营养和抗营养物质含量。由表2可知，与发酵前相比，发酵菜籽粕混合物pH由5.60降至3.92，营养物质粗蛋白质、水溶性蛋白质、酸溶性蛋白质和粗脂肪的含量分别提高了1.91％、52.88％、44.40％和24.27％，17种氨基酸含量均有所提高。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别降低了5.21％和0.38％；异硫氰酸酯的降解率达到92.20％，噁唑烷硫酮的降解率达到100.00％；单宁和植酸分别降低了35.81％和24.22％。
（2）菜籽粕和发酵菜籽粕的养分消化率
由表3可知，FRSM干物质的表观消化率较RSM提高10.32％（P＜0.05）；FRSM的消化能较RSM高2.16MJ·kg-1（P＜0.01）；FRSM的氮表观（真）消化率和氮表观（真）利用率极显著高于RSM（P＜0.01），分别高17.02％（16.40%）和29.43％（27.64％）；FRSM与RSM钙、磷和粗灰分的表观消化率差异不显著（P＞0.05）。
（3）菜籽粕和发酵菜籽粕氨基酸的表观（真）消化率
由表4可知，发酵菜籽粕氨基酸的表观（真）消化率均高于菜籽粕，其中两者半胱氨酸的表观消化率（真）差异不显著（P＞0.05），FRSM组氨酸和精氨酸的表观（真）消化率显著（P＜0.05）高于RSM，其他氨基酸的表观（真）消化率均极显著（P＜0.01）高于RSM；FRSM必需氨基酸中Val、Met、Ile、Leu、Thr、Phe、Lys、His、Arg的表观（真）消化率分别比RSM高17.72％（16.79％）、26.05％（24.27％）、27.23％（21.71％）、14.68％（17.80％）、63.59％（58.13％）、14.15％（13.26％）、73.29％（65.66％）、4.61％（4.47％）、4.87％（4.33％）；FRSM的非必需氨基酸Pro、Cys、Ser、Tyr、Glu、Gly、Ala、Asp的表观（真）消化率分别比RSM高11.08％（11.21％）、2.97％（1.97％）、14.02％（11.88％）、16.48％（15.12％）、10.76％（8.19％）、16.60％（16.12％）、37.69％（31.25％）、33.90％（25.80％）。
3讨论
（1）发酵菜籽粕混合物发酵前后营养物质和主要抗营养因子含量的变化
（2）菜籽粕和发酵菜籽粕的常规养分消化率
4结论
本研究通过双菌固态发酵降低了菜籽粕抗营养因子的含量，改善了菜籽粕的饲用品质，提高了菜籽粕在育肥猪上的养分消化率和利用率。