靳盼盼刘亚文邵美丽刘芳孙芝兰吴海虹许晓曦
（1东北农业大学食品学院哈尔滨1500302江苏省农业科学院农产品加工研究所南京210014）
粪肠球菌R612-Z1，本实验室从盐水鸭中分离并保存。香芹酚（纯度＞99%），湖北鑫润德化工有限公司；脑心浸液（BrainHeartInfusion）培养基，北京陆桥；24孔细胞培养板，美国康宁；总RNA提取试剂盒，北京天根；反转录试剂盒，大连宝生物；NuncTMLab-TekTM8孔腔室盖玻片、LIVE/DEADBacLightTM细胞活性测定试剂盒，美国赛默飞。
扫描电子显微镜，德国蔡司；PE激光共聚焦显微镜，美国铂金埃尔默；实时荧光定量PCR仪，美国罗氏；5810高速离心机、核酸蛋白测定仪，德国艾本德；恒温振荡培养箱，中国知楚。
1.3.1菌种培养将粪肠球菌R612-Z1接种于无菌脑心浸液肉汤培养基（BHI）中，培养至对数期时，接种环蘸取少量菌液在BHI固体培养基上划线分离纯化，37℃过夜培养后，挑取单一菌落到含有5mLBHI液体培养基的试管中振荡过夜，制备冻存菌液（40%甘油），存放在-40℃冰箱中备用。每次试验前，冻存甘油菌按照1%比例接种到对应培养基，过夜活化。细菌培养条件为37℃，200r/min。
1.3.2香芹酚对粪肠球菌的最小抑菌浓度（MIC）的测定按照二倍稀释法测定香芹酚对粪肠球菌R612-Z1的最小抑菌浓度，将活化好的菌液1%接种到5mL新鲜BHI培养基并加入香芹酚，菌液和香芹酚按比例混合，使其香芹酚最终的质量浓度为1024，512，256，128，64，32，16，8μg/mL，对照组为未加入香芹酚的菌液。37℃，200r/min振荡培养24h。首先肉眼观察浑浊度，香芹酚的质量浓度小，试管内澄清的质量浓度可推测为最小抑菌浓度，每个梯度的试管中取200μL液体到96孔板中，于600nm波长处测定吸光度，以无菌生长的最低香芹酚浓度为MIC。
1.3.3香芹酚对粪肠球菌R612-Z1生长的影响按1.3.2方法制备含各梯度香芹酚的菌液后，于37℃静置培养24h，每隔2h振荡均匀后，在96孔板中依次加入200μL各梯度菌液混合物，于600nm波长处测定吸光度，绘制细菌生长曲线，分析不同浓度的香芹酚对菌株生长的影响。
1.3.4香芹酚对粪肠球菌R612-Z1泳动能力的影响采用软琼脂平板法[16-18]测定香芹酚对其泳动能力（swimming和swarming）的影响，首先准备swimming培养基（10%胰蛋白胨、5%氯化钠、2.5%葡萄糖和0.3%琼脂）；swarming培养基（10%胰蛋白胨、5%氯化钠、10%酵母膏、0.5%葡萄糖和0.5%琼脂）。高温蒸汽灭菌并冷却至适宜温度后加入香芹酚，使其最终浓度为1/4MIC、1/8MIC，对照组为未加入香芹酚的软琼脂平板。取过夜活化后的菌液按照1%接种到BHI培养基，将培养至对数期的菌液离心，12000r/min，5min，移除上清液，将菌泥用0.1mol/LPBS缓冲液（pH=7.4）洗涤3次后，紫外分光光度计于600nm波长处调节吸光度为0.8～1.0，转移3μL菌悬液滴加到软琼脂平板的中心，将swimming软琼脂平板和swarming软琼脂平板分别静置于37℃恒温培养箱培养8h和20h后，测定并记录细菌在两种平板上的扩散直径。
1.3.5香芹酚对粪肠球菌生物膜形成的影响
2）生物膜胞外多糖的含量测定按1.3.2节的方法制备含有不同梯度香芹酚的菌液，对照组为不加香芹酚的菌液，每孔1mL菌液，培养生长至12，24，48，72h的生物膜，移除上层培养基并洗涤后每孔加入1mL无菌PBS溶液，冲洗细胞培养孔，收集孔内悬浊液，5000×g，4℃离心20min，收集菌泥，将菌泥重悬于含有0.22%甲醛的0.85%NaCl水溶液中，先将菌悬液置于80℃水浴锅加热30min，放入低温离心机15000×g，4℃离心30min，离心收集上清[20]。使用苯酚-硫酸法测定生物膜胞外多糖的含量[21]。
1.3.6香芹酚对粪肠球菌生物膜微观状态的影响
1）扫描电镜（SEM）观察SEM可以观察到生物膜内菌体聚集状态，从而探究生物膜的成熟程度不同对膜内细菌状态的影响。按上述1.3.2节的方法配制含有不同梯度香芹酚的菌液，对照组为不加香芹酚的菌液。在NuncTMLab-TekTM8孔腔室载玻片培养板中每孔加入400μL菌液，在试验进行期间每24h更换上层培养基以确保细菌生长条件，分别在生物膜培养至12，24，48，72h取样。样品具体处理参见1.3.5节，无菌PBS溶液洗涤并晾干后，去掉上层隔板，按照样品分区切割载玻片，放入4℃冰箱中使用2.5%戊二醛溶液固定12h，室温自然晾干后使用1%锇酸溶液固定90min，然后依次用体积分数为30%，50%，80%，90%，100%的乙醇梯度脱水10min[21]，最后使用100%叔丁醇洗涤完毕。玻片用于SEM观察前喷金处理，图片放大倍数为5000倍[22]。
2）激光共聚焦显微镜（CLSM）观察CLSM可以观察到生物膜在成熟期间的厚度变化。按
1.3.2节的方法制备含有不同梯度香芹酚的菌液，对照组为不加香芹酚的菌液。在NuncTMLab-TekTM8孔腔室培养板中每孔加入400μL菌液，在试验进行期间每24h更换上层培养基以确保细菌生长条件，分别在生物膜培养至12，24，48，72h取样。样品具体处理参见1.3.5节，无菌PBS溶液洗涤2次并室温晾干后，参考LIVE/DEADBacLightTM细胞活性测定试剂盒说明书对生物膜进行染色处理。处理后的样品可以在-20℃避光保存[22-23]。使用CLSM观察生物膜的厚度，根据试剂盒中配制的荧光染料探针SYTO-9和PI，设置观察参数，其中SYTO-9和PI的激发波长为485，535nm；发射波长为498，637nm，使用60倍油镜观察视野下的生物膜状态。
表1荧光定量PCR引物序列Table1Primersequenceforreal-timePCR
本试验过程中涉及的试验重复3次，平行2次。使用SPSS17.0处理试验数据并采用ANOVA进行DunettT3差异分析，以平均值和标准差表示，P＜0.05为差异显著。
根据对粪肠球菌R612-Z1生长情况的肉眼观察，以及测定的培养物的OD600值，确定香芹酚对粪肠球菌R612-Z1的最小抑菌质量浓度为512μg/mL。
由图1可知，粪肠球菌R612-Z1在香芹酚处理质量浓度为512μg/mL时，细菌生长被抑制，而当处理质量浓度为256μg/mL时，细菌前12h的生长过程被抑制，12h后与对照组基本重合；128μg/mL香芹酚处理时，4h前生长速度略低于对照组，之后与对照组生长曲线重合，最大生长量相同；64μg/mL香芹酚处理和对照组的生长曲线重合，因此接下来的试验中主要采用质量浓度为128μg/mL以及64μg/mL的香芹酚处理，探究其
对生物膜的抑制影响。
图1不同香芹酚浓度下粪肠球菌R612-Z1生长曲线Fig.1GrowthinhibitionofE.faecalisR612-Z1cellsincarvacrolsolutionsatdifferentconcentrations
细菌生物膜形成初期主要依靠鞭毛的泳动能力，使得菌体移动到附着材料表面，然后在菌毛的作用下粘附固着，形成生物膜[25-26]。菌体的泳动能力分为两种，swarming代表一种群体菌体运动行为，swimming代表一种单一菌体运动行为。如图2所示，当香芹酚的处理质量浓度分别为128μg/mL和64μg/mL时，对细菌的泳动能力（swimming）和丛动能力（swarming）有明显的抑制作用（P＜0.05），而不同处理浓度之间无显著差异（P＞0.05）。由于鞭毛所参与的泳动对生物膜的早期形成起关键作用，此结果表明香芹酚可能会通过影响生物膜早期形成时菌体的初期粘附能力来抑制生物膜的形成。
图2香芹酚对粪肠球菌R612-Z1泳动能力的抑制作用Fig.2InhibitionofsurgecapacityofE.faecalisR612-Z1bycarvacrol
图3香芹酚对粪肠球菌R612-Z1生物膜内菌数的影响Fig.3EffectofcarvacrolonthebacterialcountsinEnterococcusfaecalisR612-Z1biofilm
图4香芹酚对粪肠球菌R612-Z1生物膜胞外多糖合成的影响Fig.4EffectofcarvacrolonextracellularpolysaccharideproductionofE.faecalisR612-Z1biofilm
2.5.1SEM观察生物膜内菌体聚集后的微观状态
图5香芹酚对粪肠球菌R612-Z1生物膜菌体聚集状态的影响（5000×）Fig.5EffectofcaracoloncellaggregationinE.faecalisR612-Z1biofilm（5000×）
图6香芹酚对粪肠球菌R612-Z1生物膜成膜厚度的影响Fig.6EffectofcarvacrolonthethicknessofEnterococcusR612-Z1biofilm