本试验以Lm野生菌株EGDe及其毒力突变株(EGDeΔprfA、EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)为对象，利用超滤浓缩法和Optiprep密度梯度离心法提取Lm的MVs，并对2种方法提取的MVs的产率进行比较。另外，通过测定不同MVs对菌株生物被膜的影响，以及不同MVs的溶血活性和对棉铃虫的感染毒性探索其生物活性，以期为深入解析革兰氏阳性菌MVs的生理功能奠定基础，同时也为Lm致病机制的研究提供一些新的思路。
磷酸缓冲液，武汉飞扬生物科技有限公司；Optiprep密度梯度离心液，Sigma-Aldrich公司；BCA试剂盒，碧云天生物技术有限公司；2%的磷钨酸(PTA)染液，中国科学院武汉生物病毒研究所。
落地式高速离心机和制备超速离心机，BeckmanCoulter公司；多功能酶标仪，BioTek公司；100千伏透射电子显微镜，HITACHI公司；倒置显微镜，重庆光电仪器有限公司。
DMEM高糖培养基，HyClone公司；BHI培养基(BHI37.0g/L)，B&D公司。
将-80℃冻存的菌株接种于固体BHI培养基，置于37℃培养18h进行活化。挑取单菌落于5mL液体BHI培养基中，37℃、200r/min培养过夜。次日，按1:100的比例转移至1L新鲜液体BHI培养基中继续培养至OD600为1.0。
当细菌培养至OD600为1.0时，4℃、6000r/min离心20min收集上清液，经0.45μm或0.22μm滤器过滤，除去细胞碎片等杂质后转移至截留相对分子质量100kD的超滤浓缩管中，4℃、4000r/min离心20min。取浓缩液，经4℃、31174r/min离心3h后弃上清，用10mL的磷酸缓冲液悬浮沉淀，重复离心一次后，将沉淀重悬于1mL磷酸缓冲液中，经0.22μm滤器过滤后进行无菌检验，鉴定其无菌后于-80℃保存，即为提取的膜囊泡。将所提取的EGDe、EGDeΔprfA和EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的膜囊泡分别表示为EGDe-MVs、ΔprfA-MVs和prfA*-MVs。
Optiprep梯度离心液用DMEM分别配制成浓度为25%、30%、35%、40%和45%。吸取经过超滤浓缩法(同1.2.2)提取的1mL产物转移至Beckman离心管中，再依次加入2mL的45%、40%、35%、30%和25%Optiprep，于4℃、31174r/min进行超速离心15h。离心完毕后，小心收集30%-35%的组分于Beckman离心管中，并加入10mL磷酸缓冲液，再次进行超速离心。重复离心3次后弃上清，将沉淀重悬于1mL磷酸缓冲液中，经0.22μm的滤器过滤后进行无菌检验，鉴定其无菌后于-80℃保存，即为提取的膜囊泡。
将铜网浸泡在MVs样品中吸附大约20min后取出，用滤纸与铜网垂直接触以除去多余液体。随后将铜网浸泡在PTA染液中染色5min，取出后于阴凉处自然干燥2-3d，即可用于电镜观察。