在临床诊疗对血液检查更准、更快、更便捷、满足不同使用场景等需求的推动和国家医院高质量、均质化发展、控费降本和自主知识产权等政策的引导下，伴随科学技术的发展尤其是电子科技、激光光源和生物化学技术等进步的背景下，生命医学领域检测设备迎来了发展良机。
FOCUSONIVDCHINA
血细胞计数的自动化进程始于库尔特原理（CoulterPrinciple）的提出和基于该原理的血细胞计数仪的发明[1]。经过70余年的发展，血细胞分析仪检测性能日臻完善，从最早的单纯血细胞计数到白细胞三分群、五分类，再到网织红细胞（RET）、有核红细胞（NRBC）、幼稚粒细胞（IMG）的全自动检测，实现了对血细胞更精准定量和更精细分类。在样本类型方面，从最早的血液细胞分析到体液细胞分析，再到近年的全血特定蛋白，实现了多种样本类型的多项目联合检测。在检测速度方面，从每小时60测试到90、125直至200测试。血细胞分析仪迈向了计数、分类、检测项目、样本类型和检测速度越来越先进的新时代。全自动血细胞分析流水线应运而生，最初仅能连接血细胞分析仪和推片染色机，发展到能够整合多个模块多功能的流水线。尽管如此，面对更复杂的使用场景、更深入的临床需求、更高水平的质量管理，血细胞分析仪及其流水线仍有很大待提升空间。
本文在总结近年血细胞分析流水线发展的基础上，结合以上需求对未来血细胞分析仪及其流水线的技术发展加以推演和展望。
（作者：李秋晨吴标孙莎李莉）
全自动末梢血血细胞分析流水线
尽管如此，还有一些现实的需求需要解决：实验室面对大量的末梢血标本，如何实现末梢血全自动检测从而提升检测效率？如何保证末梢血检测系统达到与静脉血检测系统同等的质量和复检标准？这些激发了全自动末梢血血细胞分析流水线的技术研发和产品创新。
◤末梢血血细胞分析现状通常末梢血标本的检测流程包括试管编号、采样、混匀、电脑输入待检样本信息和编号、开盖、吸样、检测等，因手工操作步骤多，误差风险高。标本混匀和吸样也是因手工操作，检测结果差异大，难以标准化。尤其检测过程中频繁地混匀、开盖，生物安全风险也不可忽视。
◤全自动末梢全血批量检测打通自动扫码、自动混匀、自动检测、自动复检四个重要环节和最小用血量、最小采血管死腔体积是末梢血全自动批量检测的关键技术。现以迈瑞公司BC-7500系列血细胞分析仪为例介绍其突破瓶颈的创新技术。
01自动扫码识别进样：采用“套管”的方式一步解决采血管“贴条码”和“末梢血采集”两大难题，实现与LIS系统的信息互通。“套管”由内外管合并组成，外管与静脉血采血管大小相似，破解贴条码难题，而内管与现用的末梢血采血管相似，底部尖细，用于采集末梢血。采血后套管置于进样架，放入仪器自动进样器，仪器自动扫描采血管条码识别患者和检测项目信息。通过设置辨识度高的静脉血和末梢血两种自动进样架，仪器通过试管架上的条码辨别标本类型，实现静脉血和末梢血自动切换（图1）。
图1“套管”采血管（左）和两种进样架（右）示图
02末梢血自动混匀：末梢血标本进样后，仪器的夹手会夹起末梢血采血管至混匀器上混匀。该混匀方式采用一系列技术（图2），满足既充分混匀标本又保证细胞完整性的双重要求，在节省人力提升效率的同时实现混匀过程的标准化。
图2末梢血自动混匀关键技术原理示意图
03自动穿刺吸样和检测：混匀后的末梢血采血管被夹手转送至试管架，穿刺针精准定位穿刺吸样，大大降低了生物安全风险。仪器根据采血管的条码信息，可进行血常规、血常规+CRP、血常规+CRP+SAA、血常规+CRP+SAA+RET等多种模式的自动检测。
04末梢血自动复检：试管架上某个标本的检测结果触发复检规则时，仪器在进行下一个测试时会自动回退，对需要复检的标本进行复测。复测包括原检测模式复测和更换检测模式复测。BC-7500系列产品检测血常规时用血量27.5μL，若末梢全血采血量80μL以上时，可以设置末梢血复检规则，对结果异常标本自动复测。
◤末梢血推片染色目前可在迈瑞SC-120全自动推片染色机上进行微量（25μL）血推片染色功能，终结了末梢血手工推片染色时代。虽然末梢血标本全自动批量进样的技术早已成熟，但目前并没有应用在推片染色机上，主要原因在于自动批量进样的标本死腔体积较大。
异常血小板计数的全面自动化解决方案
血小板因体积小，容易被多种颗粒干扰[3]，是血细胞分析中最难计数的细胞成分，也是影响临床满意度的重要因素。目前检测血小板的方法学有电阻抗法（PLT-I）、光学法（PLT-O，包括核酸荧光染色光学法和非核酸荧光染色光学法[4]）、流式细胞术计数法（流式抗体染色）、显微镜计数法（PLT-M）。
血细胞分析仪检测血小板数量的常规方法是电阻抗法，因速度快、操作简便、价格低廉、质控程序完善，适于大批量样本检测，是临床检测首选方法。但由于血小板本身特性影响，检测过程中干扰因素多，如小红细胞、红细胞碎片、冷球蛋白、脂质颗粒、血小板聚集、巨大血小板、畸形血小板等[5]都会导致血小板计数结果误差，长期困扰临床。因此，在检测技术上仪器研制科学家投入大量精力，研发了各种技术以提高检测质量。如光学血小板检测用于电阻抗法的有效补充，非核酸荧光染色光学法提高了大血小板的检测效果，核酸荧光染色光学法则很好地克服了大/小血小板、小红细胞、红细胞碎片、冷球蛋白、脂质颗粒的干扰[6-7]，临床还证实该方法对血小板聚集有一定的解聚作用[8-10]。本节将以迈瑞公司最新的血细胞分析流水线为例，介绍异常血小板计数问题的全面自动化解决方案。
◤低值血小板样本中血小板数量降低时，由于计数颗粒数大幅减少，一方面，导致有效统计量不足，造成低值计数重复性不稳定；另一方面，血小板数量低时样本中异常颗粒比重被成倍放大，导致低值计数结果与真实结果的偏倚显著增加。新的光学法平台，采用核酸荧光染色有效排除其他颗粒成分的干扰；同时采用八倍计数功能增大有效颗粒统计量（图3），从而提高低值血小板计数的准确性和重复性。
图3PLT-O单倍（左）和八倍（右）统计量散点图
◤排除血小板计数检测干扰利用高特异的核酸荧光染料特异性标记血小板内RNA，结合颗粒体积大小，从两个维度将血小板与小红细胞/红细胞碎片、白细胞碎片等不含核酸的计数干扰物明显区分（图4）,大大降低血小板计数干扰。
图4PLT-O排除红细胞碎片（左）和白细胞碎片（右）干扰散点图
◤克服血小板体积差异血小板的平均直径为1.5-3μm，大血小板的直径为4-7μm，巨大血小板的直径＞7μm，一些小血小板的直径甚至＜1μm，如此差距的体积成为影响电阻抗法计数血小板准确度的鸿沟。大血小板在电阻抗通道易被误认为红细胞，新技术利用核酸荧光染料特异性染色血小板，而红细胞无法着色，从而区分大血小板和小红细胞（直径约6μm）。对于小血小板，通过更高敏光路衍射模型，提升信噪比，将光学系统最小颗粒分辨能力提升到0.5fL，显著提高小血小板与仪器噪音的辨识度，避免小血小板漏计数导致的血小板假性降低。
◤聚集血小板“自解聚”EDTA依赖性假性血小板减少（EDTA-Pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP）[11]是体外血小板聚集的常见原因，发生率在0.07%～0.20%。EDTA-PTCP常见处理流程为：仪器触发“血小板聚集”或“血小板降低”报警后，工作人员推片染色、显微镜观察，确认存在血小板聚集，通过联系临床采血后立即检测，或更换抗凝剂（如枸椽酸钠）后检测并对结果进行抗凝剂体积校正，也可采用末梢血草酸铵稀释液预稀释法二次采血，显微镜下计数3次报告均值结果。检验工作者在长期实践中还摸索出一些解决方案，如阿米卡星体外“解聚”[12]、上机检测前对标本预热[13]或者震荡[14]。但这些处理均需要二次采血，操作繁琐、费时，患者依从性差、抱怨多。为解决这一问题，迈瑞公司的6系、7系血细胞分析仪通过在RET通道加温、高速涡旋均散、加解聚剂，提升聚集血小板的解聚效率，且所有操作都在仪器内部进行，并可设定复检规则，遇血小板聚集时自动复检，降低漏报和错报风险（图5）。
图5PLT-O自解聚技术的原理示意图
这种机内的自动血小板“解聚”被称为“自解聚”，已得到多家临床研究的验证[8-10]。引入“解聚率”概念定量“解聚”效果：解聚率=血小板聚集标本PLT-O值/PLT真实值×100%，Bao等[9]对23例血小板聚集样本分析证实，有22例样本的解聚率大于80%，平均解聚率为93%（图6）。对于EDTA-PTCP的标本，PLT-O结果即PLT-O（EDTA抗凝血）显著高于PLT-I（EDTA抗凝血），与患者二次采血的PLT真实值即PLT-I（Citrate抗凝血）接近。
图6PLT-O对EDTA-PTCP标本的自解聚性能验证
◤异常血小板标本全自动形态学检测当标本中存在血小板聚集时，通常会触发血液分析仪的“聚集血小板报警”或“低值PLT”复检规则，由于血小板聚集通常存在于血涂片的两侧、尾部、海岸线处，普通的阅片方式最多只能发现82%的血小板聚集[15]。迈瑞公司最新的血细胞分析流水线会将触发规则的标本加测PLT-O，报告解聚后的PLT计数；同时将“聚集血小板报警”或“低值PLT”复检规则传送至阅片机时，阅片时将开启“PLT-pro”模式，此模式下阅片机将快速扫描、拍摄、记录血涂片体尾交接处、两侧、片尾、海岸线处的血小板聚集，并将血小板聚集的图片归类、计数（图7）。这种阅片模式在不漏检血小板聚集的情况下快速确认标本中是否真实存在血小板聚集，操作者结合阅片结果和PLT-O纠正后的结果，即可准确报告血小板聚集标本的PLT计数。
图7MC-80阅片机的PLT-pro快速扫描模式识别血小板聚集
全血项目联合检测的多场景及其最佳流水线配置
随着临床日益增加的需求和全血特定蛋白技术的发展，全血“一管通”应运而生。特定蛋白免疫比浊法与血细胞分析仪双平台创新融合为单平台，开启了一张条码、一管血、一次检测同时完成血细胞和炎症标志物检测的新时代。为临床判断感染类型和病情严重度提供了巨大帮助[16]，显著提高了患者特别是儿童家长的体验度和满意度。受此启发，全血联合检测项目的种类和检测设备配置上得以发展，联合检测的项目越来越多，更匹配临床应用场景的联检设备可选择性也在增加。
◤血常规联合检测的全血项目血清淀粉样蛋白A（SAA）是继CRP与血细胞分析联合监测的另一个灵敏度更高的炎症反应蛋白，提高了临床对细菌、病毒感染的鉴别能力，成为病情判断和疗效监测的有效依据[17-18]。同时，糖化血红蛋白检测仪通过轨道连到血液分析流水线，一管血多用途，减少患者采血量践行医者仁心的使命。
◤“全血一管通”血液分析流水线目前，血细胞分析流水线的功能已从血液分析仪、推染片、阅片模块拓展至特定蛋白、糖化血红蛋白、血沉等分析模块，通过装卸载台、前处理系统、后处理系统、中间缓存模块、浓缩稀释液系统、自动推片染色机、自动形态学分析仪等提示效率或优化流程模块，展现出前所未有的EDTA抗凝血整合检测能力和高度自动化程度。各功能模块的简要介绍见表1。
在不同的临床使用场景和需求的推动下，近年来又出现一些创新性的解决方案，具体表现在：
01为空间狭小的实验室量身定制去装卸台、扩大功能模块本身的进出样台的紧凑型血液分析流水线；
02目前单模块血细胞分析仪最高速度可达200测试/h，一套流水线最多可连接5个分析模块，线上可高达1000测试/H，显著提升实验室检测效率，并大幅降低整条流水线的人力付出和质控、维护、保养等成本，适用于应对大型实验室大样本量检测需求；
04在样本量大同时需兼顾末梢血标本的实验室如妇幼保健机构、儿童医院或儿科门诊等，一些产品创新性地将末梢血全自动批量检测功能整合到血液分析流水线中，这样静脉血、末梢血可以在同一套流水线上进行批量、自动化的检测和质量控制。
全自动细胞形态学分析新技术
按照最新《GB/T22576.2-2021,医学实验室质量和能力的要求》[20]，血细胞分析日复检数量在100份以下和100份-200份时，分别至少配备2名和3-4名检验人员，这对实验室是巨大的压力。全自动细胞形态学分析仪通过血片细胞定位、细胞图像捕捉和图像分析软件对细胞预分类，并将自动化的数字图像显示在计算机屏幕上。全自动细胞形态学分析仪如一股清风，一改细胞形态学检测费时、费力、主观性强、结果差异大的缺点，以操作简便、客观、标准，全流程信息化、低误差、图像储存方便、培训和教学有据可依，减少人力投入和视觉疲劳等优势获得肯定。自20世纪60年代起，国内外企业先后涉足自动形态学分析领域，特别是近些年，借助数字成像和信息技术的快速发展，形态学全自动分析进入了数字时代。但随着应用的扩展，更深层次的临床使用痛点也逐渐显现：
01采集的细胞图像与显微镜下观察的细胞形态存在一定差异，人工复核时难以对拍摄的图片与显微镜下真实所见图片自信、自如转换；
02部分特殊细胞及特殊患者的血涂片识别率不高，人工镜检复核比例仍然较大；
03大样本量医院，形态学复检比例高，难以满足TAT30分钟出报告的需求等等[21,22]。现以迈瑞公司MC-80阅片机为例介绍其突破瓶颈的创新技术。
◤全自动细胞形态学分析新技术一高清拍摄。人工显微镜镜检时，工作人员通过反复调节焦距，多层面看清细胞的所有细节，在脑中还原细胞立体结构，完成对细胞的准确判断。然而目前细胞形态学分析仪多采用定焦于单层一个平面拍摄，在定焦平面上的单层获得清晰照片的同时，细胞的其余部分则被虚化，而失去了对立体结构细胞的完整特征和细节的准确还原。因而导致仪器拍摄的图像与镜下真实形态的差距，也降低了对异常细胞的识别率。最新的自动拍摄技术突破性地采用模拟手动调焦技术，在移动焦距的过程中拍摄多张细胞图片，并运用深度学习算法将每张细胞中最清晰的部分拟合在一起，再结合多景深融合技术，获得一张集每一个细胞所有细节特征为一体的照片，精准还原了病理特征和镜下真实观感，从根本上克服了形态学自动化检测的症结（图8）。
图8MC-80阅片机的高清拍摄原理示意图
◤全自动细胞形态学分析新技术三根据血液分析仪检测结果自动调整阅片规则。血细胞分析流水线上的全自动细胞形态学分析仪通过信息互联可根据血细胞分析的参数信息、报警信息、复检规则调整阅片模式，增加扫描数量或者扫描区域（例如血小板聚集时增加血涂片两侧和尾部扫描）防止漏检；通过综合血液分析仪的参数、报警和计数类复检信息以及阅片机拍摄的镜下形态学信息多维度验证，设定审核规则，协助操作人员进行多维度的报告审核。
血细胞分析流水线从自动化走向信息化
目前的血细胞分析流水线已实现了不同程度的自动化，一管血全自动完成血细胞检测、自动推片染色、自动形态学复检，特定蛋白、糖化血红蛋白、血沉等检测。部分实验室结合信息系统，将患者病史信息、临床资料、历史检测信息加入血液分析流水线的自动审核、自动复检和危急值报警等规则中，实现了全流程数据融通，其中图片信息的整合是技术难点。本节重点介绍基于血细胞形态学泛在连接的信息化技术的实现和应用。
目前全自动细胞形态分析仪只能做到细胞预分类，最终审核依然离不开技术人员，同样血细胞分析流水线，最终报告也需要检验工作者审核。在健康中国建设和检验结果广泛互认的大背景下，院区与院区之间、不同科室以及不同医院之间血细胞分析和形态学的标准化、均质化成为检验医学面临的重要课题。下文以迈瑞公司“云阅片”和“云智学”两大系统介绍细胞形态学的信息化服务技术（图9）。云阅片是将疑难形态学图片和血液分析检测数据脱敏后及时上传至医院服务器云端（服务器所有权和使用权均为医院方），科室和专家均可以实现移动终端实时审核，形态学报告的审核不再受限于地理位置和电脑终端，确保疑难形态病例得到及时的专业会诊，进一步减少疑难病例漏诊。急诊值班、分院审核，都能在信息化连接下，实现专业会诊，均质化地实现形态学高质量审核。
工作中遇到的具有典型特征的细胞形态或有教学意义的特殊样本，工作人员通过一键点击，将其存入云智学案例素材库，生成完整案例，丰富培训和考核资源。云智学软件还支持多种格式的培训课件导入，便于取用，还能设置不同难度等级的培训和考试题目，满足不同层次人员培训需求。云智学软件还提供手机端学习和形态学资料查询，也可通过手机端或医院电脑端进行多种题型甚至类似显微镜下的细胞分类形态学考试。学习记录和考试记录可视化呈现，规范化统计，满足实验室管理要求，实现现代化人才培养。
图9细胞形态学的远程审核与智能教学（云阅片与云智学）
血细胞分析技术的未来展望
在临床诊疗对血液检查更准、更快、更便捷、满足不同使用场景等需求的推动和国家医院高质量、均质化发展、控费降本和自主知识产权等政策的引导下，伴随科学技术的发展尤其是电子科技、激光光源和生物化学技术等进步的背景下，生命医学领域检测设备迎来了发展良机。基于现状及行业发展态势，对血细胞分析技术的未来做如下展望。
除了多参数化、大数据智能诊断外，能联合更多项目的一体机成为未来血细胞分析仪主流产品的前景可观；融入控费降本、质量管理的新技术措施在血细胞分析系统的应用，也将助力门急诊临检、基层医疗机构均质化发展中显示出优势。更加智慧、便捷、小型化，满足不同临床和国家管理需求的新型、高科技赋能的血细胞分析技术未来可期。
【参考文献】
[1]陈卫.库尔特原理诞生与发展的历程——纪念库尔特原理发明50周年[J].中国粉体工业,2009,2:1-7.
[2]中国医师协会检验医师分会儿科疾病检验医学专家委员会,世界华人检验与病理医师协会.中国末梢采血操作共识[J].中华医学杂志,2018,98(22):1752-1760.
[3]王笔金,王琳.自动血液细胞分析仪血小板计数的干扰因素初析[J].现代检验医学杂志,2002,17(4):59-59.
[4]LardinoisB,FavresseJ,ChatelainB,etal.Pseudothrombocytopenia-AReviewonCauses,OccurrenceandClinicalImplications[J].JClinMed,2021,10(4):594.PMID:33557431PMCID:PMC7915523DOI:10.3390/jcm10040594.
[5]鲁家才,陈玉华,黄振.仪器计数血小板方法学进展[J].国际检验医学杂志,2006,27(10):899-900.
[6]HanahKim,MinaHur,Gun-HyukLee,etal.PerformanceofPlateletCountinginThrombocytopenicSamples:ComparisonbetweenMindrayBC-6800PlusandSysmexXN-9000[J].Diagnostics,2021,12(1):68-77.DOI:10.3390/jcm10040594.
[7]孙毅,向代军,叶波,等.新一代血细胞分析技术SF-Cube2.0在临床样本检测中的运用[J].检验医学与临床,2018,15(23):3576-3578.
[8]DengJ,ChenY,ZhangS,etal.MindraySF-Cubetechnology:AneffectivewayforcorrectingplateletcountinindividualswithEDTAdependentpseudothrombocytopenia[J].ClinicaChimicaActa,2020,502:99-101.DOI:10.1016/j.cca.2019.12.012.
[9]BaoY,WangJ,WangA,etal.CorrectionofspuriouslowplateletcountsbyopticalfluorescenceplateletcountingofBC-6800hematologyanalyzerinEDTA-dependentpseudothrombocytopeniapatients[J].TranslCancerRes,2020,9(1):166-172.DOI:10.21037/tcr.2019.12.58.
[10]HeZ,ShuG,LuH.ApplicationofSF-Cube2.0TechnologyinPlateletCountinPatientswithEDTA-DependentPseudothrombocytopenia[J].ClinicalLaboratory,2021,67(6):1377-1380.DOI:10.7754/Clin.Lab.2020.201021.
[11]YoneyamaA,NakaharaK.EDTA-dependentpseudothrombocytopenia-differentiationfromtruethrombocytopenia[J].NipponRinsho,2003,61(4):569-574.
[12]常菁华,王剑飚.EDTA依赖性假性血小板减少的实验室解决思路[J].检验医学,2014,29(7):733-737.
[13]WilliamsTL,ArcherJ.EffectofprewarmingEDTAbloodsamplesto37℃onplateletcountmeasuredbySysmexXT‐2000iVindogs,cats,andhorses[J].VeterinaryClinicalPathology,2016,45(3):444-449.DOI:10.1111/vcp.12378.
[14]GulatiGL,AmyA,ChenC.UsingaVortextoDisaggregatePlateletClumps[J].LabMed,1997,10:665-667.DOI:10.1093/LABMED/28.10.665.
[15]GulatiG,UppalG,FloreaAD,etal.DetectionofPlateletClumpsonPeripheralBloodSmearsbyCellaVisionDM96SystemandMicroscopicReview[J].LaboratoryMedicine,2014,45(4):368-371.DOI:10.1309/LM604RQVKVLRFXOR.
[16]吴薇.CRP血常规联合检验在儿科中的应用价值[J].中外医学研究,2010,8(26):72-72.
[17]中国中西医结合学会检验医学专业委员会.血清淀粉样蛋白A在感染性疾病中临床应用的专家共识[J].中华检验医学杂志,2019,42(3):186-192.
[18]中国妇幼保健协会临床诊断与实验医学分会.SAA单独和与CRP联合检测在儿童感染性疾病中的应用专家共识[J].检验医学,2021,36(7):685-690.
[19]赵云霞.血沉测定及临床应用[J].中华医学写作杂志,2001,8(5):607-608.
[20]国内-国家标准-国家市场监督管理总局.医学实验室质量和能力的要求第2部分:临床血液学检验领域的要求[S].GB/T22576.2-2021.
[21]曾素根,毛志刚,朱新勤,等.DI-60型全自动数字化细胞形态识别分析系统的临床应用[J].检验医学,2018,33(1):63-66.
[22]黄骥斌,曾婷婷,郭曼英,等.CellaVisionDM96自动化数字图像分析系统进行白细胞分类的临床应用[J].检验医学,2012,27(4):299-303.
[23]徐荣良,刘林,许铁,等.血常规参数对骨折术后深静脉血栓形成的预测价值[J].中华实验外科杂志,2020,37(2):363-365.
[24]张建国,李治锋.血细胞参数RPR和MPV对下肢深静脉血栓形成的预测价值分析[J].实验与检验医学,2016,34(5):561-563.