当核糖体被募集到mRNA的5’端时翻译开始。eIF4E结合蛋白（如4EBP1）通过与eIF4E结合阻断翻译。4EBP1过度磷酸化进而影响eIF4E与4EBP1结合活性，从而促进翻译。GSPT1与eRF1相互作用形成翻译终止复合物的一部分迫使蛋白质在终止密码子进入核糖体的A位点时解离。
02
HTRF技术原理
HTRF总GSPT1测定可定量细胞裂解物中GSPT1的表达水平。总GSPT1检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体偶联。两种抗体都对蛋白质上的不同表位具有高度特异性。在细胞提取物中存在GSPT1的情况下使供体荧光团与受体接近从而产生FRET信号。其强度与样品中存在的蛋白质浓度成正比，提供了一种免洗技术评估蛋白质表达的方法。
03
检测验证
使用分子胶对HAP-1细胞进行总GSPT1检测。三种分子胶CC-885、CC-90009及SJ6986作用HAP-1WT细胞中GSPT1剂量依赖性降低，而HAP-1CereblonKO细胞中GSPT1水平没有显著调节。此外，Α-微管蛋白表达水平保持不变。与文献一致，结果表明，CC-885、CC-90009及SJ6986诱导的GSPT1降解依赖于Cereblon蛋白。
注：1、CereblonKO细胞即Cereblonknocked-outcelllines。
2、CC-885、CC-90009及SJ6986为已知可降解GSPT1蛋白分子胶。
使用分子胶对人NSCLC细胞进行HTRF总GSPT1调节NCI-H358。MRT-235分子胶在4小时和24小时后诱导GSPT1蛋白的剂量依赖性降低，DC50分别为153nM和93nM。此外，环氧霉素阻止了MRT-2359诱导的GSPT1降解，清楚地表明泛素蛋白酶体系统参与MRT-2359介导的GSPT1降解。
注：DC50是50%的目标蛋白质被降解对应于降解剂的浓度。
HTRF与WesternBlot比较。HTRF总GSPT1检测的灵敏度是WB的256倍。
靶点
HTRF（货号）
AlphaLISA（货号）
GSPT1
64GSPT1TPEG
-
IKZF1(IKAROS)
64IKZF1TPEG
ALSU-TIKARO-A500
IKZF3(AIOLOS)
64IKZF3TPEG
ALSU-TAIOL-A500
FulllengthAR
64ARFLPEG
AndrogenReceptor-V7
64ARV7PEG
AndrogenReceptor
64ANDRPEG
ALSU-TANDR-A500
EstrogenReceptor-alpha
64ERAPEG
ALSU-TERA-A500
ProgesteroneReceptor
64HPRTPEG
NRF2
64NRF2TPEG
ALSU-TNRF2-A500
在正在研究的抗癌治疗策略中，靶向蛋白质降解有望克服传统小分子的一些局限性。到目前为止，PROTAC分子已被开发用于诱导SMARCA蛋白的选择性降解。然而，SMARCA2和SMARCA4在蛋白质水平上有约75%的同一性，因此化合物可能靶向这两种蛋白。因此，靶向SMARCA2或SMARCA4化合物的选择性研究至关重要。
用两种SMARCA4PROTAC降解剂进行细胞处理，SMARCA4蛋白呈现剂量依赖性降低，而ARV-471对照条件下SMARCA4的表达水平以及ATP水平保持稳定。结果表明，PROTAC诱导了SMARCA2降解。（Farnabay，W.etal.NatChemBiol.2019和Xiao，L.etal.Nature2022）。如下图。
HTRF与WesternBlot比较。HTRF总SMARCA4检测的灵敏度是WB的4倍。
SMARCA2
64SMARC2TPEG
SMARCA4
64SMARC4TPEG
ALSU-TBRG1-A500
CREBBP
64CREBBPTPEG
ALSU-TCRBP-A500
p300
64P300TPEG
ALSU-TP300-A500
HDAC5
64HDAC5TPEG
ALSU-THDAC5-A500
BRD2
64BRD2TPEG
ALSU-TBRD2-A500
BRD3
64BRD3TPEG
ALSU-TBRD3-A500
BRD4
64BRD4TPEG
ALSU-TBRD4-A500
BRD7
64BRD7TPEG
ALSU-TBRD7-A500
BRD9
64BRD9TPEG
ALSU-TBRD9-A500
CDKfamily
1/2/4/5161819/12
PLK1
64ULKPEG
ALSU-TPLK1-A500
ULK1
64ULKTPEG
ALSU-TULK1-A500
Wee1
64WEE1TPEG
ALSU-TWEE-A500
PINK1
64PINKTPEG
ALSU-TPINK-A500
SYK
64SYKTPEG
ALSU-TSYK-B500
CyclinE1
64CYCE1TPEG
ALSU-TCYCE1-A500
KRAS
ALSU-TKRAS-A500
RAS
ALSU-TRAS-A500
GAPDH
64GAPDHPEG
ALSU-TGAPD-B500
Alpha-Tubulin
64ATUBPEG
ATP是细胞活力的标志，因为它存在于所有代谢活性的细胞中，因此，ATP的数量与培养中活细胞的数量成正比。如果细胞数量因增殖而增加，那么ATP的数量就会增加；如果细胞数量因细胞死亡而减少，则ATP的数量就会减少。
裂解细胞中释放的ATP在氧气的存在下与荧光素底物、荧光素酶和镁反应产生光，反应原理如下所示。然后使用酶标仪luminescence模块对发射的光进行量化，由此测量的发光信号与样品中ATP的数量成正比。
ATPlite
6016943
ATPlite1step（一步法）
6016736
ATPlite3D
6066943
ATPlite1step3D（一步法）
6066736
国内外品牌众多：优爱蛋白，Revvity，ThermoFisher，BioGenes，Astrea，AusGeneX，Carna，Genovis等。