本发明属于纳米生物医学技术领域，具体而言，涉及一种介导光疗的新型分级靶向纳米粒及其制备方法和应用，尤其涉及一种以聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体的新型分级靶向纳米粒及其制备方法和治疗黑素瘤的应用。
背景技术：
技术实现要素：
鉴于肿瘤微环境乏氧导致光动力治疗中的主要毒性物质ros产量低、半衰期短、扩散距离有限，本发明的目的在于提供一种以聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体的新型分级靶向纳米粒及其制备方法和治疗黑素瘤的应用，从而解决了ala-pdt对黑色素瘤等侵袭性肿瘤疗效不佳的问题。
基于发明人前期的研究积累和设想，本发明人将ha的主动靶向作用和tpp的线粒体靶向作用结合起来，将5-ala的光敏作用与cat的产氧作用结合起来，构建具有分级靶向抗肿瘤作用的新型纳米粒htacnp，并将htacnp暴露于mv3黑素瘤细胞和mv3荷瘤小鼠，在体外研究该纳米递释系统的抗肿瘤作用。结果显示，htacnp能够主动靶向mv3细胞，在ha外壳被分解后，能够进一步靶向肿瘤细胞内线粒体，并在激光照射下，htacnp能够生成大量ros，发挥强效的pdt作用，有效杀伤mv3黑素瘤细胞。
具体地，本发明的第一个目的是这样实现的：一种介导光疗的新型分级靶向纳米粒，该靶向纳米粒呈核-壳-壳的球形结构，采用w/o/w双乳化法制备而成，5-ala和cat作为水相分布于纳米粒内部，tpp和plga作为油相构成纳米粒内壳，最外层则包被有ha作为外壳，其中ha为透明质酸，plga为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，tpp为三苯基膦，ala为5-氨基乙酰丙酸，cat为过氧化氢酶。
本发明的第二个目的是提供上述介导光疗的新型分级靶向纳米粒的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)称取ala、cat溶于0.7-2.0％聚乙烯醇溶液中，得到内水相；
(2)称取plga溶于有机溶剂中，得到油相；
(3)在超声波作用下，将步骤(1)制备的内水相溶液逐滴加入步骤(2)制备的油相中，得到初乳；
(4)将ha加入1-4％聚乙烯醇溶液中，搅拌至完全溶解，加入2.5-10mg/mltpp的dmso溶液，随后逐滴加入步骤(3)制备的初乳，在超声波作用下得到复乳；
(5)将步骤(4)得到的复乳在室温、避光条件下，200-400r/min搅拌8-16h，去除多余的有机溶剂，收集得到的澄清溶液，使用高速冷冻离心机4℃、15000rpm离心4-6min收集上清，4℃、10000rpm离心18-25min，收集沉淀，双蒸水洗涤2-5次，去除游离药物及杂质，得到靶向纳米粒。
进一步优选地，如上所述介导光疗的新型分级靶向纳米粒的制备方法，其中的ala、cat、tpp、plga、ha的用量分别为：
再进一步优选地，如上所述介导光疗的新型分级靶向纳米粒的制备方法，其中的ala、cat、tpp、plga、ha的用量分别为：
在本发明最优选的实施例中，如上所述介导光疗的新型分级靶向纳米粒的制备方法，其中的ala、cat、tpp、plga、ha的用量分别为：
另外，如上所述介导光疗的新型分级靶向纳米粒的制备方法，其中：步骤(2)所述的plga为plga50:50；步骤(2)所述的有机溶剂选自如下的一种：二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮；步骤(3)所述的超声波参数为：160-200w超声1.5-2.5min；步骤(4)所述的超声波参数为：160-200w超声3-5min。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和显著进步性：
(1)成功构建新型核-壳-型分级靶向纳米粒htacnp，平均水合粒径为211.27nm，zeta电位为-14.3mv，稳定性良好，呈球形，分散性良好，5-ala和cat的包封率分别为28.4％和16.4％，tpp和ha含量分别为41.20μg/ml和59.19μg/ml。
(2)共定位结果表明，htacnp能够主动靶向mv3细胞。在ha外壳被分解后，能够进一步靶向肿瘤细胞内线粒体。
(3)htacnp具有良好的产氧能力，通过cat能与线粒体内h2o2反应生成大量o2。
(4)流式细胞计数法和tunel法结果显示在激光照射下，htacnp能够生成大量ros，发挥强效的pdt作用，有效杀伤mv3黑素瘤细胞。
(5)动物实验结果显示经尾静脉注射的htacnp，能够进入肿瘤组织，并利用组织内h2o2产生氧气，改善肿瘤微环境乏氧，下调hif-1α的表达。在激光照射下，htacnp能发挥强效的pdt作用，能够有效抑制恶性黑素瘤生长。
(6)mtt结果显示在避光条件下，htacnp对mv3细胞没有明显的细胞毒性，生物安全性良好。动物病理检测结果表明htacnp+laser治疗对小鼠未显示出明显的系统毒副作用，生物安全性良好。
附图说明
图1为htacnp纳米粒和合成和结构示意图。
图2为htacnp的tem照片(a、b代表不同放大倍数)。
图3为htacnp的水合粒径(a)、zeta电位(b)。
图4为标准曲线及回归方程，其中：(a)ala标准品，(b)cat标准品，(c)ha标准品，(d)tpp标准品。
图5为溶氧仪研究htacnp催化h2o2产生氧气的能力。
图6为mtt法研究不同浓度htacnp的暗毒性。
图7为倒置荧光显微镜(a-b)和流式细胞仪(c-d)检测mv3细胞对htacnp的靶向摄入(ns：无统计学意义；***：p<0.001)。
图8为激光扫描共聚焦显微镜(a-b)和透射电镜(b)研究mv3细胞对htacnp纳米粒的摄入和线粒体共定位研究。
图9为倒置荧光显微镜检测htacnp在肿瘤细胞内的产氧能力(a)和平均荧光强度分析(b)(**：p<0.01；***：p<0.001)。
图10为式细胞仪研究htacnp介导的pdt产生ros的能力(***：p<0.001)。
图11为流式细胞仪(a-b)和tunel法(c-d)研究htacnp介导的pdt作用(***：p<0.01)。
图12为mtt法研究htacnp介导的pdt作用(***：p<0.001)。
图13为免疫荧光法(a-b)研究htacnp进入肿瘤组织后调节hif-1α的含量。
图14为荷瘤小鼠模型研究htacnp介导的pdt作用对黑素瘤的治疗效果(a：治疗结束后肿瘤组织图；b：治疗结束后肿瘤组织重量分析；c：肿瘤生长曲线；d-e：tunel法分析肿瘤组织凋亡；f：h&e染色分析肿瘤组织凋亡和/或坏死)。
图15为htacnp对小鼠主要脏器的组织病理学检测切片图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、材料
1.1细胞株：人皮肤黑素瘤细胞mv3购自中科院上海细胞库。
1.2实验动物：balb/c-nu雌性裸鼠，4～6周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。裸鼠饲养于徐州医科大学spf级屏障系统中。饲料和饮水由动物房经灭菌处理后供动物自由饮食。
1.3试剂
plga(50:50,10kd)西安瑞禧生物科技有限公司
pva(30～70kd)美国sigma-aldrich公司
二、方法
2.1ha-tpp-plga-ala-cat纳米粒(htacnp)的制备
采用w/o/w改良双乳化法制备ha-tpp-plga-ala-cat纳米粒(htacnp)，首先精密称取2mgala、1mgcat溶于200μl1％pva溶液中，制备内水相。称取15mgplga溶于2mldcm中，制备油相。随后将200μl内水相溶液逐滴加入2ml油相中，于超声细胞破碎仪，180w超声2min，得到初乳。将10ml2％pva溶液置于磁力搅拌器上，加入1mgha，搅拌至完全溶解，加入76μl含tpp(5mg/ml)的dmso溶液，随后逐滴加入制备好的初乳，180w超声4min，得到复乳，转移至50ml茄形瓶中。室温、避光条件下，300r/min搅拌过夜，去除多余的dcm。次日收集得到的澄清溶液，使用高速冷冻离心机4℃，15000r离心5min收集上清，4℃、10000r离心20min，收集沉淀，双蒸水洗涤3次，去除游离药物及杂质，最后加入1mlpbs重悬，得到htacnp纳米粒原液，4℃保存。
按照上述步骤，制备ha-plga-ala-cat(hacnp)、tpp-plga-ala-cat(tacnp)、香豆素6-ha-tpp-plga-cat(f-htcnp)纳米粒，除在制备过程中不投入tpp、ha、或在dmso中加入1mg/ml香豆素6外，其余步骤相同。
2.2htacnp纳米粒的表征
2.2.1透射电镜(tem)观察htacnp纳米粒的粒径和形貌
吸取htacnp纳米粒原液10μl，适当稀释后滴加至铜网上，吸附10min后，用滤纸小心吸去多余溶液，随后滴加少量醋酸双氧铀染色1min，室温下晾干后，于透射电子显微镜下观察纳米粒形貌，并通过nanomeasurer1.2软件测量其粒径，取平均值。
2.2.2malvern粒度分析仪测定htacnp纳米粒的水合粒径，zeta电位及稳定性
取100μlhtacnp纳米粒原液，加入900μl双蒸水稀释，采用malvern激光粒度仪检测htacnp的水合粒径和zeta电位。每个样检测三次，取平均值。
取200μlhtacnp纳米粒原液分别加入1800μl双蒸水、pbs缓冲液(ph＝7.4)、dmem培养基、dmem+10％fbs培养基中，在第0、1、2、3、7、13、18天，分别用malvern粒度分析仪检测并记录htacnp的水合粒径，并绘制稳定性曲线。
2.2.3htacnp纳米粒ala包封率的测定
(1)ala-乙酰丙酮荧光衍生荧光分光光度计法制备标准曲线
称取ala12.5mg，于50ml量瓶中，加0.01mol/lpbs(ph＝7.4)溶液溶解，定容50ml，得到250μg/ml的ala-pbs储备液。精密吸取0.2，0.4，1.0，1.4，2.0，4.0mlala储备液，分别加pbs溶解，定容至25ml，得到浓度(c)为1.0，2.0，5.0，7.0，10.0，20.0μg/ml的ala-pbs标准液。乙酰丙酮试剂的配制：乙酰丙酮：无水乙醇：蒸馏水＝3:2:15(v:v:v)；10％甲醛溶液的配制：37％甲醛：蒸馏水＝10:27(v:v)；
采用ala-乙酰丙酮荧光衍生荧光分光光度计法测算溶液中ala的含量。取3.5ml乙酰丙酮试剂，0.45ml10％甲醛溶液，50μl待测的ala-pbs标准液，于4mlep管混匀，避光条件下，100℃水浴加热10min，冰浴5min，随后取1ml于比色皿中，荧光分光光度计ex＝378nm，em＝466nm，狭缝宽度＝4，测定荧光强度a1。以荧光强度度a1对浓度c1进行线性回归处理，得回归方程并绘制标准曲线。
(2)ala包封率(ee1)测定
收集纯化htacnp过程中的上清液，取50μl，按上述ala标曲测定步骤测定样品荧光强度，带入回归方程，计算上清液中游离ala的浓度，最后乘以上清液总体积，得到游离ala质量。
ala包封率(ee1)＝(投药量1-游离ala质量)/投药量1*100％。
2.2.4htacnp纳米粒cat包封率的测定：
(1)bca蛋白浓度法制备标准曲线
蛋白标准品的配制：取0.8ml蛋白标准配制液加入至20mgbsa中，充分溶解，得到25mg/ml的蛋白标准溶液。加入适量pbs,稀释至0.5mg/ml即蛋白标准品。
bca工作液的配制：bca试剂a：bca试剂b＝50:1(v:v),将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加pbs补足到20μl，浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。每孔加入200μlbca工作液，37℃静置20min。用酶标仪测定并记录波长为562nm时，各孔的吸光度a2。以吸光度a2对浓度c2进行线性回归处理，得回归方程并绘制标准曲线。
(2)cat包封率(ee2)测定
收集纯化htacnp过程中的上清液，取20μl，按上述步骤测定样品吸光度，带入回归方程，计算上清液中游离cat的浓度，最后乘以上清液总体积，得到游离cat质量。
cat包封率(ee2)＝(投药量2-游离cat质量)/投药量2*100％。
2.2.5电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测定tpp含量：
按照前述方法制备3份htacnp纳米粒，离心洗涤后分别加入去双蒸水定容至3ml，样品送北京中科百测科技有限公司，应用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测定tpp的含量。
2.2.6ha-elisa试剂盒测定ha含量
按前述方法制备htacnp纳米粒。按ha-elisa试剂盒说明书配制标准品(标准品浓度：50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.56ng/ml、0ng/ml)、洗涤液、生物素化抗体工作液、sabc工作液。
(1)加样：所需板孔用洗涤液洗板2次，甩干。设标准孔、空白孔、待测样品孔，每孔3个复孔。每孔按需加入标准品或待测样品50μl，立即加入生物素标记的抗体工作液50μl/孔，轻轻晃动混匀。酶标板覆膜，37℃孵育45min。
(2)弃去孔内液体，甩干、洗板3次，每孔350μl洗液，每次浸泡1min。
(3)每孔加sabc工作液100μl，覆膜，37℃孵育30min。
(4)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。
(5)每孔加底物溶液(tmb)90μl，覆膜，37℃避光孵育15min。
(6)每孔加终止液50μl，终止反应。
(7)立即用酶标仪在450nm波长检测并记录各孔od值，绘制ha标准曲线，计算ha含量。
2.2.7htacnp纳米粒中cat产氧能力测定
2.3htacnp纳米粒的体外抗肿瘤作用研究
2.3.1细胞培养、传代和细胞计数
2.3.1.1细胞培养
mv3细胞常规培养于含1％青霉素-链霉素溶液、10％fbs的高糖dmem培养液中，37℃，5％co2饱和湿度细胞培养箱中培养。
2.3.1.2细胞传代
从培养箱中取出mv3细胞，倒置显微镜下观察mv3细胞的形态和生长密度，贴壁细胞生长至90％融合时，去除培养基，加入灭菌pbs1ml漂洗细胞2次，去除死细胞和残余培养基，加入1ml0.25％胰蛋白酶消化细胞，3min后迅速吸去胰酶，加入1ml完全培养液终止消化。移液枪轻轻吹打培养皿底部，至所有细胞脱落，继续吹打使细胞分散，按1:2比率，接种到新的培养皿中，加入适量的培养液，于37℃、5％co2饱和湿度细胞培养箱培养。
2.3.1.3细胞计数
细胞培养至饱和密度，常规漂洗、消化细胞，收集细胞悬液，1500r离心3min，弃上清，加入2ml完全培养基，吹打混匀，移液枪吸取10μl细胞悬液，加入10μl台盼蓝染色，从计数板a面滴入，避免产生气泡，全自动细胞计数仪计数。
2.3.2mtt法检测htacnp纳米粒对mv3细胞的细胞毒性
(1)铺板：取处对数生长期的mv3细胞，常规漂洗、消化并计数，配置成5×104/ml的单细胞悬液，将细胞接种于96孔板，每孔100μl，外围孔加pbs封边，37℃培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。
(2)加药：吸出旧的培养基，分别加入含不同浓度htacnp(0、0.5、1、2、4、8、16μg/ml)的完全培养基，并设对照组，每组设5个复孔，37℃培养24h。
(3)每孔加入mtt溶液10μl，于37℃培养箱中孵育4h。
(4)每孔加入formazan溶解液100μl，孵育4h
(5)测定：用酶标仪测定570nm波长处每孔的吸光度，记录实验结果。
2.3.3倒置荧光显微镜、流式细胞计数检测mv3细胞对htacnp纳米粒的摄入
2.3.3.1倒置荧光显微镜检测mv3细胞对htacnp纳米粒的摄入
(1)铺板：6孔板中预先加入灭菌24*24mm盖玻片，取生长状态良好的mv3细胞常规漂洗、消化并计数，以5×104个/孔的细胞密度接种于6孔板，每孔2ml，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。
(2)分组：(a)htacnp；(b)tacnp；(c)tacnp+freeha；(d)htacnp+anti-cd44,每组3个复孔，c组用1mg/mlha，d组用200μg/mlanti-cd44封闭4h，(3)加药：按照分组分别加入含tacnp或htacnp纳米粒的完全培养基(16μg/ml)，每组设3个复孔，放入37℃培养箱中避光培养4h。
(4)固定：弃去培养基，pbs洗涤三次，每孔加入1ml4％多聚甲醛覆盖细胞，37℃固定15min，使用pbs振荡洗涤三次。
(5)染核：每孔加入500uldapi溶液覆盖细胞表面，室温避光静置3min，pbs避光洗涤三次。
(6)封片：取出盖玻片，每片加入20μl防淬灭封片液封片，置于载玻片上，防止荧光淬灭。
(7)观察：使用倒置荧光显微镜进行观察拍照(激发波长:488nm，发射波长:530nm)。
2.3.3.1流式细胞仪检测mv3细胞对htacnp纳米粒的摄入
(1)铺板：取生长状态良好的mv3细胞常规漂洗、消化并计数，以1×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，每孔2ml，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。
(2)分组、预处理及加药同上。
(3)常规漂洗、消化，收集细胞悬液，1000r离心5min
(4)弃上清，加入适量pbs洗涤细胞再次离心，重复三次。
(5)加入适量pbs悬浮细胞，使用流式细胞仪进行检测,激发波长(ex):488nm，发射波长(ex):530nm。
2.3.4激光扫描共聚焦显微镜检测mv3细胞对f-htcnp纳米粒的摄入和线粒体共定位
(1)按前述方法制备香豆素-6标记的、不含ala的纳米粒f-htcnp。
(2)铺板：取mv3细胞常规漂洗、消化并计数，以1×104个/孔的细胞密度接种于共聚焦显微镜专用细胞培养皿，每孔1.5ml，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。
(3)加药：次日弃去旧培养基，加入含2μg/mlf-htcnp纳米粒的完全培养基，每组设3个复孔，放入细胞培养箱中培养4h。弃去培养基，加入pbs洗涤三次，除去游离的纳米粒，加入新鲜培养基，培养4h。
(4)染色：弃去培养基，加入pbs洗涤三次，加入含mito-trackerredcmxros的dmem培养基，37℃避光孵育20min，或加入1ml含lysotrackerred的(60nm)dmem培养基，37℃避光孵育60min，弃去培养基，加入pbs振荡洗涤三次。
(5)观察：使用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照(mito-trackerredcmxros染色液:ex:579nm,em:599nm；lysotrackerred：ex：579nm，em：599nm；香豆素-6：ex:466nm，em:504nm)。
2.3.5htacnp纳米粒在mv3细胞内产氧能力检测
(1)细胞爬片：取mv3细胞常规漂洗、消化并计数，以1×105个/孔的细胞密度接种于含盖玻片的6孔板，每孔2ml，37℃培养箱过夜使细胞贴壁。
(2)预染：向细胞中加入含5μm[ru(dpp)3]cl2的完全培养基预处理4h。
(3)加药：去除培养基，pbs振荡洗涤3次，分别加入含pbs,htanp,hacnp和htacnp纳米粒的完全培养基(16μg/ml)，每组设3个复孔，放入37℃培养箱避光培养4h。
(4)固定：弃去培养基，pbs振荡洗涤三次，每孔加入1ml4％多聚甲醛覆盖细胞，37℃固定15min，使用pbs振荡洗涤三次。
(5)染核：每孔加入500μldapi溶液覆盖细胞表面，室温避光静置3min，pbs避光振荡洗涤三次。
(7)观察：使用倒置荧光显微镜进行观察拍照，并使用imagej软件对[ru(dpp)3]cl2的荧光强度进行定量分析。
2.3.6流式细胞计数检测mv3细胞内ros产生量
(1)铺板：取生长状态良好的mv3细胞，常规漂洗、消化并计数，以1×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，每孔2ml，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。
(2)加药：去除培养基，pbs振荡洗涤3次，分别加入含pbs,ala,htanp,hacnp和htacnp纳米粒的完全培养基(16μg/ml)，每组设3个复孔，放入37℃培养箱避光培养4h。
(3)照光：去除孔内培养基，每孔pbs洗涤3次，去除游离药物及死细胞。照射组每孔加入1ml无酚红培养基，光动力治疗仪635nm激光照射30min(8mw；光斑覆盖孔板)；
(4)加入10μmdcfh-da染料，轻轻混匀，37℃避光孵育30min。
(5)pbs轻柔漂洗细胞1次，收集上清，用不含edta的胰酶消化细胞2min,随后加入等量培养基终止消化，收集细胞悬液，1000r，离心3min，弃去上清，每管加入1mlpbs悬浮细胞，再次离心，弃上清后，每管加入500μlbindingbuffer悬浮细胞。
2.3.7研究htacnp纳米粒在体内介导的pdt作用
2.3.7.1tdt-mediateddutpnick-endlabeling(tunel)检测细胞凋亡封闭液配制：3％h2o2+甲醇(v:v＝1:9)；
通透液配制：0.1％triton+0.1％枸橼酸钠(v:v＝1:1000)；
tunel染色液配制：50μlvital①+450μlvital②。
(1)铺板：6孔板中预先加入灭菌24*24mm盖玻片，取生长状态良好的mv3细胞，常规漂洗、消化并计数，以1.5×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，每孔2ml，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。
(2)分组：a：ctr；b:htacnp；c:ala+laser；d:htanp+laser；e:hacnp+laser；f:htacnp+laser。
(3)加药：按预定分组分别加入等量含相应药物的完全培养基，每组设3个复孔，37℃孵育4h。
(4)照光：去除孔内培养基，每孔pbs洗涤3次，去除游离药物及死细胞。每孔加入1ml无酚红培养基，光动力治疗仪635nm激光照射30min(8mw；光斑覆盖所有孔板)，37℃继续避光孵育24h；
(5)弃去孔内液体，每孔加入1ml4％多聚甲醛，37℃固定1h。pbs振荡洗涤3次，每次1min。
(6)每孔加入封闭液1ml，室温封闭5min。pbs振荡洗涤3次。
(7)每孔加入通透液1ml，室温通透10min。pbs振荡洗涤3次。
(8)每孔滴加tunel染色液50μl，置于湿盒中，37℃孵育1h。pbs避光洗涤3次。
(9)染核：每孔加入500μldapi溶液覆盖细胞表面，室温避光静置3min，pbs避光洗涤3次。
(10)封片：取出盖玻片，每片加入20μl防淬灭封片液封片，置于载玻片上，防止荧光淬灭。
(11)镜检拍照：切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。
2.3.7.2流式细胞术检测细胞凋亡
(2)分组、加药、照光步骤同上。
(3)收集孔内液体，pbs轻柔漂洗细胞1次，收集上清，用不含edta的胰酶消化细胞2min,随后加入等量培养基终止消化，收集细胞悬液，1000r，离心3min，弃去上清，每管加入1mlpbs悬浮细胞，再次离心，弃上清后，每管加入500μlbindingbuffer悬浮细胞，5μlannexinv-fitc，5μlpropidiumiodide(pi)染料，涡旋混匀，静置5min，30min内上机检测。
2.3.8mtt检测htacnp介导的增强pdt对mv3细胞的细胞毒性
(2)分组、加药、照光步骤同上，每组设5个复孔。
2.4htacnp纳米粒的体内抗肿瘤作用研究
实验中所用动物均按照《实验动物护理原则》和《实验动物护理和使用指南》护理和使用实验动物。所有动物实验均按照徐州医科大学实验动物伦理委员会批准的方案进行。
2.4.1建立mv3荷瘤鼠模型
将处于对数生长期的mv3细胞，常规消化、离心后收集，pbs漂洗3次，加入适量pbs稀释，调整细胞浓度为5×107/ml，取100μl皮下接种于4-6周大小的balb/c裸鼠右后肢，于徐州医科大学实验动物屏障系统饲养2周，mv3荷瘤裸鼠模型建立。
2.4.2免疫荧光检测htacnp纳米粒在体内改善乏氧能力
(1)分组：待肿瘤长至200～250cm3后将小鼠随机分成4组，分别为ctr、htanp、hacnp和htacnp组,每组3只。
(2)给药：按照分组分别注射200μl生理盐水、htanp、hacnp或htacnp(1mg/ml)。
(3)取材和固定：注射药物24h后处死小鼠，剥离肿瘤组织，浸泡于10％甲醛固定液中固定48h。
(4)洗涤、脱水：将固定后的组织用流水冲洗，去除残留的固定液和杂质。50％、70％、85％、95％、无水乙醇，每级2h，逐级脱水。
(5)透明：将组织块置入污水乙醇和二甲苯的等体积混合液中2h，随后置入二甲苯两小时，
重复两次。
(6)浸蜡、包埋：将组织块放在熔化的石蜡和二甲苯的等体积混合液浸泡1h，先后移入2个熔化的石蜡液中，每个浸泡3h，用预温的镊子夹取已浸蜡的组织块放入熔蜡盒中，冷却凝固成块。
(7)切片：蜡块在-20度冰箱冷冻30min，固定蜡块于切片机上，调整切片机上的切片厚度为5μm，然后切片。
(8)烤片、脱蜡：将玻片置于65℃恒温烘箱中烘烤30min；于二甲苯i中浸泡15min，二甲苯ii中浸泡15min脱蜡。
(9)抗原修复：将玻片置于0.01m柠檬酸钠缓冲溶液中高压修复15min，自然冷却后，0.02mpbs洗3min×3次。
(10)一抗孵育：滴加hif-1α抗体(稀释比例1:50)，湿盒孵育，4℃孵育过夜。0.02mpbs冲洗3min×3次。
(11)二抗孵育：滴加适当比例稀释的荧光二抗，湿盒孵育，室温下放置1h。0.02mpbs冲洗3min×3次。
(12)封片、拍照、图片分析：防淬灭封片剂与dapi1:500稀释封片，-20℃冰箱保存，倒置荧光显微镜拍片，imagej软件分析荧光强度。
2.4.3研究htacnp纳米粒在体内介导的pdt作用
(1)实验分组：(i)ctrl；(ii)htanp+laser；(iii)hacnp+laser；(iv)htacnp+laser。待肿瘤长至约100mm3后将裸鼠随机分成4组，每组5只。
(2)给药：分别于第0天，第2天，第4天经尾静脉注射200μl生理盐水，htanp，hacnp或htacnp溶液(1mg/ml)，注射药物4h后，应用光动力治疗仪按照分组对肿瘤部位进行照射处理，100mw/cm2，30min。
(3)测量并记录小鼠体重和肿瘤体积：每两日称量小鼠体重和测量肿瘤体积，自初次给药日起连续观测16天。体积v(mm3)＝(d2×d)/2。(d:肿瘤短径；d:肿瘤长径，单位：mm)。治疗期间，如荷瘤小鼠肿瘤体积大于2000mm3或出现严重并发症，则按照动物伦理委员会要求予以安乐死。
(4)血生化检测：治疗及观测结束后，经小鼠眼球取血，立即置于生化管中，4000r,离心5min。样品送徐州医科大学附属医院检验科进行血生化检测，检测指标：谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、总胆红素(tbil)、尿素氮(bun)、肌酐(crea)、尿酸(ua)。
2.4.4组织病理学检测
(1)取材和固定：眼球取血结束后处死小鼠，解剖取出主要脏器(脑、心、肺、肝、脾、肾)及肿瘤组织，浸泡于10％的甲醛固定液中固定48h。
(2)石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡步骤同上。
(3)水化：将脱蜡后的切片经100％酒精、95％酒精、85％酒精、75％酒精各浸泡5min，自来水冲洗10min。
(4)苏木素染色：将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5min，氨水中分色数秒。流水冲洗15min，入70％和90％酒精中脱水各10min。
(5)伊红染色：入酒精伊红染色液染色2min，染色后的切片经无水乙醇脱水。
(6)透明和封片：将玻片置于二甲苯中透明3min×2次，中性树胶封片，放入65℃烘箱15min。
(7)拍照：正置显微镜观察拍照。
2.4.5tunel染色检测肿瘤组织凋亡
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min,二甲苯ⅱ15min,无水乙醇ⅰ5min,无水乙醇ⅱ5min,85％酒精5min,75％酒精5min,蒸馏水洗。
(2)修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加蛋白酶k工作液覆盖组织，37℃温箱孵育25min。将玻片置于pbs中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(3)破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于pbs中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
(4)滴加适量tunel染色液至圈内覆盖组织，切片平置于湿盒内，37℃恒温箱孵育2h。
(5)dapi复染细胞核：切片用pbs洗涤3次，每次5min。随后在圈内滴加dapi染液，避光室温孵育10min。
(6)封片：玻片置于pbs中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
(7)镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。
三、结果
1htacnp纳米粒的制备
如图1所示，我们采用w/o/w改良双乳化法成功制备具有核-壳-壳结构的纳米粒htacnp。5-ala和cat作为水相分布于纳米粒内部，tpp和plga作为油相构成纳米粒内壳，最外层则包被有ha作为外壳。
2htacnp纳米粒的鉴定和表征
2.1tem观察htacnp的形貌特征
使用tem观察了htacnp纳米粒的形态和大小，如图2a-b所示，合成的htacnp纳米粒呈明显的核-壳-壳球形结构，分散性良好，大小较均匀。
2.2htacnp的水合粒径，zeta电位及稳定性
dls结果显示htacnp纳米粒的平均水合粒径为211.27nm，pdi为0.023，较窄的粒径分布及较小的pdi表明合成的纳米粒的粒径分布较为均一，单分散性好(图3a)，平均zeta电位为-18.4mv(图3b)。
2.3htacnp的药物含量测定
2.3.1ala-乙酰丙酮荧光衍生法测定ala包封率
采用ala-乙酰丙酮荧光衍生法测定ala的含量。如图4a所示，ala标准曲线：a1＝13.55c1+15.071，r2＝0.9991，ala在0～21μg/ml的浓度范围内线性关系良好。根据标曲方程计算上清中游离药物含量，按照包封率计算公式ee1＝(投药量1-游离ala质量)/投药量1*100％，得到ala包封率为28.4％。
2.3.2bca蛋白浓度法测定cat含量
采用bca蛋白浓度法测定cat的含量。如图4b所示，cat标准曲线:a2＝0.817c2+0.1364,r2＝0.9991,cat在0.0～0.5mg/ml浓度范围内线性关系良好。根据标曲方程计算上清中游离药物含量，按照包封率计算公式ee2＝(投药量2-游离cat质量)/投药量2*100％，得到cat包封率为16.4％。
2.3.3icp-oes测定tpp含量：
如图4c所示，tpp标准曲线:a3＝0.0014c3-0.0379,r2＝0.9999，tpp在0.0～10.0μg/ml浓度范围内线性关系良好。根据标曲方程测得htacnp纳米粒中tpp含量为41.20
μg/ml。
2.3.4ha-elisa试剂盒测定ha含量
2.4htacnp催化h2o2产氧能力检测
h2o2分解产生的氧气能够溶解于水溶液中，因此可以通过检测水溶液中溶解氧含量的变化的生成来判断htacnp纳米粒的产氧能力。如图5所示，pbs或htanps组未见溶解氧水平的明显变化，说明htanps不能催化h2o2并产生氧气。hacnps组和htacnps组溶解氧浓度较pbs或htanps组明显升高，表明hacnp与htacnp均能快速、大量生成o2，差异有统计学意义(p<0.01)。结果表明，cat被成功地包裹在htacnps纳米颗粒中，且具有良好的酶催化活性。
3体外实验测定htacnp对人黑素瘤细胞mv3的杀伤作用
3.1mtt法检测htacnp对mv3细胞的细胞毒性
纳米材料的生物安全性是开发过程中需要考虑的重要问题之一。我们应用mtt细胞毒性检测试剂盒检测了避光条件下htacnp对mv3细胞的细胞毒性。如图6所示，在0～32μg/ml浓度范围内，htacnps处理24h后，mv3细胞存活率仍在95％以上，表明我们构建的htacnp对mv3细胞没有明显的细胞毒性，具有良好的生物安全性。
3.2mv3细胞对htacnp的靶向摄入作用研究
5-ala在细胞内生成的pphix在适当激发光源照射下可以发出明亮的绿色荧光，因此我们使用倒置荧光显微镜和流式细胞计数来研究mv3细胞对htacnp的靶向摄入作用。如图7a-b所示，htacnp处理mv3细胞4h后，细胞内可以见到明显的绿色荧光且荧光强度明显高于tacnps组和tacnps+freeha组。然而，当我们用cd44抗体提前封闭mv3细胞上的cd44受体后，纳米粒表面的ha无法与mv3细胞表面的cd44受体结合，细胞内绿色荧光强度明显降低，差异有统计学意义，流式细胞计数的结果进一步证实了这一点(图7a-d)。这表明，具有ha涂层的htacnp有良好的特异性靶向能力，能够与mv3细胞表面的cd44受体特异性结合，促使细胞摄入大量htacnp，显著提高5-ala的转运效率。
3.3mv3细胞对htacnp纳米粒的摄入和线粒体共定位研究
由于pphix的发射波长范围较宽(ex＝407nm,em＝635nm)易对clsm检测的结果产生干扰，因此将一种绿色荧光染料香豆素-6(ex＝466nm,em＝504nm)包埋在纳米颗粒中合成f-htcnps，来模拟htacnps在细胞中的定位，以避免pphix荧光对纳米粒细胞内定位检测的干扰。mv3细胞与f-htcnps孵育4小时后，用mito-trackerredcmxros染料标记线粒体，用lyso-trackerred染料标记溶酶体。clsm图片显示，f-htcnps(绿色)与mito-trackerredcmxros(红色)区域高度重叠，呈现出明亮的黄色荧光，表明大多数f-htcnps与mv3细胞内线粒体共定位(图8b)。而仅有少部分f-htcnps(绿色)与lysotrackerred(红色)区域重叠，表明仅有少量纳米粒进入溶酶体(图8a)。这一结果表明，f-htcnps可以通过cd44介导的内吞作用进入细胞质，随后在tpp的引导下主要进入细胞内线粒体。
此外，我们利用透射电镜观察了细胞摄取htacnp4小时后线粒体的形态结构。如图8c所示，在htacnp组中，在线粒体内部可以观察到粒径100nm左右的纳米粒，这证实了htacnp可以特异性定位于mv3细胞的线粒体内。值得注意的是，ctrl组线粒体大小正常，形态结构完整。但htacnp组的线粒体体积明显增大，形态结构发生改变，我们推测这与htacnp与h2o2在线粒体内反应产生大量o2有关。
3.4htacnp纳米粒在mv3细胞内产氧能力检测
[ru(dpp)3]cl2是一种溶解氧检测指示剂，其荧光可被氧分子猝灭，导致荧光强度降低。如图9a-b示，ctrl组和htanp组内细胞均呈现明显的红色荧光，而hacnp组和htacnp组的荧光强度较低，说明hacnp可以催化h2o2在细胞内产生氧气。值得注意的是，htacnp组的荧光强度低于hacnp组，差异有统计学意义(p<0.01)。这是由于htacnp能够进入细胞内产生h2o2的主要部位线粒体，从而产生更多的氧气，导致[ru(dpp)3]cl2的荧光明显淬灭。
3.5htacnp纳米粒介导的pdt产生ros能力检测
htacnp催化h2o2产生的大量氧气，为ros的生成提供了足够的底物。我们以dcfh-da作为ros的检测探针，采用流式细胞计数来研究htacnp纳米粒介导的pdt产生ros的能力。如图10a-b所示，与ala+laser相比，htanp+laser组、hacnp+laser组和htacnp+laser组的细胞内dcfh-da荧光强度较高，其中htacnp+laser组的荧光强度最高，这是由于5-ala、cat和tpp三者发挥了协同作用，使得htacnp介导的pdt能够产生的ros量最高。
3.6htacnp纳米粒介导的pdt促mv3细胞凋亡作用检测
我们分别采用流式细胞计数和tunel染色法研究了htacnp介导的pdt作用。流式细胞计数的结果如图11a-b所示，ctrl和htacnp组未发现明显的mv3细胞凋亡；经过635nm光照射后，ala+laser组、htanp+laser组、hacnps+laser组和htacnps+laser组的细胞凋亡率分别为19.79％、26.12％、39.51％和96.60％。tunel染色的结果显示了相似的趋势，ala+laser组、htanp+laser组、hacnp+laser组、htacnps+laser组阳性面积分别为21.0％、35.18％、42.73％、95.64％，ctrl组和htacnp组未发现明显的细胞凋亡，阳性面积极低，低于2％(图11c-d)。
3.7htacnp纳米粒介导的pdt对mv3细胞的抗肿瘤作用检测
我们采用mtt法来评估htacnp介导的pdt的抗肿瘤作用。如图11所示，ctrl组和htacnp组无明显的细胞死亡，细胞存活率在95％以上，说明我们合成的htacnp具有良好的生物安全性。ala+laser组、htanp+laser组、hacnp+laser组、htacnp+laser组的细胞存活率分别为78.91±2.55％、63.42±1.12％、41.64±2.21％、6.05±1.85％。其中htacnp+laser组的细胞存活率最低，这是由于我们构建的htacnps可以有效缓解肿瘤微环境乏氧，更高效地传递5-ala，同时增强ros的杀伤效果，从而使pdt得以发挥出强大的抗肿瘤作用。
4体内实验测定纳米粒对mv3荷瘤小鼠的抗肿瘤作用
4.1htacnp纳米粒改善荷瘤小鼠肿瘤微环境乏氧能力检测
hif-1α的含量受到肿瘤组织中氧浓度的调节，通过检测肿瘤组织中hif-1α的水平可以反应肿瘤微环境的缺氧情况，免疫荧光染色结果显示：ctrl组和htanp组的hif-1α的表达水平较高，定量分析iod值分别为0.82和0.78，二者之间差异无统计学意义(p>0.05)。而hacnp组iod值为0.69，htacnp组iod值为0.62，同ctrl组和htanp组相比，hif-1α表达降低，特别是htacnps组最低(图13)。这些结果表明htacnp可以有效进入肿瘤组织，并进一步进入肿瘤细胞线粒体，催化线粒体内充沛的h2o2产生足够的氧气以改善肿瘤微环境缺氧，这与我们的体外实验得到结果一致。
4.2htacnp纳米粒介导的pdt体内抗肿瘤作用研究
随后，我们采用tunel法和h&e染色进一步评估htacnp介导的pdt在体内诱导细胞凋亡和/或坏死的能力。如图14d-e所示，ctrl组的肿瘤组织tunel染色呈阴性；htanp+laser组和hacnp+laser组阳性面积较ctrl组有所增大，但仍有大量肿瘤细胞残留，残留的大量肿瘤细胞能够继续生长发育，从而导致疗效不佳，肿瘤复发。htacnp+laser组阳性面积较其余三组明显增大，差异有统计学意义(p>0.001)。这一结果证实了htacnp介导pdt能够在体内诱导大量肿瘤细胞凋亡和/或坏死的突出能力。此外，肿瘤组织的h&e染色结果也显示了同样的结论(图14f)。这些结果证实了htacnp可以特异性靶向肿瘤细胞以提高5-ala的转运效率，并进一步进入肿瘤细胞线粒体，缓解tme缺氧，增强激光照射后ros的损伤效果，从而增强pdt的抗肿瘤作用。
4.3htacnp纳米粒介导的pdt的生物安全性评价
htacnp纳米粒介导的pdt疗法的生物安全性是其能否进行临床转化的一个重要问题。对治疗及观测期间小鼠体重变化以及治疗结束后血生化水平和主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的组织病理学进行研究。实验结果显示，治疗过程中所有治疗组中小鼠的体重未出现明显下降。同ctrl组相比，在htacnp+laser治疗16天后，小鼠心、肝、脾、肺、肾的病理切片中没有显示出明显的病理学变化(图15)。这些结果表明htacnp-pdt疗法无明显的系统毒性，具有良好的生物安全性和潜在的临床转化价值。
四、讨论
本研究设计了一种分级靶向载药纳米粒(htacnp)，采用plga作为载体，负载5-ala和cat，修饰以线粒体靶向基团tpp并在最外层包裹ha，从而增强pdt的抗肿瘤作用。为了证明htacnp在特异性靶向肿瘤细胞、缓解tme缺氧和增强pdt抗肿瘤作用方面的重要作用，我们合成了不含ha的纳米颗粒(tacnp)、不含cat的纳米颗粒(htanp)和不含tpp的纳米颗(hacnp)在相应实验中作为对比。
具有ha涂层的htacnp纳米粒具有良好的特异性靶向能力，如图7a-d所示，细胞荧光和流式细胞计数证实htacnp能够与mv3细胞表面的cd44受体特异性结合，促使细胞摄入大量htacnp纳米粒，显著提高5-ala的转运效率。此外，htacnp组的明亮荧光表明，纳米颗粒中的5-ala可以成功转化为强效光敏剂pphix。
在635nm激光照射30分钟后，htacnp介导的pdt与其他三组相比，能够产生更多的ros(图10a-b)，且由于线粒体对ros具有高度的敏感性，htacnp-pdt所致的细胞凋亡和/或坏死数量远高于htanp+laser组和hacnp+laser组(图11a-d，图12)。在动物实验中，htacnp-pdt也表现出了强大的抗肿瘤作用(图14a-f)。此外，体内和体外实验均表明，我们合成的htacnp具有良好的生物安全性(图15)。这些证据表明应用hcinp介导的pdt治疗是一种安全有效的抗肿瘤策略。