这是在μ-SlideChemotaxis细胞趋化载玻片中进行3D趋化性实验后，对嵌入Matrigel?中的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）进行免疫荧光染色的详细实验方案。在Matrigel?中，趋化性细胞向10％FCS迁移之后，通过免疫细胞化学染色研究了定向细胞迁移的形态学特征。
01、实验材料准备
μ-SlideChemotaxis
02、实验步骤
将HUVEC接种在50％Matrigel?中，并填充至μ-SlideChemotaxis中，然后将其沿10％FCS梯度迁移24小时。采用免疫染色法观察内皮细胞在Matrigel?中定向迁移后的形态学特征。HUVEC的染色是直接在μ-Slide细胞趋化载玻片中进行的。在染色方案的所有步骤中，将60μl的相应溶液分别添加到两个大储液池中。在孵育过程中，所有塞子均保持关闭状态，以免干扰通过观察通道的扩散。除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。
1)从一边储液池中取出塞子，然后吸出培养基。在抽吸和冲洗步骤中，将塞子留在中央通道中。
2)用1xPBS洗涤→3x10分钟
3)用4％多聚甲醛固定细胞和基质蛋白→1x40分钟
4)用1xPBS洗涤→2x10分钟
5)用0.2％TritonX-100/PBS透化细胞→1x20分钟
6)用1xPBS洗涤→6x10分钟
7)用1%BSA/PBS阻断非特异性抗原→过夜
8)用1xPBS洗涤→6x10分钟
9)添加一抗：单克隆抗VE钙黏着蛋白，小鼠（在1％BSA/PBS中为1：100）→在4°C下1x24小时
10)用1xPBS洗涤→6x10分钟
11)添加二抗：山羊抗小鼠IgG（H+L），AlexaFluor680（在1％BSA/PBS中为1:50）→在4°C过夜
12)用1xPBS洗涤→6x10分钟
13)加入染色混合物→1x40分钟
i)罗丹明phalloidin染色肌动蛋白丝（PBS中1：400）
ii)Hoechst33342对细胞核染色（1：100，PBS中0.5μg/ml）
14)用1xPBS洗涤→6x10分钟
15)将最后的PBS留在储液罐中并开始成像。
免疫荧光图像由LeicaSP8SMD共聚焦激光扫描显微镜获得，配以63xHCPLAPO1.2NA水物镜。用405nm紫外激光激发Hoechst33342，594nmHeNe激光激发罗丹明-phalloidin，638nmHeNe激光激发AlexaFluor680。
03、实验结果
HUVEC在Matrigel?基质中的免疫染色显示，相邻的细胞组优先形成细胞簇并作为集合体迁移。少数细胞呈单细胞迁移。
图1：显示HUVEC在50%Matrigel?中的多细胞趋化性的细胞簇。固定后，对细胞进行细胞核（蓝色）、F-肌动蛋白（红色）和VE钙粘蛋白（青色）染色。白色箭头表示VE介导的细胞-细胞接触。
当细胞作为个体迁移时，细胞体被拉长，呈间充质梭形。细胞呈前后极性，前缘呈小片状，向梯度方向有突起。
当以多细胞单元组织时，细胞团簇表现出明显的前后不对称的群极化（图1）。在这里，一个或几个前导细胞参与了前缘的形成，前缘表现出细长的突起或宽的片层。迁移复合体较深区域的连续细胞没有极化。然而，这些细胞特征性地保留了VE钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触（图1）。