本发明涉及提高老年大鼠骨髓间充质干细胞移植后生存能力的方法。
(二)背景技术：
将mscs移植入缺血心脏的梗死区域会面临诸如钙超载、酸中毒、活性氧(ros)等严重状况，它们会激发凋亡信号传导并抑制干细胞的存活。可见，细胞凋亡是移植老年mscs低生存率的主要原因之一。事实上，mscs已被证实存在外源性和内源性两种凋亡途径，宿主缺血心肌细胞和植入的mscs之间的fas-fas配体(fasl)的相互作用是植入的mscs中死亡受体信号传导被激活的主要原因，通过抑制这种相互作用能够下调caspase-8、caspase-3等的表达、改善细胞存活情况以及促进心脏功能的恢复，因此，外源性fas凋亡通路是提高老年mscs移植治疗缺血性心肌病疗效潜在的作用靶点。
(三)技术实现要素：
本发明目的即是提供一种提高老年大鼠骨髓间充质干细胞移植后生存能力的方法，旨在提高其移植后在缺血心肌组织中的生存能力及治疗效果。
本发明采用的技术方案是：
所述病毒感染条件为：感染体系中加入8ug/ml的polybrene，感染所需moi(multiplicityofinfection，即感染一个细胞所需要的病毒颗粒数)为100。
所述faim过表达的慢病毒颗粒由上海吉凯基因化学技术有限公司购买所得。
具体的，所述体外培养在co2体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中、37℃条件下进行，饱和湿度，培养基为含10％胎牛血清的低糖dmem。
所述继代细胞优选为继代第3代细胞。
所述老年大鼠，是指18月龄以上的sd大鼠。
(四)附图说明
图2为faim改善mscs在h2o2应激条件下的生存率。图为cck-8法测得的mscs在h2o2应激下的生存率。vector-oldmscs代表空载体对照组，faim-0ldmscs代表faim过表达组。
图3为faim减轻由h2o2引起的细胞凋亡。a为hoechst染色代表性图片，凋亡细胞核特点为染色体边集、核固缩、核碎裂；b为hoechst染色凋亡细胞核比例统计结果；vector-oldmscs代表空载体对照组，faim-0ldmscs代表faim过表达组。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1.获取老年大鼠骨髓间充质干细胞。将18月龄的老年sd断颈处死，75％酒精消毒皮毛，取出双侧股骨和胫骨，剔除骨表面的软组织和骨垢端，放入装有低糖dmem培养基的离心管中。以下操作除离心外均在超净台进行。将骨组织倒入无菌玻璃培养皿中。眼科剪剪开股骨和胫骨两端少许，暴露骨髓腔。用5ml注射器抽取细胞培养液(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的低糖dmem)反复冲洗骨髓腔；收集冲洗液于50ml无菌离心管中。4℃，1000转/分钟，离心8分钟。丢弃上清液，用培养液重悬细胞。每只大鼠所获细胞接种于两个10cm培养皿，在37℃，含有5％co2，饱和湿度的恒温co2培养箱中培养。静置24小时后首次换液，以去除不贴壁细胞。之后每3-4天换液一次，长满80％～90％以上传代。
2.以含10％(v/v)胎牛血清低糖dmem培养基进行原代和传代细胞培养，放置于37℃、饱和湿度的含5％co2的混合气体(空气95％，v/v)中培养，根据骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，每4～5天更换细胞培养基，去除非贴壁细胞，不断纯化大鼠骨髓间充质干细胞。继代第3代时细胞可进行形态学、流式细胞学等细胞鉴定。
5.将正常氧浓度下培养的继代第3代大鼠骨髓间充质干细胞用来感染faim慢病毒颗粒(由上海吉凯基因化学技术有限公司购买所得),感染所需的moi(multiplicitiesofinfection，即感染一个细胞所需要的病毒颗粒数)为100，感染体系(含10％(v/v)胎牛血清低糖dmem培养基)中加入8μg/ml的polybrene。24h后更换为新鲜的正常培养液(含10％(v/v)胎牛血清低糖dmem培养基)。3日后加入5μg/ml的puromycin筛选7天。筛选结束后，获得的骨髓间充质干细胞用于移植。
6.免疫印迹法比较年轻和老年大鼠骨髓间充质干细胞中faim表达量差异：
按步骤1和2获取年轻(4周龄)和老年(18月龄)大鼠的骨髓间充质干细胞。将第3代年轻和老年大鼠的骨髓间充质干细胞移置于6孔板内，培养24小时后，用ripabuffer(购自中国碧云天生物技术有限公司)裂解后，14,000g离心30min，收集上清液冻存于-80℃备用。
bca法(购自美国thermofisher公司)测定蛋白浓度：40μg蛋白样品在12％(v/v)sds-page胶用hoefermini-gelsystem(amershambiosciences，购自美国piscataway公司)电泳分离，用hoefertransfertank(amershambiosciences，美国piscataway公司)将蛋白转移至pvdf膜(购自美国biorad公司)上，膜置于缓冲液[tris缓冲盐溶液，含0.1％(v/v)tween-20(tbs-t)，7％(w/v)牛奶，ph7.6]室温下封闭1h，加入相应一抗(1:1000，购自英国abcam公司)于4℃条件下孵育过夜；膜用0.5％(v/v)tbs-t洗涤后室温下与结合辣根过氧化物酶的抗兔igg抗体(购自美国promega公司)孵育1小时，最后tbs-t及tbs洗涤后用ecl溶液显色(购自美国merkmillipore公司)，在geldocezimagingsystem中成像，用imagelabsoftwarequantityone软件对条带进行定量分析，实验结果见图1。
结果显示和年轻大鼠mscs相比，老年大鼠mscsfaim表达量明显减少。
7.应用cck-8细胞活性检测试剂盒检测大鼠骨髓间充质干细胞的生存能力：
对步骤5处理的大鼠骨髓间充质干细胞收集的细胞(以感染vector的细胞作为对照)，移置于96孔板后，24h后将常规培养基更换为含0.5mm双氧水(h2o2)的低糖dmem培养基中，培养3小时后，弃掉培养基，每孔加入含10μlcck-8试剂的低糖dmem培养基110μl，继续培养2.5小时后，于微孔板酶标仪上检测450nm波长处的吸光度数值，并计算两组生存率，结果如图2所示。
结果表明以faim过表达的老年大鼠骨髓间充质干细胞在过氧化氢应激下的生存率显著提高。
8.hochest33258染色检测细胞核凋亡小体：
对步骤5处理的大鼠骨髓间充质干细胞收集的细胞(以感染vector的细胞作为对照)，移置于24孔板内，24h后将常规培养基更换为含0.5mm双氧水(h2o2)的低糖dmem培养基中，培养3小时后，弃掉培养基，加入0.5ml固定液，4℃固定过夜。pbs漂洗两遍，每次3分钟，加入hoechst33258(sigma)染色液孵育5分钟，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。细胞发生凋亡时可见团块状染色浓聚。比较两组细胞凋亡情况以及计算细胞凋亡率，结果如图3所示。
结果表明faim过表达的老年大鼠骨髓间充质干细胞在过氧化氢应激下的细胞凋亡明显减少。
结论：fiam过表达能明显增强老年大鼠骨髓间充质干细胞在体外过氧化氢应激条件下的生存能力，减少其凋亡，从而可进一步增强细胞移植的疗效。